Name: Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Erfahren Sie die direkte Reprogrammierung von Mäuse-Embryofibroblasten zu kardiomyozytenähnlichen Zellen mittels GHMT-Faktoren. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung verschiedener Herzsubtypen für mechanistische Studien.

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A.F.-P. wurde unterstützt durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter der Fördernummer 2015165336. N.V.M wurde durch Zuschüsse des NIH (HL094699), des Burroughs Wellcome Fund (1009838) und des March of Dimes (#5-FY14-203) unterstützt. Wir danken Young-Jae Nam, Christina Lubczyk und Minoti Bhakta für ihre wichtigen Beiträge zur Protokollentwicklung und Datenanalyse. Wir danken auch John Shelton für wertvollen technischen Input und den Mitgliedern des Munshi-Labors für die wissenschaftliche Diskussion.

Alle experimentellen Verfahren Tier Praktiken beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am UT Southwestern Medical Center genehmigt. 1. Isolierung von HCN4-GFP E12,5 embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) <ol><li> Richten Sie zeitlich Paarungen zwischen homozygot HCN4-GFP Männchen und CD-1-Weibchen. </li><li> Sacrifice schwangere Frau bei E12,5 von Kohlendioxid Euthanasie und anschließende Zervikaldislokation. <ol><li> Entfernen Sie Gebärmutterhörner mit Pinzette als 22 zuvor beschrieben, 23, und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ oder Mg 2+. </li></ol></li><li> Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in der Gewebekultur Haube steril Technik. <ol><li> Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase Schere und Pinzette. Halten Sie die Plazenta für eine bessere Handhabung angebracht. pregnant CD-1 Weibchen normalerweise Geburt zwischen 10 und 14 Welpen geben. </li><li> Mit einer Pinzette zu sezieren, nehmen die isolierten Embryonen und sie schnell zweimal in 70% spülen (v / v) EtOH. HINWEIS: Die Wäschen sollte schnell sein Zelltod zu minimieren. </li><li> Entfernen Sie den Kopf, Gliedmaßen, Schwanz und innere Organe, darunter das Herz aus den isolierten Embryonen. </li><li> Legen Sie das verbleibende Gewebe in einem 10-cm - Schale mit 1 ml 1x PBS und fein zerkleinern und eine sterile Rasierklinge auf etwa 1 mm 3 in der Größe verwendet wird . </li><li> Übertragen zerkleinerte Gewebe in ein 50 ml konisches Röhrchen mit PBS. </li><li> Spin bei 300 g für 3 min. aspirieren vorsichtig überschüssige PBS. </li><li> 1 mL steriler 0,25% Trypsin-EDTA pro Embryo. Inkubiere Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig mischen das Rohr alle 4 Minuten. Über Verdauung des Gewebes wird die Ausbeute deutlich niedriger. </li><li> Vortex Zellmischung bei maximaler Geschwindigkeit (3200 rpm) für 4 s. </li><li> In 2 ml Fibroblasten-Medien pro Embryo und mischen. Filter turch einen 100 um Zellsieb mit einer Pipette die Zellen durch das Sieb zu unterstützen. Siehe Tabelle 1 für die Formulierung alle nachfolgenden Medien. </li><li> Spin bei 300 g für 4 min. Sorgfältig absaugen Überstand. </li><li> In 10 ml frischem Fibroblasten-Medien pro 3 Embryonen und verreiben 6-10 mal. </li><li> Platte, die die Zellen in 1 15 cm Gewebekulturschale für alle 3 Embryonen hergestellt. Kultur über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Nach der Inkubation über Nacht ersetzen Sie die Medien mit frischen 30 ml Medium pro Platte. Legen Zellen wieder in den Inkubator über Nacht. HINWEIS: Überprüfen Sie für HCN4-GFP + Zellkontamination unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die Kultur sollte GFP sein - und nur werden GFP + auf Neuprogrammierung. </li><li> Am nächsten Tag Ernte Zellen mit 3 ml frischem vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA. Graf und Gefrierzellen. Typischerweise gefrier Zellen bei 3 x 10 6 Zellen pro mL. Die erwartete yield sollte 3 x 10 6 Zellen pro Embryo sein. </li></ol></li></ol> 2. Retrovirus