Name: Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Erfahren Sie einen Hochdurchsatz-Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis in Makrophagen-Aggregaten. Diese kostengünstige Methode ermöglicht prädiktive Ergebnisse für die klinische Wirksamkeit.

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Wir danken Dr. Frank Wolschendorf für den Zugang zum automatisierten Speicherplatten-Reader Cytation 3. Diese Arbeit wurde teilweise durch den NIH-Zuschuss R01-AI104499 an OK finanziert. Teile der Arbeit wurden in den UAB CFAR-Einrichtungen und durch den UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core durchgeführt, die vom NIH/NIAID P30 AI027767 und vom NIH 5P30 AR048311 finanziert werden.

HINWEIS: M. tuberculosis mc 2 6206 ist ein avirulenten Stamm 17, 18, alle Arbeiten in diesem Protokoll kann in einem Biosafety Level 2 - Anlage (BSL-2) durchgeführt werden. 1. Kulturbedingungen für Green Fluorescent Protein exprimieren M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb -GFP) HINWEIS: Die M. tuberculosis H37Rv - auxotrophe Stamm mc 2 6206 abgeleitet (Δ panCD, Δ leuCD) , transformiert mit dem Plasmid gfp pMN437 exprimierenden 16 in diesem Protokoll verwendet wird. Es ist möglich , die Mtb -GFP Stamm mit nicht - GFP - exprimierenden Wildtyp - Stamm zu ersetzen für Forscher leichter Zugänglichkeit des Stammes zu ermöglichen. Allerdings ist die GFP - Expression wünschenswert visuelle Bestätigung der Phagozytose und die Bildung von Mtb / Makrophagen - Aggregate zu ermöglichen. Für long Zeitlagerung, Mtb -GFP wurden ergänzt mit 20% Glycerin bei -80 ° C in vollständiger 7H9 Medium (in Schritt 1.1 beschrieben) eingefroren. <ol><li> Bereiten vollständige Mtb -GFP Medien (7H9-C) durch Ergänzung 7H9 - Medium mit 10% OADC Middlebrook, 0,02% Tyloxapol, 24 ug / ml D-Pantothensäure, 50 ug / ml L-Leucin und 50 ug / ml Hygromycin B. </li><li> Ein Fläschchen mit Mtb -GFP auftauen und in einem 30 ml quadratischem Boden PETG Kolben auf 10 ml 7H9-C hinzufügen. </li><li> Bei 37 ° C auf einem Rotationsschüttler (50 rpm). Nehmen Sie Messungen der optischen Dichte (OD 600) alle paar Tage , bis die OD 600 erreicht 1,0 (ca. 5-8 Tage). </li><li> Verdünnen und Passage Kultur nach Bedarf eine OD 600 zwischen 0,2 bis 1,0 zu halten. </li><li> Zur Infektion eine etablierte Kultur der Mtb -GFP innerhalb der logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 von 0,6-1) verwenden. Um klumpig Kulturen zu vermeiden, beschallen die Mtb Kulturflasche in einem Wasserbad (130 W, 3 x 5 s Pulse) ONCe oder zweimal pro Woche </li></ol> 2. Kulturbedingungen für THP-1-Zellen <ol><li> Bereiten vollständige THP-1-Zellmedium (RPMI-C) von RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES ergänzt. </li><li> Inkubiere Zellen in einem T-75 - Kolben bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers oder Durchflusszytometrie jeden zweiten Tag und aufrechtzuerhalten THP-1-Zellen in einer Dichte zwischen 0,1 bis 0.600.000 pro mL. </li></ol> 3. Infektion Protokoll zum Generieren Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen <ol><li> THP-1 Zellpräparation (pro 96-well - Platte) <ol><li> Zentrifuge 7 x 10 6 THP-1 - Zellen bei 250 xg für 5 min. Resuspendieren in 7 ml RPMI-C. </li></ol></li><li> Mtb -GFP Vorbereitung <ol><li> Zentrifuge 2,8 x 10 8 Mtb -GFP bei 3.200 xg für 5 min in einem Schwenkbecherzentrifuge ueine Umwandlung von 1,0 OD 600 = 3 x 10 8 Bakterien / ml singen. </li><li> Wasche einmal mit RPMI-C und zentrifugiert wie in Schritt 3.2.1. </li><li> Resuspendieren in 7 ml RPMI-C und 10 s vortexen. </li></ol></li><li> Infektion HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für eine Vorlage. <ol><li> Vorbereiten eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Zugabe von 200 &amp; mgr; l sterilem Wasser in den Reihen A und H und Spalt 1 und 12 für eine Wasserverdampfung von Felgenkulturmedium