Name: Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Mikroinjektion menschlicher Brustkrebszellen in embryonale Zebrabärblinge zur Untersuchung invasiven Verhaltens und Metastasierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Intravasation und Extravasation in vivo.

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Untersuchungen an TGF-β-Familie Mitglieder werden vom Cancer Genomics Center Niederlanden unterstützt. Sijia Liu und Jiang Ren werden von der China Scholarship Council für 4 Jahre Studium an der Universität von Leiden unterstützt. Wir danken Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) für die MCF10A Zelllinien.

Alle Forschung , um den transgenen fluoreszierenden Zebrabärbling Tg unter Verwendung (fli: EGFP) Stamm, der die grün fluoreszierendes Protein (EGFP) -markierten Gefäß 20, einschließlich Gehäuse und Experimenten verbessert hat, wurde nach den internationalen Richtlinien durchgeführt und wurde von dem lokalen institutionellen Ausschuß genehmigt Tierschutz (Dier Ethische Commissie (DEC) der Leiden University Medical Center. HINWEIS: Wie in Figur 1 zusammengefaßt, wird das Protokoll grob in vier Schritte: Besamungs (Abbildung 1A), die Mikroinjektion (1B), Screening (1C), und die Analyse (Figur 1D). 1. Bereiten die Injektionsnadeln <ol><li> Bereiten Injektionsnadeln mit Borosilikatglas Mikrokapillaren. Legen Sie eine Mikrokapillare in eine Mikropipette Abziehvorrichtung mit den folgenden Einstellungen: Luftdruck, 500; Hitze, 650; ziehen, 100; Geschwindigkeit, 200; Zeit,40. Halten die Injektionsnadeln in einer Nadelhalteplatte, bis sie für die Injektion verwendet werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Fluorescent, Genetisch Beschriftete Brustkrebszellen zur Injektion <ol><li> Kultur menschlicher Brustkrebs MDA-MB-231-Zellen bei 37 ° C in DMEM-Hochglucosemedium, das L-Glutamin, 10% fötalen Rinderserum und 1: 100 Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep). </li><li> Kultur, um die Brust-Epithel-Zelllinien, MCF10A (M1) und MCF10A-Ras (M2), bei 37 ° C in DMEM / F12-Medium, das L-Glutamin mit 5% Pferdeserum, 20 ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor, 10 mg / mL Insulin, 100 ng / ml Cholera-Enterotoxin, 0,5 mg / ml Hydrocortison und 1: 100-Pen-Strep. </li><li> Produzieren mCherry Lentivirus durch Cotransfektion PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22 und pRSV-REV 22 Plasmid in HEK293T - Zellen. Erntezellüberstände 48 Stunden nach der Transfektion und bei -80 ° C. </li><li> ichnfect MDA-MB-231, M1, M2 und Zellen bei 30% Konfluenz für 24 h mit lentiviralen Überstand, verdünnt 1: 1 mit normalen Kulturmedium in Gegenwart von 5 ng / mL Polybren. </li><li> Wählen Einzelzellklone von den Zellen in einer 96-Well-Platte verdünnt wird, die das Auswachsen von isolierten Zellklone ermöglicht, bis die stabilen mCherry-exprimierende Zelllinien zu erhalten. </li><li> Kultur eines T75-Kolben von Zellen zur Injektion. Ernte der Zellen bei 80% Konfluenz mit einer 0,5% Trypsin-EDTA-Behandlung. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS 2-3 mal. </li><li> Resuspendieren der Zellen in etwa 200 &amp; mgr; l PBS. Aufbewahren bei ihnen 4 ° C für weniger als 5 Stunden vor der Injektion. </li></ol> 3. Bereiten Sie Zebrafischembryonen zur Injektion <ol><li> Richten Sie Zebrabärbling Brutpaare und sammeln Embryonen, wie in einem früheren JoVE Artikel von Rosen gezeigt et al. 23. </li><li> Wählen Sie die Embryonen, die bei 0-4 HPF sind durch die unbefruchteten und abnorme Embryonen zu entfernen. Halten Sie die Embryonen in einer Petri-dish voller Ei Wasser (60 &amp; mgr; g / ml Meersalze; ~ 60 Embryonen / Schale) und bei 28 ° C inkubieren. </li><li> Dechorionate