Produktion und Reprogrammierung Achtung: Das folgende Protokoll erfordert die Herstellung und Handhabung von infektiösen Retroviren. Führen Sie die folgenden Schritte in einem Biosafety Level 2 Schrank unter BSL-2-Richtlinien und sterile Technik. Verwenden Sie 10% Bleiche aller Materialien zu entsorgen ausgesetzt Retroviren. <ol><li> Retrovirus - Produktion und MEF Vorbereitung HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für die retrovirale Produktion in 6-Well-Platten und MEF-Infektion in 24-Well-Platten. Für andere Formate finden Sie in Tabelle 2. MEFs sind an Tag -1 überzogen, so dass das Timing abgestimmt für jedes Experiment in geeigneter Weise werden müssen (siehe Abschnitt 2.3 und Abbildung 2). <ol><li> Pflegen Plat-E (PE) Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. In Kürze, Kultur PE-Zellen in DMEM mit 10% FBS ergänzt, 1 &amp; mgr; g / mL puromycin, 10 ug / ml Blasticidin, Penicillin und Streptomycin. Passage Zellen 1: 4 alle zwei Tage, wenn die Kultur 70-90% Konfluenz erreicht. </li><li> Tag -2: Am Tag vor der Transfektion Samen Plat-E - Zellen bei 1 × 10 6 Zellen / Vertiefung auf einer 6-Well - Platte in Transfektionsmedien. Zellen sollten 70-80% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion werden. </li></ol></li><li> Transfektion Kommerzielle Transfektionsagens verwenden. HINWEIS: Die kommerziellen Reagenzien bei Raumtemperatur (RT) vor der Transfektion sein sollte. Für die DNA - Transfektion, für jede retrovirale Plasmid - DNA einzeln (G, H, M und T) 9 einen GHMT Cocktail zu bilden. <ol><li> Tag -1: In einem 15 ml konischen Polystyrolröhrchen, mischen 60 ul reduziert Serum - Medien mit 6 ul Transfektionsreagenz pro Reaktion für eine 6-Well - Plattenformat. Inkubieren der Mischung für 5 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Da das Transfektionsreagenz hier bindet an Kunststoffen, eindirekt mit dem reduzierten Serummedien dd jede Abnahme der Transfektionseffizienz zu vermeiden. </li><li> In insgesamt 2 ug GHMT Cocktail pro Reaktion und klopfen Sie leicht zu mischen. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren der Reaktion für 15 min bei RT. </li><li> In der Mischung aus Schritt 2.2.3 an die PE-Zellen in einer tropfenweise Art und Weise. </li><li> Inkubieren der transfizierten Plat-E - Zellen über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Notieren Sie sich die Zeit der Transfektion. </li></ol></li><li> Seeding von HCN4-GFP embryonalen Maus - Fibroblasten. <ol><li> 1 h vor MEFs Plattierung, eine 24-Well-Platte für Immunzytochemie vorzubereiten. <ol><li> Fügen Sie eine 12 mm Fibronektin Deckglas pro Vertiefung. </li><li> Coat Vertiefungen mit 300 &amp; mgr; l Rinderkollagenlösung (zB surecoat) und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator für 1 h. </li><li> Absaugen Beschichtungslösung unmittelbar vor der MEF-Beschichtung. </li></ol></li><li> Tauen Sie eine gefrorene Fläschchen HCN4-GFP MEFs und waschen x1 mit vorgewärmten fibroblast Medien bei 500 xg für 5 min. </li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen Trypanblau-Ausschluss oder ähnliche Farbstoffe verwendet. Berechne die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur mit der folgenden Formel: % Lebenden Zellen = [1,00 - (Anzahl der blauen Zellen / Anzahl der gesamten Zellen)] x 100 <ol><li> Berechnen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung der folgenden Formel: Lebensfähige Zellen =% lebende Zellen x Verdünnungsfaktor x 10.000 x Gesamtvolumen der Zellsuspension </li></ol></li><li> Seed 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf eine Platte mit 24 Vertiefungen mit zuvor hergestellten Rinder - Kollagen - Lösung-Fibronektin Deckglas. </li></ol></li><li> Transduction und Reprogrammierung von MEFs HINWEIS: Nach den Notizen des Herstellers richtig gepflegt Plat-E - Zellen produzieren einen durchschnittlichen Titer von 1 x 10 7 Infektion Einheiten / ml. Obwohl die Titer nicht direkt für jedes Experiment gemessen wird, wird ein GFP Steuerung immer als Surrogat für Infektionseffizienz enthalten.Hohe GFP - Expression und Intensität (GFP +&gt; 95%) korreliert typischerweise mit erfolgreichen GHMT-vermittelte Erzeugung von iCLMs. <ol><li> Tag 0: 24 h nach der Transfektion, filtern das PE Medium retroviralen durch einen 0,45 &amp; mgr; m Porengröße Tensid freie Celluloseacetat - Filter und in ein 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / mL. Sorgfältig Zellen mit 2 ml frischem Transfektionsmediums aufzufüllen. Hinweis: Zellen leicht von der Platte lösen, wenn Medien zu schnell geändert wird. </li><li> Saugen Sie das Medium der kultivierten MEFs und fügen Sie den frisch retroviralen Medium gesammelt; es sollte 1,7 ml Medium pro Well einer 6-Well-Platte ergeben. In ~ 800 &amp; mgr; l pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Zurück MEF Platte in den Inkubator und über Nacht inkubiert. </li><li> Tag 1: Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1 und 2.4.2. Entsorgen Sie Zellen nach der 2. Virussammlung. Zurück infizierten MEFs in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht ruhen. </li><li> Tag 2: 48 h nach der Induktion, aspirieren die Zelle konditionierten Medien und Wasch x1 mit 1x PBS. In 500 ul vorgewärmt icLm Medien pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. </li><li> Ersetzen icLm Medien alle 2 - 3 Tage. Prozessplatte 14 Tage nach der viralen Induktion für Immunzytochemie (ICC) Analyse der kardialen Neuprogrammierung. </li></ol></li></ol> 3. Immunfärbung von Reprogrammed MEFs <ol><li> 14-Tage nach der Induktion, aspirieren sorgfältig die Medien. </li><li> Spülen Sie jede Vertiefung mit 300 &amp; mgr; l eiskaltem 1x PBS. Absaugen überschüssige Lösung. </li><li> Fix-Zellen mit 250 &amp; mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubiere 15 Minuten bei RT. HINWEIS: - 2 Wochen vor Anfärbung Fixierte Zellen können 1 in PBS bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Permeabilisierung Zellen durch Waschen Brunnen x3 mit 300 &amp; mgr; l 0,1% PBS-Triton X 100 (PBST). Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen. </li><li> Block 10min bei RT mit 1x Universal-Block-Puffer bei 300 &amp; mgr; l / Vertiefung. </li><li> Bereiten Sie (ICC) Färbepuffers: 1: 1 von 1x PBS und 1x Universal-Blocking-Puffer. Verdünnen primäre Antikörper in ICC Färbepuffers und Inkubation Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen. <ol><li> Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen NPPA für iPM und iAM Identifikation. </li><li> Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen Myl2 für iPM und iVM Identifikation. </li></ol></li><li> Am folgenden Tag waschen Brunnen x3 mit 300 &amp; mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen. </li><li> Bereiten Sie die sekundären Antikörper-Verdünnungen in ICC Färbepuffers. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen. Inkubieren Sekundärantikörper 1 h bei RT, vor Licht geschützt. <ol><li> Stain alle Folien mit den folgenden sekundären antibodies: Maus Alexa-555, Huhn Alexa-488, und Kaninchen Alexa-647. </li></ol></li><li> Waschen Sie Brunnen x3 mit 300 &amp; mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. Vor Licht schützen. </li><li> Fügen 2,4 ul Eindeckmedien enthaltend 1,5 &amp; mgr; g / ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in ein Glasobjektträger. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas aus dem Brunnen der 24-Well-Platte, entfernen Sie überschüssige Lösung und Transfer zum Glasträger mit Montage Medien. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas überschüssiges Volumen und Luft zu entfernen. </li><li> Seal Folien mit bevorzugten Nagellack oder Kunststoff Versiegelung. Shop gerahmte Dias bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li></ol> 4. Identifizierung von Cardiac-Formationsglieder mittels konfokaler Mikroskopie HINWEIS: Für die Bildgebung, ein konfokales Mikroskop mit mindestens zwei Fluoreszenzdetektoren der Lage spektralen Detektion bei 405, 488, 555 und 639 nm Wellenlängen erforderlich ist, um IPMS, IAMS und IVMS zu identifizieren. Image-Zellen ein Plan-Apochromat 20x / 0,75 Ziel oder besser verwenden. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software des Herstellers, Scannen Zoom-Bilder 40X-Ölkapselung Bildqualität erreichen können. <ol><li> Bildarchiv: Nehmen Sie 8-Bit-Bilder mit DAPI, Alexa-488, Alexa-555 und Alexa-647-Kanäle (ch.). Pixel Verweilzeit von 6 s, 1024 Rahmengröße, Zeilen Schritt bei 2, und Mitteln von 2 reicht für hochauflösende Bilder. </li><li> Für jede Folie, die von einem Rand beginnen und Scannen nach oben und unten in der roten Fluoreszenzkanal (ch.) Zur α-Actinin + Sarkomer + Zellen (Siehe 3 und 5A Beispiele Abbildung). Sarkomers Riefen sind leichter zu visuell in der 555 nm Wellenlänge zu identifizieren. <ol><li> Sobald ein α-Actinin + Sarkomer + Zelle identifiziert wurde, wechseln Sie in den grünen ch. und merken, wenn es positiv ist (ipm). Wechseln Sie auf dem Computer mit dem fernen Rot 647 ch zu beurteilen. (IAM oder iVM). HINWEIS: Die Zellen, dieα-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - als IPMS bezeichnet. GFP - Expression wird in der gesamten Zelle (4A) gesehen werden. </li><li> Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), NPPA (Kaninchen-Alexa647) und DAPI. Zellen , die α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP sind - / NPPA + sind iAM. NPPA Färbung erscheint perinukleäre und punctata (4B). </li><li> Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), Myl2 (Kaninchen-Alexa647). Zellen , die positiv für α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + sind IVMS. Myl2 Färbung wird ein gestreiftes Form entlang der Sarkomers Filament aufweisen. Aufgrund von Schwankungen in der Qualität der Färbung und der Z-Ebene, Streifungen nicht immer leicht sichtbar (4C) liegen. </li></ol></li></ol> HINWEIS: Um die tatsächliche Anzahl der potenziell umprogrammiert MEFs, 2 Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu bewerten sind parallel zu den experimentellen Vertiefungen ausgesät und 1 Tag geerntet nach der Plattierung. Die Gesamtzahl der plattierten Zellen wird dann durch Mittelung der zwei Vertiefungen bestimmt. Dies wird die tatsächliche Gesamt Zellen plattiert (Ages). <ol><li> Sarkomers + <ol><li> Sichtprüfung jede Zelle auf einem Deckglas für die richtige α-Actinin + / Sarkomer + (rechte Felder Abbildung 3) und Aufzeichnung (5B-i). </li><li> Tabellieren die Gesamtzahl der α-Actinin + / + Sarkomer auf jedem Deckglas und dividieren durch die tatsächliche Gesamt Zellen ausplattiert (ATOTAL) (5B-iii). Wenn beispielsweise ATOTAL = 12.500 Zellen und 100 - Zellen wurden a-Actinin + / + Sarkomer dann 0,8% der plattierten MEFs wurden umprogrammiert. Ein Durchschnittreprograming Experiment Ausbeute 1% α-Actinin + / Sarkomer + Zellen (5C). </li></ol></li><li> Subtype + HINWEIS: Für die folgenden Schritte siehe 5B / C für eine repräsentative icLm Quantifizierung Workflow - Abbildung. Kurz gesagt, für jede Sarkomers + Zelle, tabellarisch , wenn es für beide Subtyp (5B-i) ist einzigartig. Berechnen% Subtype (5B-iii) , indem die Anzahl der Subtyp + Zellen über die durchschnittliche Sarkomers Dividieren + Zellen x 100 (5B-i). Um die absolute% Subtyps Wirkungsgrad (5B-iv) zu berechnen, unterteilen den Subtyp + Zellzahl von 5B-i durch die Gesamtzahl von Zellen ausgesät x 100 (5B-ii). <ol><li> Für jede der α-Actinin + / Sarkomer + Zellen, zu bewerten , ob sie GFP + sind, NPPA + oder Myl2 <sup&gt; +. </li><li> Tabellieren Gesamtanzahl von α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / NPPA + und α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + Zellen (5B-i). </li><li> Um den Prozentsatz von jedem Subtyp berechnen, teilen die Anzahl der Subtype + Zellen durch die Gesamtzahl von α-Actinin + / Sarkomer + -Zellen in das gut und multiplizieren mit 100. GHMT erzeugt IPMS, IAMS und IVMS in etwa gleichen Verhältnissen (Fig 5B-iii). </li><li> Um die absolute Anzahl von Subtyp + Zellen zu berechnen, unterteilen die Gesamtzahl der Subtyp + Zellen für die experimentellen Bedingungen durch ATOTAL und multipliziere mit 100 (5B-ii). Im Durchschnitt IPMS 0,3% der gesamten infizierten Zellpopulation darstellen, Iams 0,3% undIVMS 0,25% (5B-iv). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die vorliegende Studie bietet einen Direkt Umprogrammierung Strategie zur Umwandlung von MEF in eine vielfältige Reihe von Herz-Subtypen durch Retrovirus-vermittelte Expression des kardialen Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5 und Hand2 (GHMT). Unter Verwendung eines Multiplex-Immunfärbung Ansatz in Kombination mit einem PM-spezifischen Reporter Maus, sind wir in der Lage iAM zu identifizieren, IVMS und IPMS auf Einzelzellauflösung. Ein solcher Test ermöglicht eine experimentelle in vitro System in der La...

Das Herz ist das erste funktionelle Organ im Embryo 1, 2 zu entwickeln. In Verbindung mit dem Kreislaufsystem, liefert sie Sauerstoff, Nährstoffe und einen Entsorgungsmechanismus bei der Entwicklung. Drei Wochen nach der Befruchtung, schlägt das menschliche Herz zum ersten Mal und seine angemessene Regelung wird gepflegt von Kardiomyozyten (CMs). Der irreversible Verlust dieser spezialisierten Zellen ist daher die grundlegende Frage progressive Herzinsuffizienz zugrunde liegen. Während einige Organismen wie Zebrafisch und Xenopus das Potential für kardiale Regeneration haben, ist der erwachsenen Säugetier - Herzen begrenzteren 3, 5, 6. Somit ist die kritische Funktion des Herzens gegeben, ist es nicht erstaunlich , dass Herzkrankheit die häufigste Todesursache in der Welt ist, für 600.000 Todesfälle in den Staaten 7 allein Vereinigten Buchhaltung. Dasrefore, zellbasierte Therapien effizient zu reparieren oder den verletzten Myokard sind von großem klinischem Interesse zu ersetzen. Die bahnbrechenden Studie von Yamanaka und Kollegen 8 zeigte , dass erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren ausreichend ist vollständig differenzierten Fibroblasten - Zellen zu pluripotenten Stammzellen zu konvertieren. Allerdings hat die tumorigenen Kapazität aller pluripotenten Stammzellen Strategien war ein kritisches Problem bei der Verwendung für therapeutische Zwecke. Dies motivierte die wissenschaftlichen Bereich für alternative Methoden zu suchen, Zellen zu transdifferentiate während eine pluripotente Stadium vermieden werden. Kürzlich haben mehrere Gruppen die Durchführbarkeit dieser Strategie dargestellt durch direkte Umwandlung von Maus-Fibroblasten induzierten Kardiomyozyten-ähnliche Zellen (iCLMs) mit der ektopischen Expression des Transkriptionsanzeigefaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5, und später, Hand2 (GMT und GHMT bezeichnet) 9, 10. Furthermore kann dieselbe Strategie in vivo durchgeführt werden und in menschlichen Geweben 9, 11, 12. Jüngste Studien haben zusätzliche Faktoren oder Signalwege aufgezeigt , die weiter moduliert werden kann , um Herz Umprogrammierung Effizienz 13, 14, 15 zu verbessern. Zusammengenommen zeigen diese Studien das Potenzial gerichtet transdifferentiation für regenerative Therapien. Allerdings bleiben die geringe Effizienz der CM Umprogrammierung, die unbekannten molekularen Mechanismen, inkonsistente Reproduzierbarkeit aufgrund methodischer Unterschiede 16 und die Heterogenität der iCLMs unadressierte. Um icLm Heterogenität direkt zu bewerten, haben wir eine diskrete und robuste Single-Cell-Test für die Identifizierung von Sarkomers Entwicklung und Herz-Linie specification-zwei notwendigen Eigenschaften von funktionellen Kardiomyozyten. Es gibt mindestens drei Haupttypen von CM im Herzen , wie durch ihre Lage und