zu verhindern. </li><li> Füge 200 &amp; mgr; l RPMI-C, bis Spalte 2 (B2 bis G2) für die Hintergrundkontrolle (Blank). </li><li> Mtb -GFP Suspension (Stufe 3.2) zu THP-1 - Zellsuspension (Schritt 3.1) und gut mischen durch Pipettieren zu infizieren, hinzuzufügen. Die endgültige THP-1 Zelldichte beträgt 5 x 10 5 pro ml , und die entsprechende Vielzahl der Infektion ist 40. </li><li> Gießen Sie die THP-1 / Mtb -GFP Suspension in einem 25 - ml - Reservoir. </li><li> In 200 ul THP-1 / Mtb -GFP Suspension auf die restlichen 96 Vertiefungen (B3 bis G11) usinga Mehrkanalpipette. HINWEIS: Wenn mit mehreren 96-Well - Platten arbeiten, resuspendieren regelmäßig die restlichen THP-1 / Mtb Suspension in dem Vorratsbehälter eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten , zu jeder Vertiefung zugegeben. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 7-10 Tage. </li><li> Änderungsmedien alle 2 Tage durch langsames Entfernen 100 ul verbrauchtes Medium von der Oberseite jeder Vertiefung und sanft Zugabe von 100 &amp; mgr; l vorgewärmtes RPMI-C einen Mehrkanal-Pipette. Resuspendieren Sie nicht Brunnen und stören die Mtb / Makrophagen - Aggregate auf dem Boden der Wells. </li><li> Sichtprüfung der Vertiefungen durch Fluoreszenzmikroskopie (4-10 x Objektiv) täglich, Kenntnis von der Größe von Mtb / Makrophagen - Aggregate nehmen. Am Tag 7-10, sollte Mtb / Makrophagen - Aggregate ausreichend groß sein (siehe 2 für die Bezugnahme auf Abbildung) für die Arzneimittelwirksamkeitsprüfung (Abschnitt 4) , um fortzufahren. </li><li> Falls gewünscht, können die Aufnahmen der 96-Mulden eine automatisierte Cell Imaging System ausgestattetmit Hellfeld und GFP - Filter setzt Mtb / Makrophagen - Aggregatbildung zu dokumentieren. HINWEIS: Wenn die Benutzer keinen Zugriff auf ein automatisiertes Imaging-System haben, Bilder von repräsentativen Brunnen mit GFP und Hellfeld-Funktionen unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Mikroskop aufgenommen werden. </li></ol></li></ol> 4. Growth Inhibition Assay zur Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mtb Beurteilen von Mtb / Makrophagen - Aggregates Abgeleitet <ol><li> Arzneimittelzubereitung (dreifacher Ausfertigung Bedingungen für zwei Medikamente) HINWEIS: Siehe Abbildung 1A für Vorlage. <ol><li> In einem separaten 96-Well-Platte, fügen Sie 125 ul 7H9-C Medien B2 bis zu G10. </li><li> Bereiten zwei Medikamente bei der doppelten höchsten gewünschte Endkonzentration in 1 ml 7H9-C für die Verdünnung zu berücksichtigen, in Schritt 4.2.4. </li><li> In 250 ul jeder Droge in die Vertiefungen B11-C11-D11 und E11-F11-G11, die jeweils für drei Exemplaren Behandlungen. </li><li> Verwendung einer Mehrkanalpipette, seriell dilute die Testmedikamente zweifach um 125 &amp; mgr; l von B11-G11 in B10-G10 bewegt. Mischen durch Pipettieren 5 mal bei jedem Schritt. </li><li> Weiter 125 &amp; mgr; l von einer Spalte zu bewegen (von rechts nach links) über die Platte, und nicht mehr, nachdem Spalte 4. </li><li> Nach dem Mischen Spalte 4, verwerfen 125 &amp; mgr; l in einen Abfallbehälter. Die Spalten 2 und 3 sollten keine Medikamente enthalten, die für die Verwendung als Hintergrund (Blank) und positive Wachstumskontrollen zu ermöglichen. Hinweis: Alternativ folgen Vorlage in 1B zum Testen Droge Bibliotheken. Jede 96-Well-Platte 58 Medikamente in einer einzigen Konzentration aufnehmen kann. Bereiten Sie dieses Medikament Platte doppelt um die gewünschte endgültige Konzentration verwendet wird, da es in der Mitte in Schritt 4.2.4 verdünnt werden. </li></ol></li><li> Medikamentöse Behandlung: <ol><li> Rufen Sie die 96-Well - Platte der Mtb - infizierten Makrophagen (Mtb / Makrophagen - Aggregate) enthält. </li><li> dekantieren sorgfältig alle relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) mit einer Mehrkanalpipette.Führen Sie diese in einem zweistufigen Weise: zunächst 150 ul