die Embryonen mit einer feinen Pinzette bei 48 HPF. </li><li> Anesthetize die Embryonen von ihnen zu 40 ug / ml Tricaine (3-Aminobenzoesäure), das Ei Wasser etwa 2 min vor der Injektion, aber nicht länger als 2 h vor der Injektion zu übertragen. HINWEIS: Tricaine Stammlösung (4 mg / ml, 100x) als 400 mg Tricaine Pulver in 97,9 ml doppelt destilliertem Wasser und 2,1 ml 1 M Tris-Base (pH 9), wobei der pH-Wert auf 7,4 eingestellt. Speicher in der -20 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 4. Inject menschliche Brustkrebszellen in den perivitellinen Raum <ol><li> Last 15 ul der Zellsuspension in eine Injektionsnadel. Montieren die Nadel auf den Mikromanipulator und brechen die Nadelspitze mit einem feinen Pinzette off ein Spitzenöffnungsdurchmesser von 5-10 um zu erhalten. </li><li> Verwenden eines pneumatischen picopump und einen Manipulator, um die Mikroinjektion durchzuführen. adjust die picopump 400 Zellen jedes Mal zu injizieren. Vor der Injektion Zählen der Zellzahlen von Hand durch die Zellen auf der Oberseite einer Petrischale mit 1% Agarose einzuspritzen. </li><li> Line up narkotisierten Embryonen (2-3 Tage nach der Befruchtung (dpf)) auf einer flachen, 1% igen Injektion Platte, rund 10 Embryonen jedes Mal. </li><li> Ausrichten der Einspritzplatte mit der Hand während der Injektionen , die Embryonen zu versetzen , in der bevorzugten Stellung zum Einführen der Nadel (dh diagonal). </li><li> Die Nadelspitze an der Injektionsstelle und sanft die Nadelspitze in den perivitellinen Raum zwischen dem Dottersack und dem periderm des Zebrafischembryos (2A) einzufügen. </li><li> Einzuspritzen etwa 400 mCherry-markierten Tumorzellen. Achten Sie darauf, dass der Dottersack nicht Implantation in den Dottersack zu vermeiden zerrissen wird. </li></ol> 5. Injizieren menschlichen Brustkrebszellen in die Doc <ol><li> Bereiten Sie die Injektionsnadel und Zebrafisch-Embryonen als i beschrieben<html> n Protokollschritte 1, 2 und 3. </li><li> Verwenden, um einen 45 ° Winkel Nadel, so dass der Doc von der dorsalen Seite des Embryos angefahren werden. </li><li> Die Nadel in den Startpunkt der DOC (Figur 3A), um nur dorsal , wo der Kanal beginnt über den Dottersack verbreiterte und injiziert etwa 400 Zellen; die Injektion ist korrekt, wenn das Volumen innerhalb des Kanals unmittelbar nach dem Impuls und den Dottersack expandiert. HINWEIS: Mehrere aufeinanderfolgende Injektionen können, ohne Extraktion der Nadel durchgeführt werden. </li><li> Übertragen Sie die injizierten Zebrabärblingembryonen zu Ei Wasser. HINWEIS: Da erhebliche Unterschiede gibt es zwischen den einzelnen Zebrabärblingembryonen, und wie der Tod von Embryonen nach der Injektion auftreten kann, eine relativ große Anzahl von Zebrabärblingembryonen (ca. 100) soll mit Krebszellen injiziert werden. </li><li> Pflegen die Zebrabärblingembryonen bei 33 ° C, die optimalen Temperaturanforderungen für Fische und Säugetierzellen zu ermöglichen. </li></ol>_title &quot;&gt; 6. Bildschirm, um die injizierten Embryonen <ol><li> Bildschirm jeden Fisches unter einem Fluoreszenz - Stereomikroskop bei 2 h nach der Injektion (hpi) für die Injektions perivitellinen Raumes (2) oder bei 2-24 hpi für die Doc - Injektion (Abbildung 2) , um sicherzustellen , dass alle der Embryonen mit einem injiziert ähnliche Anzahl von Tumorzellen. Entfernen Sie die Embryonen mit Injektionsfehlern, wie Brüchen (2B) oder Injektionen (3B) des Dottersackes und auszusuchen Embryonen mit injizierten Zellen unter (2C und 3B) oder über (Figuren 2D und 3B) Schwellenwert liegt. Behalten Sie nur die Embryonen mit etwa 400 Zellen in Kultur. </li><li> Schließen die Möglichkeit aus, dass die Zellen direkt