einzigartige elektrische Eigenschaften definiert: atrial (AM), ventrikuläre (VM) und Schrittmacher (PM) 17, 18, 19, 20. In einer konzertierten Kombination ermöglichen sie die richtige Pumpen von Blut. Während Herzverletzung, eine oder alle Subtypen betroffen sein könnten, und die Art der Zelltherapie müssten auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Derzeit konzentrieren sich die meisten Strategien auf die gesamte Generation von Kardiomyozyten, während wenig Arbeit, die molekularen Mechanismen zu studieren getan wird, um die Subtyp Spezifikation regelt. Die folgende Studie beschreibt, wie man richtig gut organisierten Sarkomere zu quantifizieren und eine vielfältige Reihe von Kardiomyozyten Subtypen identifizieren. Mit Hilfe eines Schrittmachers (PM) -spezifische Reporter Maus, wir sind in der Lage ein i anwendenmmunocytochemical Ansatz zur Unterscheidung induzierte atriale artigen Myozyten (IAM), induzierte ventrikuläre artigen Myozyten (iVM) und induzierte PM-wie Myozyten (IPMS) 21. Basierend auf unseren Beobachtungen nur Zellen, die Sarkomers Organisation zeigen in der Lage sind spontan zu schlagen. Diese einzigartige Umprogrammierung Plattform ermöglicht es, die Rolle für die Beurteilung der bestimmter Parameter in Sarkomers Organisation, Subtyp-Spezifikation, und die Effizienz der CM Neuprogrammierung bei Einzelzellauflösung.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Bestandteil von iCLM-Medien, Plat-E-Medien, Fibroblasten und Transfektionsmedien</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td>Bestandteil von iCLM-Medien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserrum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Bestandteil von iCLM-Medien, Plat-E-Medien, Fibroblasten und Transfektionsmedien</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td>Bestandteil von iCLM media</td></tr><tr><td>MEM Vitaminlösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>Bestandteil von iCLM media</td></tr><tr><td>MEM Aminosäuren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>Bestandteil von iCLM media</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>Bestandteil von iCLM media</td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotika</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> 15240062 <td>Bestandteil des iCLM-Mediums</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Bestandteil des iCLM-Mediums</td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes Pferdeserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>Bestandteil des iCLM-Mediums</td></tr><tr><td>NaPyruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>Bestandteil des iCLM-Mediums</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1514022</td><td>Bestandteil von Plat-E-Medien und Fibroblastenmedien</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A11139-03</td><td>Komponente des Plat-E Mediums</td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp; &nbsp;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Bestandteil des Plat-E-Mediums</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Bestandteil des Fibroblastenmediums</td></tr><tr><td>Konfokales Laserscanning LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Für die konfokale Analyse</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfektionsreagenz&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduziertes Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Transfektionsreagenz&nbsp;</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Induktionsreagenz. Bei einer Endkonzentration von 8 μm; M/mL</td></tr><tr><td>Platinium-E (PE) Retrovirale Packagin-Zelllinie, Ecotropic</td><td>CellBiolabs</td><td>RV-101</td><td>Retrovirale Pacaking-Zelllinie</td></tr><tr><td>Trypsin 0,25 % EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Für MEFs und Plat-E-Dissoziation</td></tr><tr><td>Maus anti & alpha;-Actinin (Klon