Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine vielfältige Gruppe induzierter Kardiomyozyten-Subtypen zu erzeugen und zu quantifizieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale, grundlegende Fragen zur linien-spezifischen Differenzierung während der kardialen Reprogrammierung zu beantworten, beispielsweise welche notwendigen Signale die Assembly der Sarkomere und die Spezifizierung der Subtypen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Methode bereitstellt, um die Effekte auf die Kardio-Subtyp-Spezifizierung quantitativ zu erfassen, was für die Durchführung von Mechanismus-Studien erforderlich ist.

Beginnen Sie zunächst mit der Isolierung von embryonalen Mausfibroblasten aus Embryonen des Stadiums E 12,5. Lagern Sie sie wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben in flüssigem Stickstoff. Danach gewinnen Sie Plat-E-Zellen und säen sie mit je einer Million Zellen pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte aus, sodass die Zellen innerhalb von 24 Stunden eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen.

Bedecken Sie die Zellen mit Transfektionsmedium und inkubieren Sie sie unter standardmäßigen Kulturbedingungen. Am Tag minus eins des Experiments nehmen Sie einen 15-Milliliter-Kegelrohr aus Polystyrol und mischen pro Reaktion 60 Mikroliter Medium mit reduziertem Serum mit sechs Mikrolitern Transfektionsreagenz. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Da das Transfektionsreagenz verwendet wird, geben Sie Ihr Reagenz direkt in das Medium mit reduziertem Serum, um eine Abnahme der Transfektionseffizienz zu vermeiden. Fügen Sie anschließend insgesamt zwei Mikrogramm des GHMT-Cocktails pro Reaktion hinzu und klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um es zu mischen. Inkubieren Sie die Reaktion 15 Minuten bei Raumtemperatur und geben Sie dann die Mischung tropfenweise zu den Plat-E-Zellen hinzu.

Notieren Sie Datum und Uhrzeit der Transfektion. Inkubieren Sie die transfizierten Plat-E-Zellen über Nacht. Eine Stunde vor der Aussaat der embryonalen Mausfibroblasten bereiten Sie eine 24-Loch-Platte für die Immunzytochemie vor, indem Sie zunächst 12 Millimeter große, mit Fibronectin beschichtete Deckgläser in jedes Loch geben.

Fügen Sie anschließend 300 Mikroliter Rinderkollagenlösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang. Gegen Ende der Inkubation tauen Sie eine gefrorene Probe von HCN4GFP-Maus-embryonalen Fibroblasten auf. Tauchen Sie die Zellen schnell auf, waschen Sie sie einmal mit vorgewärmtem Fibroblastenmedium und bestimmen Sie die Konzentration lebender Zellen.

Anschießend die Beschichtungslösung in der 24-Loch-Platte abpipettieren und sofort 30.000 Zellen pro Loch auf die mit Kollagen und Fibronectin beschichteten Deckgläser geben. 24 Stunden nach der Transfektion das Retrovirus-Medium durch einen 0,45-Mikrometer-Porengröße, tensidfreien Celluloseacetat-Filter filtrieren und in ein 15-Milliliter-Konischglas überführen. Anschließend Polybrene bis zu einer Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen.

Ersetzen Sie das Medium der Plat-E-Zellen vorsichtig durch zwei Milliliter frisches Transfektionsmedium. Ein zu schneller Mediumwechsel kann dazu führen, dass sich die Zellen ablösen. Richtig gepflegte Plat-E-Zellen produzieren durchschnittlich zehn Millionen Infektionseinheiten pro Milliliter.

Ein hoher GFP-Ausdruck und eine starke Intensität in mehr als 95 % der Zellen korrelieren typischerweise mit einer erfolgreichen, durch GHNT vermittelten Generierung von induzierten kardiomyozytenähnlichen Myozyten. Danach das Medium der kultivierten embryonalen Fibroblasten absaugen und das frisch gewonnene retrovirale Medium hinzufügen. Anschließend die Meth-Platte in den Inkubator zurückbringen und über Nacht inkubieren.

Am nächsten Tag überführen Sie erneut das Medium von den Plat-E-Zellen zu den embryonalen Fibroblasten. Verwerfen Sie die Plat-E-Zellen nach der zweiten Virusgewinnung. 48 Stunden nach der Induktion saugen Sie das zellbedingte Medium ab und waschen die Zellen einmal mit PBS.

Fügen Sie dann 500 µL vorgewärmtes, induziertes Kardiomyozyten-ähnliches Myozyten-Medium pro Vertiefung einer 24-Loch-Platte hinzu. Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage während der nächsten 12 Tage. 14 Tage nach der Induktion saugen Sie das Medium vorsichtig ab und spülen jede Vertiefung mit 300 µL eiskalter PBS.

Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie 250 µL einer 4 %igen Paraformaldehydlösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur. Permeabilisieren Sie anschließend die Zellen, indem Sie die Vertiefungen dreimal für jeweils fünf Minuten mit 300 µL 0,1 % Triton X-100 in PBS waschen. Aspirieren Sie nach dem letzten Waschschritt die überschüssige Permeabilisierungslösung und geben Sie dann einen universellen Blockierpuffer mit je 300 µL pro Vertiefung hinzu.

10 Minuten bei Raumtemperatur blockieren. Ein Paar Objektträger über Nacht mit Maus-anti-alpha-Actinin, Huhn-anti-GFP und Kaninchen-anti-NPPA-Antikörpern färben, um induzierte, Schrittmacher-ähnliche Myozyten in induzierten, atrial-ähnlichen Myozyten zu identifizieren. Am folgenden Tag die Vertiefungen waschen und das entsprechende sekundäre Antikörperreagenz gemäß dem begleitenden textlichen Protokoll hinzufügen.

Nach weiteren Waschungen 2,4 µL Eindeckmedium auf einen Glasobjektträger geben. Eine Deckglasabdeckung aus der 24-Loch-Platte entnehmen und die überschüssige Lösung entfernen. Anschließend auf den Glasobjektträger mit dem Eindeckmedium übertragen.

Beginnen Sie für jeden Objektträger an einem Rand und scannen Sie im roten Fluoreszenzkanal auf und ab, um alpha-Aktinin-positive, sarcomerpositive Zellen zu identifizieren. Die Streifung der Sarkomere lässt sich am besten bei einer Wellenlänge von 555 Nanometern erkennen. Sobald diese identifiziert sind, wechseln Sie zum grünen Kanal und notieren Sie, ob die Zellen positiv sind.

Wechseln Sie dann zum Computer, um die fernrote Wellenlänge von 647 Nanometern zu überprüfen und nach Färbungen für NPPA oder MYL2 zu suchen. Zellen, die positiv für Alpha-Aktinin und Sarkomer, negativ für Hnc4-GFP und positiv für Nppa sind, stellen induzierte atrialartige Kardiomyozyten dar. Die Nppa-Färbung erscheint paranukleär und punktförmig.

Zunächst zählen Sie 24 Stunden nach der Aussaat die Anzahl der Zellen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Danach überprüfen Sie jede Zelle auf einem Deckglas visuell auf korrekte Färbung von Alpha-Aktinin und Sarkomeren und notieren die Anzahl der Zellen, die für beide Marker positiv gefärbt sind. Anschließend teilen Sie durch die tatsächliche Gesamtanzahl der ausplattierten Zellen.

Ein durchschnittliches Reprogrammierungs-Experiment liefert etwa ein Prozent Zellen, die sowohl für Alpha-Aktinin als auch für Sarkomer positiv sind. Am Tag 14 kann das Experiment beendet und auf die Organisation der Sarkomere hin überprüft werden. Dies zeigt sich durch die hier rot dargestellte positive Färbung für Alpha-Aktinin.

Nur Zellen, die eine Sarkomer-Organisation aufweisen, sind fähig zum spontanen Schlag, daher ist dies eine gute erste Überprüfung. Gezeigt sind hier induzierte, schlagende Zellen mit Eigenschaften von Schrittmacherzellen aus Hcn4-GFP-Reportermäusen. Drei Zellen aus dieser Ansicht weisen eine Sarkomer-Organisation auf.

Drei Zellverbände, die positiv für Hcn4-GFP sind, befinden sich in der Bildmitte und können als Schrittmacherzelltyp identifiziert werden. Eine Zelle unten links zeigt Alpha-Aktinin-Färbung, weist jedoch keine Sarkomer-Organisation oder identifizierbaren Untergruppenmarker auf. In dieser Population induzierter, ventrikulären kardiomyozytenähnlicher Zellen zeigt die mittlere Zelle eine organisierte Sarkomerstruktur; diese Zelle ist außerdem positiv für den Myosin-Leichtketten-Marker MYL-2, der ein Marker für ventrikuläre Kardiomyozyten ist.

Wenn einmal beherrscht, können das Ausplattieren und die Transfektion der Plat-E-Zellen innerhalb einer Stunde durchgeführt werden. Die Induktion der embryonalen Fibroblasten der Maus dauert eine bis zwei Stunden, und die Myto-Quantifizierung einer vollen 24-Well-Platte etwa acht Stunden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass gesunde embryonale Fibroblasten der Maus und Viren mit hoher Titer für ein erfolgreiches Reprogrammierungs-Experiment entscheidend sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Subtypen induzierter Kardiomyozyten erzeugt und quantifiziert.