in den Verkehr während des Injektionsvorgangs eingeführt werden durch die Embryonen zu entfernen mit Zellen, die bereits im Umlauf. Entfernen Sie auch jeden Embryo mit einer Zellmasse nahe dem Doc (2D </strong&gt;). </li></ol> 7. Bild und Analysieren des metastatischen Prozesses <ol><li> Sammle mehrere anästhesiert Embryonen mit einer großen Spitze-Pasteur-Pipette und sie auf dem Glasboden eines Polystyrolschale. </li><li> überschüssiges Wasser entfernen und eine begrenzte Menge an Ei Wasser halten. Manipulieren des Embryos in einer Position mit einem Haarschleife Werkzeug und legt eine Abdeckung auf der Oberseite des Glases. </li><li> Verwenden eines invertierten konfokalen Mikroskop in Kombination mit wasserEintAuchen oder Ferntrocken Ziele. Positionieren Sie den Embryo, so dass die Region von Interesse ist so nahe am Ziel wie möglich. </li><li> Führen Bildgebung unmittelbar nach der Anästhesie der Gefahr des Todes zu verringern durch Flüssigkeitsverdampfung. <ol><li> Capture-Signale von EGFP-markiertem Vaskulatur und mCherry-markierten Tumorzellen an der gleichen Position auf der Embryonen zusammenzuwirken Registerzellen mit Blutgefäße injiziert, indem die beiden bildgebenden Kanäle zu verschmelzen. </li><li> Für jeden Zebrafischembryo, sammeln zwei verschiedene Sätze von Bildernvom Kopfbereich und Schwanzbereich. </li></ol></li><li> Quantifizieren der Anzahl von disseminierten Zellen. <ol><li> Für perivitellinen Raum Injektionen, zählen die Anzahl der Zellen in jedem Fisch, der von der Zellmasse in Richtung der embryonischen Fischkörper in den Kopf- und Schwanzbereichen 4, 15 verbreitet hat; die Regionen über die Grenzen des Herzens Hohlraum auf der Oberseite der Schwimmblase dorsal und jenseits der urogenitalen Öffnung kaudal frontal. </li><li> Für die Doc-Injektion, um die Anzahl der einzelnen Zellen zählen, die die Kollagenfasern des tailfin aus dem Kreislauf (MDA-MB-231) oder die Anzahl von Clustern, die durch Zellen gebildet kollektiv (M2) im kaudalen hämatopoetische Geweben (CHT) von eingedrungenen jeder Zebrafisch 19. </li></ol></li><li> Studium der Invasion und Metastasierung im Detail durch konfokale Mikroskopie (sehr empfehlenswert). <ol><li> Verwenden geringe Vergrößerung (4X Objektiv) das Bild der ganzenKörper und einen Überblick über die Tumorzelldissemination Muster zu erhalten. HINWEIS: Ein stärkere Vergrößerung (20X und 40X Ziele) ist geeignet zur Untersuchung von intra- und peri-tumorale Angiogenese und die genaue Lokalisierung von disseminierten Zellen im Embryo Körper. </li><li> Verwenden, um einen 488-nm-Laser den Zebrafischembryo Vaskulatur und einen 543 nm-Laser gescannt implantierten Tumorzellen mit roter Fluoreszenz markierte abzutasten. Besorgen Sie sich ein qualitativ hochwertiges Bild durch Abtasten jeden Embryos in acht bis zehn Schritten. Scannen und im Durchschnitt jeden Schritt sechsmal. </li></ol></li><li> Legen Sie das Embryo wieder in das Ei Wasser, wenn es für weitere Experimente erforderlich ist. </li></ol> 8. Führen Sie Statistische Auswertung mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) , gefolgt von Post - Hoc - Analyse

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir beschrieben , zwei Methoden , um das invasive Verhalten von Brustkrebszellen in Tg (FLI1: EGFP) zu untersuchen Zebrabärblingembryonen, mit perivitellinen Raum und Doc - Injektionen. Durch die Injektion mit chemischen Farbstoff markiert Krebszellen oder fluoreszierendem Protein in transgene Zebrafischembryonen, die dynamischen und räumlichen Eigenschaften der Invasion und Metastasierung können deutlich an der Einzelzelle oder Clusterebene unter einem Fluoreszenzmikroskop in Echtzeit verfolgt werde...