entfernen, ohne die Platte kippen, und entfernen Sie dann verbleibenden Medien (~ 50 &amp; mgr; l) durch die Platte Kippen und die Pipettenspitze an den unteren Rand des Bohrlochs eingesetzt wird. Als Mtb / Makrophagen - Aggregate an der Unterseite des Schachts adhärenten sind, sollten kein Material verloren. </li><li> Fügen Sie vorsichtig 100 ul 7H9-C Medien auf alle relevanten Brunnen (B2 durch G11) der Platte die Mtb / Makrophagen - Aggregate enthält. </li><li> Verwendung einer Mehrkanalpipette, dann 100 &amp; mgr; l aus der Arzneimittel enthaltenden 96-Well-Platte (Schritt 4.1) in die entsprechenden Vertiefungen der Platte Infektion. </li><li> Platz in versiegelten Beutel und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Quantifizierung der Wirksamkeit von Medikamenten den Assay Resazurin Mikrotitter Verwendung <ol><li> Bereiten Resazurin Stammlösung in einer Endkonzentration von 0,8 mg / ml in H 2 O. Man filtriert durch 0,22 um Porengrße PVDF - Membran für Sterilisierung.</li><li> Bereiten Resazurin - Lösung von Resazurin Arbeitsstammlösung Mischen, H 2 O und Tween-80 (20% ige Lösung in H 2 O) in einem 2: 1: 1 - Verhältnis. Endkonzentrationen 0,4 mg / ml Resazurin und 5% Tween-80. </li><li> Unter Verwendung eines Plattenlesegerät, ein Setup-Programm, um die Fluoreszenz bei 530 nm Anregung und 590 nm Emission alle 30 min für 24 h bei 37 ° C gelesen. Vorwärmen Plattenleser auf 37 ° C. </li><li> Fügen Sie 20 &amp; mgr; l Resazurin Arbeitslösung zu allen relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) der arzneimittelbehandelten Platte (Schritt 4.11) eine Mehrkanal-Pipette. </li><li> Legen Sie die Platte auf dem Plattenleser und starten Sie das Programm einrichten in Schritt 5.3. ANMERKUNG: Um die Verarbeitung von großen Mengen von Assayplatten zu erleichtern, ist es ausreichend, den Test in einem 37 ° C Inkubator zu entwickeln und auszuführen einzelne Fluoreszenz all 24 h liest. Dies gilt auch für Benutzer, den Zugriff auf einen Plattenleser nicht mit kinetischen und Inkubation Fähigkeiten haben. </li></ol>

<ol><li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li>
<li>Bass, J. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li>
<li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li>
<li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMC207+becomes+bedaquiline%2C+a+new+anti-TB+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li>
<li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li>
<li>Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy%3A+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li>
<li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+back+to+the+future%3A+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).</li>
<li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis%2C+and+the+impact+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114(2014).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li>
<li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li>
<li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?</a> Front Microbiol. 6, 1117(2015).</li>
<li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li>
<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
<li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li>
<li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li>
<li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier haben wir im Detail eine alternative Mtb - Infektionsmodell geeignet für die Arzneimittelwirksamkeitstests beschrieben. Dieses Modell berücksichtigt zwei wichtige Faktoren , die eine stärkere Berücksichtigung in der frühen TB Arzneimittelentwicklung gegeben werden sollte: das Vorhandensein von physiologisch relevanten Hindernisse für Arzneimittelpenetration und metabolischen Veränderungen von Mtb während der Infektion. Während wir früher die Vorteile unserer Infektionsmodell gezeigt haben , und sc...

