Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung Mycobacterium tuberculosis

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, reproduzierbare Mycobacterium tuberculosis-infizierte Makrophagen-Aggregatstrukturen im 96-Well-Plattenformat für die Empfindlichkeitsprüfung von Arzneimitteln unter Verwendung eines Viabilitätsfarbstoffs zu erzeugen. Diese Methode kann den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Wirkstoffe verbessern, der durch die unproduktive Translation von Wirkstoffkandidaten in das klinische Umfeld behindert wird. Der Hauptvorteil dieses einfachen, kostengünstigen, BSL-Zwei-kompatiblen Infektionsmodells besteht darin, dass es physiologisch relevante zelluläre Penetrationsbarrieren rekapituliert, die an Tuberkulose-Granulome erinnern.

Dies führt zu Ergebnissen zur Empfindlichkeit von Medikamenten, die die Wirksamkeit in vivo besser vorhersagen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie grün fluoreszierendes Protein, das M. tuberculosis MC zum Quadrat 6206 exprimiert, im Folgenden als MTBGFP bezeichnet, für die Infektion vorbereiten. Beachten Sie, dass es sich um einen avirulenten Stamm handelt, so dass alle Arbeiten im hier beschriebenen Protokoll in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt werden können.

Für jede aufzustellende 96-Well-Platte wird bei 2,8 mal 10 bis zur achten MTBGFP bei 3, 200 mal G für fünf Minuten in einer schwingenden Schaufelzentrifuge zentrifugiert. Nach dem Schleudern den Überstand absaugen und fünf Milliliter RPMIC hinzufügen, um die Bakterien zu waschen. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zelle wieder zu suspendieren.

Dann erneut zentrifugieren. Nach der zweiten Drehung gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Bakterienzellen in sieben Millilitern RPMIC, dann 10 Sekunden lang vortexen. Als nächstes zentrifugieren Sie für jede 96-Well-Platte, die eingerichtet werden soll, sieben mal 10 auf die sechste THP1-Platte menschlicher monozytärer Zellen bei 250 mal G für fünf Minuten.

Nach der Zentrifugation gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren die THP1-Zellen in sieben Millilitern RPMIC. Bereiten Sie als Nächstes eine 96-Well-Platte für die Infektion vor, indem Sie 200 Mikroliter steriles Wasser in die Vertiefungen in den Reihen A und H sowie in den Spalten eins und 12 geben. Dieser Wasserrand verhindert die Verdunstung des Nährmediums.

Fügen Sie 200 Mikroliter RPMIC in Spalte zwei, B zwei bis G zwei für die Hintergrundsteuerung hinzu oder leeren Sie es. Um den THP1-Monozyten zu infizieren, wird mit einer Pipette die gesamte vorbereitete MTBGFP-Bakteriensuspension auf die THP1-Zellsuspension übertragen und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Die endgültige THP1-Zelldichte beträgt fünf mal 10 hoch 10 pro Milliliter und die entsprechende Well-Duplizität der Infektion beträgt 40.

Gießen Sie anschließend die THP1 MTBGFP-Suspension in ein 25-Milliliter-Reservoir und fügen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter THP1 MTBGFP-Suspension in alle verbleibenden 96 Vertiefungen, E drei bis G 11, hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für sieben bis 10 Tage. Verwenden Sie während der Inkubation alle zwei Tage eine Mehrkanalpipette, um das Medium zu wechseln, indem Sie langsam 100 Mikroliter verbrauchtes Medium von der Oberseite jeder Vertiefung entfernen und vorsichtig 100 Mikroliter vorgewärmtes RPMIC hinzufügen.

Beim Wechsel des Mediums ist darauf zu achten, dass die MTB-Makrophagen-Aggregate am Boden der Vertiefungen nicht gestört werden. Jeden Tag untersuchen Sie die Vertiefungen visuell mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit Hellfeld- und GFP-Filtersets mit einem vier- bis 10-fachen Objektiv ausgestattet ist. Notieren Sie sich die Größe der MTB-Makrophagenaggregate und nehmen Sie bei Bedarf Bilder auf.

Am siebten bis zehnten Tag sollten die MTB-Makrophagenaggregate groß genug sein, um mit der Wirksamkeitsprüfung des Arzneimittels fortzufahren, wie später im Video beschrieben. Bereiten Sie für die Arzneimitteluntersuchung zwei Anti-Tuberkulose-Medikamente in dreifacher Ausfertigung auf einer neuen 96-Well-Platte wie folgt vor. Zuerst werden 125 Mikroliter 7H9C-Medium in die Vertiefungen B zwei bis G 10 gegeben.

Bereiten Sie dann die beiden Arzneimittel mit dem Doppelten der höchsten gewünschten Endkonzentration in einem Milliliter 7H9C vor. Geben Sie mit einer Pipette 250 Mikroliter jedes Arzneimittels in die Vertiefungen B, C und D 11 und dann E, F und G 11 für dreifache Behandlungen. Als nächstes verdünnen Sie die Testmedikamente mit einer Mehrkanalpipette seriell um das Zweifache, indem Sie 125 Mikroliter von B 11 über G 11 in B 10 bis G 10 bewegen.

Mischen Sie, indem Sie bei jedem Schritt fünfmal pipettieren. Bewegen Sie weiterhin 125 Mikroliter von Spalte zu Spalte von rechts nach links über die Platte und hören Sie nach Spalte vier auf. Nach dem Mischen der vierten Säule werden 125 Mikroliter in einen Abfallbehälter entsorgt.