Offenkundige Krebsmetastasen in der Klinik weisen eine Reihe von komplexen und mehrstufiges Ereignissen als „metastatic cascade“ bekannt. Die Kaskade wurde ausführlich überprüft und können in aufeinanderfolgende Schritte zerlegt werden: lokale Invasion, intravasation, Verbreitung, Festnahme, Extravasation und Kolonisierung 1, 2. Ein besseres Verständnis der Pathogenese von Krebsmetastasen und der Entwicklung von möglichen Behandlungsstrategien in vivo erfordert robuste Host - Modelle von Krebszellen zu verbreiten. Nagetiermodelle sind gut etabliert und werden verwendet , weit Metastasierung 3 zu bewerten, aber diese Ansätze haben eine geringe Effizienz und ethische Grenzen und sind teuer als Vordergrund Modell zu bestimmen , ob eine bestimmte Manipulation des metastatischen Phänotyp beeinflussen könnte. Andere effiziente, zuverlässige, kostengünstige Modelle sind notwendig, um schnell die möglichen Auswirkungen des Zugangs (epi) genetische Veränderungen oder pharmacologische Verbindungen. Aufgrund ihrer hohen genetischen Homologie zu den Menschen und die Transparenz ihrer Embryonen Zebrabärbling (Danio rerio) haben als ein wichtiges wirbel Modell entstanden und zunehmend auf die Untersuchung von Entwicklungsprozessen angewendet werden, mikroben Wirt - Interaktionen, menschliche Krankheiten, Drogen - Screening, etc. . 4. Die Krebsmetastasen Modelle in Zebrabärbling erstellt wurden, können eine Antwort auf die Mängel von Nagetiermodellen bieten 5, 6. Obwohl spontaner Neoplasie kaum in Wild Zebrabärbling 7 zu sehen ist gibt es mehr Techniken seit langem des gewünschten Krebs in Zebrabärbling zu induzieren. Karzinogen-induzierte Gen - Mutationen oder Signalwegs - Aktivierung können in menschliche Krankheit Zebrabärbling 7, 8, 9 und histologisch molekular Modell des Karzinogenese, nachahmt. durch taking Vorteil von verschiedenen Vorwärts- und Rückwärts genetische Manipulationen von Onkogenen oder Tumorsuppressoren, (transgene) Zebrabärbling hat auch potentielle Studien der Krebsentstehung und Wartung 6, 10 aktiviert. Die induzierten Krebsmodelle in Zebrabärbling decken ein breites Spektrum, einschließlich Verdauungs-, Fortpflanzungs-, Blut, Nervensystem, und epithelialen 6. Die Nutzung von Zebrabärbling in der Krebsforschung hat sich durch die Etablierung von humanen Tumorzell Xenograftmodellen in diesem Organismus vor kurzem erweitert. Dies wurde zuerst mit humanen metastasierenden Melanom - Zellen berichtet , dass im Jahr 2005 11 an dem Blastulastadium in Zebrabärblingembryonen erfolgreich transplantiert wurden. Mehrere unabhängigen Labors haben die Machbarkeit dieser Pionierarbeit validiert durch ein breites Spektrum von Säugetierkrebszelllinien in Zebrabärbling an verschiedenen Standorten und Entwicklungsstadien der Einführung 5 &lt;/ Sup&gt;. Zum Beispiel Injektionen in der Nähe der Blastulascheiben und Blastozyste der Blastulastadium; Injektionen in den Dottersack, perivitellinen Raum, Kanal von Cuvier (Doc) und posterioren Kardinalvene von 6-h- bis 5 Tage alten Embryonen; und Injektionen in die Bauchhöhle von 30 Tage alten immunsupprimierten Larven wurden 5 durchgeführt, 12. Zusätzlich wurden allogenen Tumor Transplantationen auch in Zebrabärbling berichtet 12, 13. Einer der großen Vorteile von Xenotransplantaten ist, dass die transplantierten Krebszellen fluoreszenz kann leicht gekennzeichnet und unterscheiden sich von normalen Zellen. Daher Untersuchungen über das dynamische Verhalten von microtumor Bildung 14, Zellinvasion und Metastasierung 15, 16, 17, tumorinduzierte Angiogenese 15, 18, und die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Wirtsfaktoren 17 in lebenden Fischen Körper deutlich sichtbar gemacht werden, vor allem , wenn transgene Zebrabärbling Linien 5 angewendet werden. Angeregt durch das hohe Potential von Zebrabärbling Xenograftmodellen Metastasierung zu bewerten, haben wir gezeigt , die transvaskulärer Extravasation Eigenschaften verschiedener Brustkrebszelllinien in dem tailfin Bereich von Tg (FLI: EGFP) Zebrabärbling - Embryonen durch Doc Injektionen 16. Die Rolle von transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-β) 16 und bone morphogenetic protein (BMP) 19 Signalweg in pro- / Anti-Brustkrebs-Zellinvasion und Metastasierung wurden auch in diesem Modell untersucht. Darüber hinaus haben wir rekapituliert auch die intravasation Fähigkeit verschiedener Brustkrebszelllinien in Umlauf Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit perivitellinen Raum Injektionen. <p class = „jove_content“&gt; Dieser Artikel stellt detaillierte Protokolle für Zebrabärbling Xenograftmodellen basiert auf der Injektion von menschlichen Brustkrebszellen in den perivitellinen Raum oder Doc. Verwendung von hochauflösenden