<html> Tuberkulose (TB) bleibt eine ernsthafte globale Bedrohung für die Gesundheit trotz der Verfügbarkeit von Anti-TB - Chemotherapien seit über 40 Jahren ein. Dies ist zum Teil auf die Forderung nach langen Behandlungszeiten von mehr als 6 Monaten mehrere Arzneimittelkombinationen, die die Nichteinhaltung 2 zu Patient führt. Die Entstehung von arzneimittelresistenten TB in den letzten Jahren hat weitere Probleme in einem Bereich verstärkt , in der erfolgreiche Entwicklung klinisch zugelassenen Medikamente 3 praktisch nicht existent ist. Denn trotz erschöpfende Anti-TB - Medikamentenentwicklung, nur ein einziges Medikament für die klinische Anwendung FDA gewesen 4 in den letzten 40 Jahren zugelassen. So werden neue Generationen von Anti-TB-Medikamente sind dringend erforderlich, um dieses Problem zu lösen. Ein wesentliches Problem bei der TB Drug Discovery ist der Mangel an erfolgreichen Transfer von Verbindungen mit in - vitro - Aktivität zur Wirksamkeit in der klinischen Einstellung= &quot;Xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Zunächst wurden Zielbasierte Ansätze verwendet 5 für Anti- Mtb Drogen zu screenen, die in ganze Bakterienzellen zu übersetzen ist fehlgeschlagen. Selbst wenn Mtb - Zellen verwendet werden, wird es oft durchgeführt Brühe gewachsenen Kulturen verwendet, die nicht genau Arzneimittelwirksamkeit in vivo 8, 9 vorherzusagen. Diese Probleme wurden erkannt und Wirkstoff - Screening - Assays gegen Makrophagen enthalten , Mtb oder latent Mtb wurden erfolgreich etabliert 8, 10, 11, 12. Aber auch diese erweiterte Tests geben keine ausreichende Berücksichtigung der Durchdringung Barrieren, die Drogen in den nicht-gefäßLungenLäsionen auftreten, und in der Nekrosen an der Stelle der Infektion. Tatsächlich, Auch für die First-Line - TB - Medikamente Rifampicin, suboptimale Dosierung wurde 13, 14, 15 als auch in vivo Gewebe und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) Penetration aufgrund unzureichender in Frage gestellt als Wirksamkeit gegen intrazelluläre Mtb 8 verringert, 9. Als solche neue Modelle und Tests, die Berücksichtigung dieser Parameter während der frühen Führung Entwicklungsprozess zweifellos TB Drug Discovery nehmen würde Anstrengungen verbessern würde. Um diesem Bedarf zu begegnen, wir eine kostengünstige, schnelle und BSL-2 - kompatible Alternative Infektionsmodell für Mtb Arzneimittelwirksamkeitsprüfung 16 vor kurzem etabliert. Diese Infektionsmodell produziert dicht Mtb verpackt in großen Makrophagen Aggregatstrukturen, die physiologisch relevante zelluläre Penetrationsbarrieren rekapituliert und erzeugt Makrophagen-agierten <em&gt; Mtb mit einem veränderten physiologischen Zustand latenten Mtb ähnelt. Mtb von dieser Infektion Modell abgeleitet wurde mit dem Resazurin Mikrotitertest (REMA) kombiniert Wirksamkeit von Medikamenten zu bewerten, die mit der berichteten Fähigkeit von gemeinsamen TB - Medikamente Ergebnisse im Einklang mit anderen intrazellulären Infektionsmodellen und korreliert gut produziert hohen CSF - Konzentrationen in Bezug auf Serumkonzentrationen erzielen 16. Hier beschreiben wir ausführlich in der Erzeugung von Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen Makrophagen-agierten Mtb geeignet für die Arzneimittelempfindlichkeitstests unter Verwendung von REMA herzustellen. Insbesondere zeigen wir, wie diese Infektion System auf eine 96-Well-Format für die Kompatibilität mit Durchsatz-Screening von Kandidaten-Anti-TB-Medikamente angepasst werden könnte.