Die Spalten zwei und drei sollten keine Arzneimittel enthalten. Auf diese Weise können sie als Hintergrund und für positive Wachstumskontrollen verwendet werden. Entnehmen Sie anschließend die 96-Well-Platte mit den MTB-infizierten Makrophagen aus dem Inkubator.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, ohne die Platte zu kippen, um 150 Mikroliter Medium aus den Vertiefungen B zwei bis G 11 zu entfernen, ohne die Platte zu kippen. Kippen Sie dann die Platte wie hier gezeigt, und stecken Sie die Pipettenspitzen in den unteren Rand der Vertiefungen und entfernen Sie das restliche Medium, etwa 50 Mikroliter. Da MTB-Makrophagen-Aggregate am Boden der Vertiefung haften, sollte kein Material verloren gehen.

Die Entfernung des Mediums sollte jedoch so schonend wie möglich erfolgen und es muss darauf geachtet werden, dass eine Resuspension während dieses Prozesses vermieden wird. Geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter 7H9C-Medium in die Vertiefungen B zwei bis G 11 der Platte, die die MTB-Makrophagen-Aggregate enthalten. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter des Arzneimittels mit einer 96-Well-Platte in die entsprechenden Vertiefungen der Infektionsplatte.

Dann legst du die Platte in einen verschlossenen Beutel und inkubierst sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius. Der Resazurin-Assay beruht auf den oxidativen Spezies, die von metabolisch aktivem MTB produziert werden, um das blaue Resazurin in fluoreszierendes rosa Resorufin umzuwandeln. Die Veränderung der Farbe und Fluoreszenz kann als Surrogatmarker verwendet werden, um das Ausmaß des Bakterienwachstums zu bestimmen.

Bereiten Sie eine Stammlösung von Resazurin in einer Endkonzentration von 8 Milligramm pro Milliliter in Wasser vor. Zur Sterilisation durch eine PVDF-Membran mit einer Porengröße von 22 Mikrometern filtrieren. Bereiten Sie eine Arbeitslösung in Resazurin vor, indem Sie die Stammlösung, Wasser und Tween-80 in einem Verhältnis von zwei zu eins zu eins mischen.

Die Endkonzentrationen betragen 4 Milligramm pro Milliliter Resazurin und 5 % Tween-80. Richten Sie mit einem Plattenlesegerät ein Programm ein, um die Fluoreszenz bei 530 Nanometer Anregung und 590 Nanometer Emission für 24 Stunden alle 30 Minuten bei 37 Grad Celsius zu messen. Heizen Sie den Plattenleser auf 37 Grad Celsius vor.

Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter Resazurin-Arbeitslösung in die Vertiefungen B, zwei bis G 11 der mit dem Arzneimittel behandelten Platte. Legen Sie die Platte auf das Lesegerät und starten Sie das Programm. Um die Robustheit der Anpassung dieses Infektionsmodells an das 96-Well-Plattenformat zu bestätigen, wurde die Empfindlichkeit von MTB-Rifampicin RIF in Moxifloxacin-Moxy untersucht, wie in diesem Video beschrieben.

Wie hier gezeigt, wurden MTB-Makrophagen-Aggregatstrukturen erfolgreich in einem 96-Well-Plattenformat generiert, wodurch eine Durch-Put-Kompatibilität ermöglicht wurde. Um die Umwandlung von Resazurin als Indikator für das Bakterienwachstum quantitativ zu messen, wurde die Fluoreszenz einzelner Wells über 24 Stunden kinetisch überwacht. Das Vorhandensein lebensfähiger MTB-Zellen wird durch die Umwandlung des blauen Resazurin-Farbstoffs in seine rosafarbene reduzierte Form bestimmt, die sich quantitativ in den relativen Fluoreszenz-z-Netzen zum Zeitpunkt der Sättigung widerspiegelt.

Diese repräsentativen Minidiagramme zeigen die resultierenden Fluoreszenzeinheiten auf der Y-Achse im Vergleich zur auf der X-Achse dargestellten Zeit. Um die Abtötungskurven der Arzneimittelempfindlichkeit zu erzeugen, wurden die mit Rifampicin und Moxifloxacin behandelten Wells auf das maximale MTB-Wachstum ohne Medikamentenkontrolle als 100%-Überleben normalisiert. Leersignale für die Hintergrundsteuerung wurden von jedem Sample-Well subtrahiert.

Das prozentuale Überleben wurde für jede einzelne Konzentration der medikamentösen Behandlung aufgetragen, um eine Tötungskurve zu erstellen. Diese Daten zeigen, dass die minimale Hemmkonzentration die niedrigste Konzentration des Antibiotikums definiert, bei der eine Wachstumshemmung von 90 % beobachtet wird, größer als zwei Mikrogramm pro Milliliter ist, sowohl für Rifampicin als auch für Moxifloxacin gegen MTB, abgeleitet aus unserem Infektionsmodell. Daher spiegelt die minimale inhibitorische Konzentration dieser beiden Medikamente gegen MTB unter Verwendung unseres Infektionsmodells und -assays die Aktivität dieser Medikamente in vivo besser wider.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie zuverlässig und reproduzierbar MTB-infizierte Makrophagen-Aggregatstrukturen für Arzneimittelempfindlichkeitstests mit dem Resazurin-Assay generieren können. Nach diesem Verfahren ist die Modifikation des Wirkstoff-Templates von zwei Medikamenten, wie es in einem Panel mit 58 Wirkstoffbibliotheken gezeigt wird, einfach durchzuführen, um ein Wirkstoffscreening mit hohem Durchsatz zu ermöglichen.