Fluoreszenzabbildung zeigen wir den repräsentativen Prozess der intravasation in Blutgefäße und das invasiven Verhaltens von verschiedenen menschlichen Brustkrebszellen, die aus den Blutgefäßen in den avaskuläre tailfin Bereich bewegen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>MP Biomedicals</td><td>AGAF0500</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td> Kapillar-Harvard-Gerät <td></td><td>300038</td><td></td></tr><tr><td>Cholera-Enterotoxin&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>227035</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>SP5 STED</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Medien mit hohem Glukosegehalt, die L-Glutamin enthalten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12-Medien, die L-Glutamin enthalten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21041025</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zelllinie</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>SigmaAldrich</td><td>227035</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>SigmaAldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A (M1) Zelllinie</td><td></td><td></td><td>Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) &nbsp;</td></tr><tr><td>MCF10Aras (M2) Zelllinie</td><td></td><td></td><td>Mit freundlicher Verfügung gestellt von Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Zelllinie</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Manueller Mikromanipulator&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipette mit breiter Spitze (0,5-20 & Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>F276456I</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSVG-Plasmid</td><td></td><td></td><td>Mit freundlicher Bereitstellung von Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PLV-mCherry Plasmid</td><td>Addgene</td><td>36084</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg-RRE (gag/pol) Plasmid</td><td></td><td></td><td>Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande)</td></tr><tr><td>Pneumatisches PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>SigmaAldrich</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 4 Software</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRSV-REV Plasmid</td><td></td><td></td><td>Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande)</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Tg (fli:EGFP) Zebrafischstamm</td><td></td><td></td><td>Mit freundlicher Verfügung gestellt von Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, Niederlande)</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>SigmaAldrich</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (3-Aminobenzoesäure)</td><td>SigmaAldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, Polystyrol (60 > 15 mm)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrolschale mit Glasboden</td><td>WillCo</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

invasive verhalten von menschlichen brustkrebszellen in embryonalem zebrabärbling

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In vielen Fällen Krebspatienten sterben nicht von einem Primärtumor, sondern wegen der Metastasierung. Obwohl zahlreiche Nagetiermodelle zur Untersuchung von Krebsmetastasen in vivo zur Verfügung stehen, andere effizient, zuverlässig, sind Low-Cost - Modelle benötigt , um schnell die möglichen Auswirkungen von (epi) genetischen Veränderungen oder pharmakologischer Verbindungen zugreifen. Als solche wir veranschaulichen und die Machbarkeit der Xenograftmodellen mit menschlichen Brustkrebszellen injiziert in Zebrabärblingembryonen erklären, dieses Ziel zu unterstützen. Unter dem Mikroskop sind in transgene Zebrafischembryonen transplantiert fluoreszierende Proteine oder chemisch markierte menschliche Brustkrebszellen, Tg (FLI: EGFP), am perivitellinen Raum oder Kanal Cuviers (DOC) 48 h nach der Befruchtung. Kurz darauf der räumlich-zeitliche Prozess der Invasion von Krebszellen, die Verbreitung und die Metastasierung im lebenden Fischkörper wird unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Modelle mit unterschiedlichen Injektionsstellen, dh proivitelline Raum oder Doc ist komplementär zueinander, was das frühe Stadium (intravasation Schritt) und Spätstadium (Extravasation Schritt) der vielstufigen metastatischen Kaskade von Ereignissen. Darüber hinaus kann peritumoralen und intratumorale Angiogenese mit der Injektion in den perivitellinen Raum beobachtet werden. Die gesamte Versuchsdauer nicht mehr als 8 Tage. Diese beiden Modelle kombinieren Zellmarkierung, Mikro-Transplantation, und Fluoreszenz-Bildgebungstechniken, ermöglicht die schnelle Auswertung von Krebsmetastasen in Reaktion auf genetische und pharmakologische Manipulationen.

