Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Kontamination von genomischen DNA- und RNA-Proben, die aus Pflanzengewebe gewonnen wurden, für die quantitative Echtzeit-PCR zu verfolgen. Die Methode verwendet eine interne transkribierte Spacerregion ribosomaler Gene für einen zuverlässigen und sensitiven Nachweis von DNA-Kontaminationen in der Familie der Poaceae. Diese Methode kann dazu beitragen, die weit verbreitete Methode der quantitativen Real-Time-PCR mit umgekehrter Transkription zu verbessern.

Die Hauptvorteile sind die Verwendung von Multikopie-Genen, um die Empfindlichkeit für den Nachweis bei eukaryotischen und prokaryotischen Spezies zu verbessern, und es ist auch kostengünstig. Ribosomale Gene bestehen aus den beiden ITSs, nämlich ITS1 und ITS2, und den drei RNA-kodierenden Genen, 17-18S, 5.8S und 25-28S. Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von DNA-Kontamination in RNA-Proben der Poaceae-Spezies Aeluropus littoralis vor.

Im vorgestellten Protokoll wurden zwei komplementäre Strategien für das rDNA-basierte Primerdesign verwendet. Eine, speziesspezifische Primer, wurden aus ITS-Sequenzen ausgewählt, und zwei, universelle Primer, wurden aus Sequenzen ausgewählt, die die ITS flankieren. Zur Validierung der Anwendbarkeit von Primern sollte genomische DNA auch in den qRT-PCR-Workflow einbezogen werden, und zwar quer zur RNA-Isolierung und -Validierung.

Nach der Isolierung von DNA und RNA wird ein Guanidiniumthiocyanat-Agarose-Gel unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt, um die Menge, Reinheit und Integrität der aus dem Blattgewebe isolierten RNA zu überprüfen. Um das Gel herzustellen, kühlen Sie zuerst das Agar auf 60 Grad Celsius ab und mischen Sie dann fünf millimolare Guanidiniumthiocyanate mit normalem einmaligem TBE 1%-Agarosegel. Bereiten Sie dann den RNA-denaturierenden Ladepuffer vor.

Fügen Sie ein bis fünf Mikrogramm Gesamt-RNA und RNA-denaturierenden Ladepuffer hinzu. Erhitzen Sie dann die Mischprobe fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius und bewahren Sie sie auf Eis auf, bevor Sie das Gel aufladen. Laden Sie die Probe und lassen Sie das Gel 45 Minuten lang bei 100 Volt laufen.

Um zwei unterschiedliche RNA-Banden zu sehen, verwenden Sie ein Bildaufnahmesystem unter ultraviolettem Licht. Entfernen Sie Spuren genomischer DNA aus der RNA in einem RNase-freien Röhrchen, indem Sie eine Einheit DNASE1 und Magnesiumchlorid mit 10-fachem Reaktionspuffer zu 0,1 bis einem Mikrogramm Gesamt-RNA hinzufügen. Dann die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie einen Mikroliter 50-millimolares EDTA hinzufügen. Und dann inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Um Spuren von RNA aus genomischem DNA-Extrakt zu entfernen, fügen Sie fünf Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter RNnase A zur Gesamt-DNA hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Lagern Sie dann die RNA und DNA-Extrakte bei minus 80 Grad Celsius. Die Funktionalität der entworfenen Primer sollte durch qPCR unter Verwendung von gDNA als Template validiert werden. Bereiten Sie den PCR-Mastermix in einem auf Eis aufbewahrten Röhrchen vor, indem Sie alle Reagenzien mit Ausnahme des DNA-Templates mischen.

Aliquotieren Sie den Mastermix in einer optischen 96-Well-Platte. Geben Sie dann einen Mikroliter genomische DNA in jede Vertiefung und bedecken Sie die Platte mit optischer Plattenversiegelungsfolie. Schleudern Sie den Teller und bewahren Sie ihn in einem Thermocycler auf.

Stellen Sie ein Programm für 40 Zyklen ein und starten Sie den Echtzeit-Thermocycler. Führen Sie die Datenerfassung bei 60 Grad Celsius durch. Um die Spezifität des Primers zu bestätigen, analysieren Sie die Schmelzkurvendaten mit dem Ein-Schwellenwert-Zyklus und der Methode der Anpassung der subtrahierten Kurve

Ein scharfer einzelner Peak stellt ein einzelnes einheitliches Amplikon dar. Verwenden Sie ein 3%iges Agarose-Gel, um die Größe jedes Amplikons zu validieren. Mischen Sie fünf bis 10 Mikroliter PCR-Produkt mit sechsfachem Ladepuffer und laden Sie die Proben neben der DNA-Leiter auf das Agarosegel.

Führen Sie die Elektrophorese bei 100 Volt für 45 Minuten und einem einmaligen Tris-Bor-EDTA-Puffer durch. Hier ist das Schema der Amplifikationsplatte und des gDNA-Kontaminationsassays. Führen Sie alle Assays in mindestens drei Replikationen durch.