EA-53)</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Antikörper für die konfokale Analyse. Verwenden Sie bei 1:200</td></tr><tr><td>Huhn Anti-GFP IgY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td>Antikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit Pab Anti-NPPA&nbsp;</td><td>Abgent</td><td>AP8534A</td><td>Antikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti Myl2 IgG&nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>Antikörper für die konfokale Analyse. Verwendung im Verhältnis 1:200</td></tr><tr><td>Vectashield Lösung mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>Farbstoff für die konfokale Analyse</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1,0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronektin 12 mm Deckgläser</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1,5</td><td>Deckgläser für die konfokale Analyse</td></tr><tr><td>100 &mu; m Zellensieb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Spritzen Filter SFCA 25MM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>Für die Virenfiltration</td></tr><tr><td>6 mL Spritzen</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>Für die</td></tr><tr><td>Virenfiltration Ziege Anti-Huhn IgY (H& L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen A647 IgG(H+L)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Bei 1:400 verwenden</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG(H+L) A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td><td>Für die Zellpermeabilisierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS ohne CaCl2 und MgCl2 (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Power Block 10x Universal BlockingReagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>Verdünnen auf 1x in H2O</td></tr><tr><td>16%ige wässrige Paraformaldehyd-Lösung (PFA)</td><td>Elektromikroskopie&nbsp;</td><td>15710</td><td>Anwendung bei 4 % verdünnt in dH2Ø</td></tr><tr><td>6 cm&nbsp;</td><td>Platten Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Gewebekulturschalen</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm&nbsp; Gewebekulturschalen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konische Röhrchen</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konische Röhrchen</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypanblau-Lösung</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Für die Lebensfähigkeit</td></tr><tr><td>Ethylalkohol 200 proof</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>Bleichmittel</td><td>Thermo Fisher Wissenschaftlich</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

die beurteilung cardiomyocyte subtypes nach transcription factor-vermittelte reprogrammierung von embryonalen maus-fibroblasten

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Die direkte Reprogrammierung eines Zelltyps in einen anderen hat sich in letzter Zeit als mächtiges Paradigma für die regenerative Medizin, die Modellierung von Krankheiten und die Spezifizierung von Abstammungslinien erwiesen. Insbesondere die Umwandlung von Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten-ähnliche Myozyten (iCLMs) durch Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5 (GHMT) stellt einen wichtigen Weg zur Generierung von de novo kardialen Myozyten in vitro und in vivo dar. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass GHMT eine größere Vielfalt an kardialen Subtypen hervorruft als bisher angenommen, was die Notwendigkeit eines systematischen Ansatzes für die Durchführung zusätzlicher Studien unterstreicht. Bevor jedoch die direkte Reprogrammierung als therapeutische Strategie eingesetzt werden kann, müssen die mechanistischen Grundlagen der Abstammungskonversion im Detail verstanden werden, um spezifische kardiale Subtypen zu erzeugen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Generierung von iCLMs durch GHMT-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus vor. 