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>20%ige Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren</td></tr><tr><td>D-Pantothensäure, Hemicalciumsalz</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Bereiten Sie 24 mg/ml Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren</td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td> Herstellung <td>von 50 mg/ml Stammlösung in H2O; Filter Sterilisierung von</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Herstellung von 200 mg/ml Stammlösung in H2O</td></tr><tr><td>Nalgene Square PETG Medienflasche</td><td>Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td>Austauschbar mit jedem Fluoreszenzplatten-Reader und Mikroskop</td></tr><tr><td>Gen5 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Aufzeichnung und Analyse von Rezasurin-Coversion</td></tr><tr><td>Rifampicin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td> Herstellung <td>von 10 mg/ml Stammlösung in H2O</td></tr><tr><td>Moxifloxacin</td><td>Hydrochlorid Acros Organics</td><td>457960010</td><td>Herstellung von 10 mg/ml Stammlösung in H2O</td></tr><tr><td>Resazurin Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>Zubereitung von 800 μm; g/ml Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>20%ige Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren</td></tr></tbody></table>

ein hochdurchsatz-assay unterstützte wirksamkeit von medikamenten gegen makrophagen agierten zur bewertung<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Der frühe Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente wird durch die ineffiziente Umsetzung von Verbindungen mit In-vitro-Aktivität in die Wirksamkeit im klinischen Umfeld behindert. Dies ist wahrscheinlich auf eine mangelnde Berücksichtigung der physiologisch relevanten zellulären Penetrationsbarrieren zurückzuführen, die im infizierten Wirt vorhanden sind. Wir haben kürzlich ein alternatives Infektionsmodell etabliert, das große Makrophagen-Aggregatstrukturen erzeugt, die dicht gepackte M. tuberculosis (Mtb) im Kern enthalten und sich für Empfindlichkeitstests von Medikamenten eignen. Dieses Infektionsmodell ist kostengünstig, schnell und vor allem BSL-2-kompatibel. Hier beschreiben wir die experimentellen Verfahren zur Generierung von Mtb/Makrophagen-Aggregatstrukturen, die Makrophagen-passageiertes Mtb für Arzneimittelempfindlichkeitstests produzieren würden. Insbesondere zeigen wir, wie dieses Infektionssystem direkt an das 96-Well-Plattenformat angepasst werden könnte, was die Durchsatzfähigkeit für das Screening von Wirkstoffbibliotheken gegen Mtb zeigt. Insgesamt ist dieser Assay aufgrund seiner Einfachheit, Kosteneffizienz und Skalierbarkeit eine wertvolle Ergänzung der derzeit verfügbaren Mtb-Wirkstoffforschungs-Toolbox.

Um die Robustheit der Anpassung dieser Infektionsmodell auf 96-Well - Plattenformat bestätigen, untersuchten wir hier die Wirkstoffansprechverhaltens von Mtb abgeleitet aus unserer 96-Well angepasst Infektionsmodell Rifampicin (RIF) und Moxifloxacin (Moxi) nach der Vorlage in Abbildung 1A. Wir zeigen , dass die Erzeugung von Mtb / Makrophagen Aggregatstrukturen Schlüssel zu diesem Assay kann zuverlässig in einer 96-Well - Plattenformat (Figur 2)...

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, reproduzierbar Makrophagen-Aggregatstrukturen herzustellen, die mit Mycobacterium tuberculosis infiziert sind, in einem 96-Well-Plattenformat für die Empfindlichkeitstestung von Wirkstoffen unter Verwendung eines Vitalitätsfarbstoffs. Diese Methode kann den frühen Wirkstoffentwicklungsprozess für anti-tuberkulöse Verbindungen verbessern, der durch die erfolglose Übertragung von Kandidatenverbindungen in den klinischen Bereich behindert wird. Der Hauptvorteil dieses einfachen, kostengünstigen Infektionsmodells, das mit BSL 2 kompatibel ist, liegt darin, dass es physiologisch relevante zelluläre Penetrationsbarrieren nachbildet, wie sie an Tuberkulose-Granulome erinnern.Dies liefert Ergebnisse zur Arzneimittelempfindlichkeit, die die Wirksamkeit in vivo besser vorhersagen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das grün fluoreszierende Protein exprimierende M. tuberculosis MC²6206, im Folgenden als MTBGFP bezeichnet, für die Infektion vorbereiten. Beachten Sie, dass es sich hierbei um einen avirulenten Stamm handelt, sodass alle Arbeiten im hier beschriebenen Protokoll in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt werden können.Pro 96-Well-Platte Zentrifugation von 2,8 × 10⁸ MTBGFP bei 3.200 × g für fünf Minuten in einem Schwenkkorbzentrifugen. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und fünf Milliliter RPMIC hinzufügen, um die Bakterien zu waschen. Die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendieren.Danach erneut zentrifugieren. Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt das Überstand entfernen und die bakteriellen Zellen in sieben Milliliter RPMIC resuspendieren, dann 10 Sekunden lang verwirbeln. Als Nächstes für jede vorzubereitende 96-Well-Platte siebenmal 10 hoch 6 THP1-humane monozytäre Zellen bei 250 × g für fünf Minuten zentrifugieren.Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und die THP1-Zellen in sieben Millilitern RPMIC resuspendieren. Bereiten Sie als Nächstes eine 96-Well-Platte für die Infektion vor, indem Sie 200 Mikroliter sterilem Wasser in die Wells der Reihen A und H sowie der Spalten 1 und 12 hinzufügen. Dieser Wasser-Rand verhindert die Verdunstung des Kulturmediums.Geben Sie 200 Mikroliter RPMIC in die Spalte zwei, B zwei bis G zwei, für die Hintergrundkontrolle oder die Leerprobe. Um die THP1-Monozyten zu infizieren, verwenden Sie eine Pipette, um die gesamte vorbereitete MTBGFP-Bakteriensuspension auf die THP1-Zellsuspension zu übertragen, und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Die endgültige THP1-Zelldichte beträgt fünf mal 10 hoch fünf pro Milliliter und die entsprechende Multiplizität der Infektion liegt bei 40.Geben Sie als Nächstes die THP1-MTBGFP-Suspension in ein 25-Milliliter-Reservoir und fügen Sie anschließend mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter der THP1-MTBGFP-Suspension in alle verbleibenden 96 Vertiefungen, E3 bis G11, ein. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 für sieben bis zehn Tage. Wechseln Sie alle zwei Tage während der Inkubation das Medium, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette langsam jeweils 100 Mikroliter verbrauchtes Medium von der Oberfläche jedes Wells abziehen und vorsichtig 100 Mikroliter vorgewärmtes RPMIC hinzufügen.Beim Mediumwechsel ist darauf zu achten, die MTB-Makrophagen-Aggregate am Boden der Vertiefungen nicht zu stören. Untersuchen Sie die Vertiefungen täglich visuell mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops, das mit Hellfeld- und GFP-Filtern sowie einem Objektiv mit 4- bis 10-facher Vergrößerung ausgestattet ist. Notieren Sie die Größe der MTB-Makrophagen-Aggregate und fertigen Sie gegebenenfalls Bilder an.Am siebten bis zehnten Tag sollten die MTB-Makrophagen-Aggregate ausreichend groß sein, um wie später im Video beschrieben mit der Wirksamkeitstestung von Wirkstoffen fortzufahren. Für die Wirkstoffprüfung bereiten Sie zwei Antituberkulosemittel in dreifacher Ausführung auf einer neuen 96-Loch-Platte wie folgt vor. Fügen Sie zunächst 125 Mikroliter 7H9C-Medium in die Vertiefungen B2 bis G10 hinzu.Bereiten Sie anschließend die beiden Wirkstoffe in einer Konzentration vor, die dem Doppelten der höchsten gewünschten Endkonzentration entspricht, in einem Milliliter 7H9C. Geben Sie mithilfe einer Pipette jeweils 250 Mikroliter der Wirkstoffe in die Vertiefungen B, C und D 11 sowie anschließend in E, F und G 11 für die dreifachen Behandlungen. Verdünnen Sie danach die Testsubstanzen mit einer Mehrkanalpipette seriell im Verhältnis 1:2, indem Sie 125 Mikroliter von B 11 bis G 11 in die Vertiefungen B 10 bis G 10 übertragen.Mischen Sie durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren in jedem Schritt. Fahren Sie fort, 125 Mikroliter von Spalte zu Spalte von rechts nach links über die Platte zu überführen, und hören Sie nach Spalte vier auf. Nach dem Mischen von Spalte vier entsorgen Sie 125 Mikroliter in einen Abfallbehälter.Die Spalten zwei und drei sollten keine Wirkstoffe enthalten. Dies ermöglicht ihre Verwendung als Hintergrund sowie als positive Wachstumskontrollen. Entnehmen Sie als Nächstes die 96-Loch-Platte mit den mit MTB infizierten Makrophagen aus dem Inkubator.Ohne die Platte zu kippen, entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter Medium aus den Vertiefungen B zwei bis G 11. Kippen Sie dann die Platte wie hier gezeigt und führen Sie die Pipettenspitzen in den unteren Rand der Vertiefungen ein, um das verbleibende Medium, etwa 