Überprüfen Sie die RNase mit mindestens einem universellen oder spezifischen rDNA-basierten Primer. Fügen Sie genomische Positivkontroll-DNA für jeden Primerpaar-Mastermix hinzu. Fügen Sie Nicht-Template-Steuerelemente für jeden Primer-Paar-Mastermix hinzu.

Bereiten Sie den PCR-Mastermix in einem auf Eis aufbewahrten Röhrchen vor, indem Sie alle Reagenzien mit Ausnahme des RNA-Templates mischen. Aliquotieren Sie den Mastermix in einer optischen 96-Well-Platte. Geben Sie dann einen Mikroliter RNA in jede Vertiefung und bedecken Sie die Platte mit optischer Plattenversiegelungsfolie.

Zentrifugieren Sie und bewahren Sie die Platte im Thermocycler auf. Stellen Sie ein 40-Takt-Programm ein und starten Sie den Echtzeit-Thermocycler. Analysieren Sie die Daten bei 60 Grad Celsius.

Validieren Sie alle Amplikons, indem Sie ein 3%iges Agarose-Gel ausführen. Tauen Sie die mit DNase- und cDNAase-Synthesereagenzien behandelte RNA bei Raumtemperatur auf. Nach dem Auftauen die Reagenzien drehen.

Fügen Sie dann in ein nukleasefreies Röhrchen ein Mikrogramm RNA und einen Mikroliter Oligo-Desoxythymidin-18-Primer, auch Oligo(dT) genannt, hinzu und stellen Sie das endgültige Volumen mit RNase-freiem Wasser auf 12 Mikroliter ein. Mischen Sie die Reagenzien vorsichtig und bewahren Sie sie auf Eis auf. Inkubieren Sie die Reaktion fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius, um die Sekundärstrukturen der RNA zu schmelzen.

Drehen Sie dann die Proben und stellen Sie das Fläschchen sofort auf Eis. Geben Sie cDNA-Synthesereagenzien in ein auf Eis gestelltes Röhrchen. Mischen Sie die Reagenzien vorsichtig.

Geben Sie dann 19 Mikroliter Mastermix in ein PCR-Röhrchen, das RNA enthält. Inkubieren Sie die Reaktion 60 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Und dann bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten, um die Aktivität der Reservetranskriptase zu stoppen.

Halten Sie dann die Röhren auf Eis. Führen Sie routinemäßige Genexpressionsanalysen aller PCR-Reaktionen durch, indem Sie die Schmelzkurven analysieren und die Amplikons auf 3 % Agarosegel validieren. Eine BLAST-Suche, die durchgeführt wurde, um das Sequenz-Alignment für die kleine Untereinheit 5.8S und die Primer der großen Untereinheit zu extrapolieren, zeigt ein Motiv, das auf der Sequenzhomologie von 2.000 grünen Pflanzenarten basiert.

Repräsentative Schmelzkurven, die einzelne scharfe Peaks für die internen transkribierten Spacer-One-flankierenden Amplikons in verschiedenen Poaceae-Spezies zeigen. Die X-Achse der Schmelzkurve bezeichnet die Temperatur und die Y-Achse bezieht sich auf die Differenz der Floreszenz. Die Spitzen in rosa Farbe stellen die Amplikons dar, und die rote Linie stellt die Steuerelemente ohne Vorlage in jedem der Diagramme dar.

Repräsentative Schmelzkurven, die das Vorhandensein von scharfen Peaks ohne Primer-Dimere für intern transkribierte Spacer-zwei flankierende Amplikons in verschiedenen Poaceae-Spezies zeigen. Die X-Achse der Schmelzkurve bezeichnet die Temperatur, und die Y-Achse bezieht sich auf die Differenz in der Floreszenz. Die Peaks in grüner Farbe stellen die Amplikons dar, und die orangefarbenen Peaks stellen die Steuerelemente ohne Vorlage in jedem der Diagramme dar.

Ein repräsentatives 3%-Agarose-Gel, das ribosomale DNA-basierte PCR-Produkte zeigt, die neben einer 100-BP-DNA-Leiter laufen. Die DNA-Banden in Panel A repräsentieren das Amplikon der internen transkribierten Spacer-One-Flankenregion. DNA-Banden in Panel B und C stellen Amplikons der internen transkribierten Spacer-2-Flankenregion dar.

Ein intern transkribierter Spacer - eine Region für verschiedene Spezies. Das Vorhandensein einer Biegung oder eines Peaks in RNA-Proben ist das Ergebnis einer gDNA-Kontamination, während das Auftreten einer Biegung oder eines Peaks in der NTC-Reaktion wahrscheinlich mit der Bildung von Primer-Dimeren zusammenhängt. Es wird empfohlen, alle RNA-Proben zunächst mit rDNA-basierten Primern zu testen, um sicherzustellen, dass kontaminierte Proben nicht für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Diese Methode hat den Weg für Forscher geebnet, mRNA mittels quantitativer Real-Time-PCR zu quantifizieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie genomische DNA-Kontaminationen mit der von uns vorgeschlagenen Methode nachgewiesen werden können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Guanidiniumthiocyanat und Ethidiumbromid äußerst gefährlich ist und Sie immer Schutzkleidung tragen und Schutzmaßnahmen ergreifen sollten.