Wir skizzieren Methoden zur MEF-Isolierung, retroviralen Produktion und MEF-Infektion, um eine effiziente Reprogrammierung zu erreichen. Um die Subtyp-Identität von reprogrammierten Zellen zu bestimmen, beschreiben wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz für die Durchführung der Immunzytochemie an iCLMs unter Verwendung eines definierten Satzes kompatibler Antikörper. Methoden zur konfokalen Mikroskopie, Identifizierung und Quantifizierung von iCLMs und individuellen atrialen (iAM), ventrikulären (iVM) und Schrittmacher-Subtypen (iPM) werden ebenfalls vorgestellt. Schließlich diskutieren wir repräsentative Ergebnisse prototypischer Experimente zur direkten Reprogrammierung und beleuchten wichtige technische Aspekte unseres Protokolls, um eine effiziente Linienkonvertierung zu gewährleisten. Zusammenfassend sollte unser optimiertes Protokoll einen schrittweisen Ansatz für Forscher bieten, um aussagekräftige kardiale Reprogrammierungsexperimente durchzuführen, die die Identifizierung einzelner CM-Subtypen erfordern.

Unter Ausnutzung der PM-spezifischen Reporter - Maus, entwickelten wir eine multiplex Immunofärbung Strategie diverse endogene Myozyten zu identifizieren , wie in Abbildung 1 dargestellt. Im Anschluss können die Umprogrammierung Schritte in 2 gezeigt ist , die Induktion von Subtyp-spezifischen CMs so früh wie Tag nachgewiesen werden 4 21, wenn auch mit niedriger Rate. Bis zum Tag 14 kann das Experiment gestoppt und für Sarkomers O...

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine vielfältige Gruppe induzierter Kardiomyozyten-Subtypen zu erzeugen und zu quantifizieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale, grundlegende Fragen zur linien-spezifischen Differenzierung während der kardialen Reprogrammierung zu beantworten, beispielsweise welche notwendigen Signale die Assembly der Sarkomere und die Spezifizierung der Subtypen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Methode bereitstellt, um die Effekte auf die Kardio-Subtyp-Spezifizierung quantitativ zu erfassen, was für die Durchführung von Mechanismus-Studien erforderlich ist.Beginnen Sie zunächst mit der Isolierung von embryonalen Mausfibroblasten aus Embryonen des Stadiums E 12,5. Lagern Sie sie wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben in flüssigem Stickstoff. Danach gewinnen Sie Plat-E-Zellen und säen sie mit je einer Million Zellen pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte aus, sodass die Zellen innerhalb von 24 Stunden eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen.Bedecken Sie die Zellen mit Transfektionsmedium und inkubieren Sie sie unter standardmäßigen Kulturbedingungen. Am Tag minus eins des Experiments nehm

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von iCMs unter Verwendung der Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Tbx5 und Mef2c in einem polycistronischen Konstrukt. Dieses Protokoll liefert eine relativ homogene Population von reprogrammierten Zellen mit verbesserter Effizienz und Qualität und ist wertvoll für zukünftige Studien zur iCM-Reprogrammierung.

Verbesserte Generierung induzierter Kardiomyozyten Mit einem Polycistronische Construct Ausdruck optimale Verhältnis von Gata4, Mef2c und Tbx5

Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Hier präsentieren wir eine robuste Methode zur primären embryonale Fibroblasten in funktionellen Herzmuskelzellen durch Überexpression des GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) neben Hemmung der TGF-β-Signal neu zu programmieren. Unser Protokoll generiert schlagende Herzzellen bereits 7 Tage nach Transduktion mit bis zu 60 % Wirkungsgrad.

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den...

In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter

Erfahren Sie die direkte Reprogrammierung von Mäuse-Embryofibroblasten zu kardiomyozytenähnlichen Zellen mittels GHMT-Faktoren. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung verschiedener Herzsubtypen für mechanistische Studien.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

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