50 Mikroliter, zu entfernen. Da die MTB-Makrophagen-Aggregate am Boden der Vertiefung haften, sollte kein Material verloren gehen.Der Mediumentzug sollte jedoch so schonend wie möglich erfolgen, und es ist darauf zu achten, eine erneute Aufschlämmung während dieses Vorgangs zu vermeiden. Geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter 7H9C-Medium in die Vertiefungen B zwei bis G 11 der Platte, die die MTB-Makrophagen-Aggregate enthalten. Übertragen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der drogenhaltigen 96-Loch-Platte in die entsprechenden Vertiefungen der Infektionsplatte.Anschließend die Platte in einen verschließbaren Beutel geben und drei Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren. Der Resazurin-Assay beruht auf den von metabolisch aktiven MTB produzierten oxidativen Spezies, die das blaue Resazurin in das fluoreszierende rosa Resorufin umwandeln. Die Farb- und Fluoreszenzänderung kann als Surrogatmarker verwendet werden, um die Menge des bakteriellen Wachstums zu bestimmen.Stellen Sie eine Stammlösung von Resazurin mit einer Endkonzentration von 8 Milligramm pro Milliliter in Wasser her. Filtern Sie die Lösung zur Sterilisation durch eine PVDF-Membran mit einer Porengröße von 22 Mikrometern. Bereiten Sie eine Arbeitslösung in Resazurin zu, indem Sie die Stammlösung, Wasser und Tween-80 im Verhältnis 2:1:1 mischen.Die endgültigen Konzentrationen betragen 4 Milligramm pro Milliliter Resazurin und 5 % Tween-80. Richten Sie mit einem Plattenreader ein Programm ein, um die Fluoreszenz bei 530 Nanometer Anregung und 590 Nanometer Emission über 24 Stunden alle 30 Minuten bei 37 Grad Celsius zu messen. Heizen Sie den Plattenreader vorab auf 37 Grad Celsius vor.Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter Resazurin-Arbeitslösung in die Vertiefungen B zwei bis G 11 der mit Wirkstoff behandelten Platte geben. Die Platte in das Messgerät stellen und das Programm starten. Um die Robustheit der Anpassung dieses Infektionsmodells an das 96-Loch-Plattenformat zu bestätigen, wurde die Empfindlichkeit von MTB gegenüber Rifampicin (RIF) und Moxifloxacin (Moxy) wie in diesem Video beschrieben untersucht.Wie hier gezeigt, wurden MTB-Makrophagen-Aggregatstrukturen erfolgreich im 96-Well-Plattenformat erzeugt, wodurch eine Kompatibilität mit Durchsatzverfahren ermöglicht wurde. Um die Umwandlung von Resazurin als Indikator für das bakterielle Wachstum quantitativ zu messen, wurde die Fluoreszenz einzelner Wells über einen Zeitraum von 24 Stunden kinetisch überwacht. Das Vorhandensein lebensfähiger MTB-Zellen wird durch die Umwandlung des blauen Resazurin-Farbstoffs in seine rosa reduzierte Form nachgewiesen, was quantitativ durch die relativen Fluoreszenzwerte zum Zeitpunkt der Sättigung widergespiegelt wird.Diese repräsentativen Mini-Diagramme zeigen die resultierenden Fluoreszenzeinheiten auf der Y-Achse gegenüber der Zeit auf der X-Achse. Zur Erstellung der Wirkstoffempfindlichkeits-Killinkurven wurden die mit Rifampicin und Moxifloxacin behandelten Vertiefungen auf das maximale MTB-Wachstum der Kontrolle ohne Wirkstoff als 100 % Überleben normiert. Hintergrundkontrollwerte wurden von jedem Probenansatz abgezogen.Die Überlebensrate in Prozent wurde für jede einzelne Konzentration der Wirkstoffbehandlung aufgetragen, um eine Abtötungskurve zu erstellen. Diese Daten zeigen, dass die minimale Hemmkonzentration, definiert als die niedrigste Konzentration des Antibiotikums, bei der eine 90 %ige Wachstumshemmung beobachtet wird, für Rifampicin und Moxifloxacin gegenüber MTB aus unserem Infektionsmodell jeweils über zwei Mikrogramm pro Milliliter liegt. Daher spiegelt die minimale Hemmkonzentration dieser beiden Wirkstoffe gegenüber MTB unter Verwendung unseres Infektionsmodells und Assays die Wirkung dieser Wirkstoffe im lebenden Organismus besser wider.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man MTB-infizierte Makrophagen-Aggregatstrukturen zuverlässig und reproduzierbar für die Testung der Empfindlichkeit gegenüber Wirkstoffen unter Verwendung des Resazurin-Assays erzeugt. Die Anpassung dieses Verfahrens, bei dem die Wirkstoffvorlage von zwei Wirkstoffen, wie gezeigt, auf ein Panel mit 58 Wirkstoffen erweitert wird, lässt sich leicht durchführen, um ein Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoffen zu ermöglichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektionen. Es wird ein in vitro Infektionsmodell mit Mtb/Makrophagen-Aggregaten erstellt, das eine in vivo Infektion nachahmt. Bei der Einführung geeigneter Antibiotika wird deren Wirksamkeit mittels Resuzarin-Assay getestet, um das Überleben von Bakterien mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen zu überwachen.

Ein Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen ein Mycobacterium tuberculosis-Infektionsmodell

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Eine schnelle und effiziente Quantifizierung des intrazellulären M . tuberculosis-Wachstums ist entscheidend für verbesserte Therapien gegen Tuberkulose (TB). Dieses Protokoll beschreibt einen brühebasierten kolorimetrischen Detektionsassay unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkultursystems zur Quantifizierung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit Wirtstherapiekandidaten behandelt werden.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Die Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE) ist die Goldstandard-Technik zur Quantifizierung von Bakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis , die Wochen brauchen kann, um sichtbare Kolonien zu bilden. Hier beschreiben wir eine Mikrokbe für die KBE-Bestimmung mit erhöhter Zeiteffizienz, reduziertem Laborplatz und Reagenzienkosten sowie Skalierbarkeit auf Experimente mit mittlerem und hohem Durchsatz.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

In dieser Studie wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Screening gegen Mycobacterium abscessus mit einem kürzlich entwickelten Doppelreporterstamm entwickelt, der Fluoreszenz und Lumineszenz verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll wird für Forscher relevant sein, die neue Medikamente gegen diese arzneimittelresistenten Bakterien untersuchen wollen.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Diese Studie liefert ein Protokoll zur Bewertung der Interaktion von Mycobacterium tuberculosis mit dem mikrobiellen Sensor SLAMF1. Die Assays wurden an humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Die beschriebenen Werkzeuge sind relevant für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und Immunrezeptoren.

Fluoreszenz-Assays zur Untersuchung der Interaktion von Mycobacterium tuberculosis mit dem Immunrezeptor SLAMF1

Mycobacterium tuberculosis bildet Wirkstoff toleranten Biofilme, wenn unter bestimmten Bedingungen kultiviert. Hier beschreiben wir Verfahren zur Kultivierung von M. Tuberkulose Biofilmen und die Bestimmung der Häufigkeit des Drogenkonsums tolerant persisters. Diese Protokolle werden für weitere Studien sinnvoll in die Mechanismen der Verträglichkeit der Medikamente in M. Tuberkulose.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Tuberkulose und Malaria sind zwei der häufigsten Infektionen bei Menschen und die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei der verarmten Bevölkerung in den Tropen. Wir gründeten eine experimentelle Modellsystem, um Ergebnisse der Malaria-Tuberkulose-Koinfektion bei Mäusen nach der Infektion mit beiden Erregern über ihre natürlichen Infektionsweg zu studieren.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Ein Verstärkungsmikroarray kombiniert asymmetrischen PCR-Amplifikation und Mikroarray-Hybridisierung in einer einzigen Kammer, die Mikroarray-Arbeitsprozess deutlich vereinfacht für den Endbenutzer. Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Erfahren Sie einen Hochdurchsatz-Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis in Makrophagen-Aggregaten. Diese kostengünstige Methode ermöglicht prädiktive Ergebnisse für die klinische Wirksamkeit.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung

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