Im embryonalen Xenotransplantat Zebrabärbling-Modell mit einer perivitellinen Raum Injektion, die hämatogene Verbreitung von markierten Krebszellen im Fischkörper als aktive Migration betrachtet. Dieser Prozess kann unter einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen und quantifiziert werden, wie oben bei den Verfahren beschrieben. Um dieses Xenograftmodell veranschaulicht, folgten wir den Verbreitungsprozess verschiedener Brustkrebs-Zelllinien mit bekannter (oder ohne) invasion / Metastasieru...

Hier beschreiben wir Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit zwei verschiedenen Injektionsstellen, dh perivitellinen Raum und Kanal von Cuvier, das invasive Verhalten zu untersuchen und die intravasation und Extravasation Potential von menschlichen Brustkrebszellen zu bewerten sind.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Das übergeordnete Ziel dieser Mikroinjektion menschlicher Brustkrebszellen in embryonale Zebrafische besteht darin, das invasive Verhalten zu untersuchen und das metastatische Potenzial menschlicher Brustkrebszellen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Intravasation und Extravasation als kritische Prozesse in der Krebsmetastasierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein elegantes, schnelles und kostengünstiges In-vivo-Modell bereitstellt, um die Fähigkeit von Krebszellen zur Invasion und Metastasierung zu messen.Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Entwicklung neuer pharmakologischer Verbindungen mit anti-metastatischer Wirkung. Obwohl diese Methode Einblicke in die Krebsdissemination und Metastasierung ermöglicht, kann sie auch zur Untersuchung anderer Phänomene eingesetzt werden, wie beispielsweise der peritumoralen Angiogenese und der Ruhephase von Krebszellen. Beginnen Sie damit, transduzierte humane Brustkrebszellen MDA-MB-231, Brustepithelzellen MCF10A und Brustepithelzellen MCF10A-Ras in einem T75-Fläschchen zu kultivieren.Sobald die transduzierten Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, entfernen Sie das Medium aus dem T75-Fläschchen, waschen die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und lösen die Zellen mit 0,5 %iger Trypsin-EDTA-Lösung ab. Anschließend neutralisieren Sie das Trypsin mit Medium. Danach zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 U/min fünf Minuten lang, um das Medium zu entfernen, waschen sie mit PBS und zentrifugieren die Probe ein weiteres Mal.Nach dem Waschen die Zellen in etwa 200 Mikroliter PBS resuspendieren, um eine Suspension mit maximal 1 × 10⁸ Zellen pro Milliliter zu erhalten. Die Zellsuspension bei vier Grad Celsius nicht länger als fünf Stunden lagern. Um Zebrafischeier für die Implantation vorzubereiten, etwa 60 Embryonen in einer Petrischale mit Ei-Wasser inkubieren, das mit 60 Mikrogramm pro Milliliter Meersalz ergänzt und bei 28 Grad Celsius gehalten wird.Entfernen Sie anschließend mit feinen Pinzetten die Koriander aus den Embryonen 48 Stunden nach der Befruchtung. Um die Embryonen für den Implantationsvorgang zu betäuben, überführen Sie sie in eine Lösung mit 40 Mikrogramm pro Milliliter Tricain in Ei-Wasser. Bereiten Sie vor der Implantation Injektionsnadeln vor.Laden Sie ein Borosilikat-Mikrokapillar in einen Mikropipettenzieher ein und ziehen Sie die Nadel. Bewahren Sie die vorbereiteten Nadeln bis zur Verwendung in einer Nadelaufbewahrungsplatte auf. Saugen Sie 15 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension in eine Injektionsnadel auf.Befestigen Sie als Nächstes die Nadel an einem Mikromanipulator und brechen Sie mit feinen Pinzetten deren Spitze auf fünf bis zehn Mikrometer ab. Stellen Sie die pneumatische PICO-Pumpe ein und injizieren Sie Zellen in die Petrischale, die zuvor mit sterilem 1 % Agarose beschichtet wurde. Überführen Sie anschließend etwa 10 anästhetisierte Embryonen im Alter von zwei bis drei Tagen nach der Befruchtung auf eine flache Injektionsplatte, die mit 1 % Agarose beschichtet ist.Ordnen Sie die Position der Embryonen mit einem Haarschleifenwerkzeug so an, dass sie alle in dieselbe Richtung ausgerichtet sind. Während der Injektion passen Sie manuell die Position der Injektionsplatte an, um die Embryonen diagonal auszurichten, da dies für eine präzise Nadeleinführung bevorzugt wird. Richten Sie die Nadelspitze auf die Injektionsstelle und führen Sie sie vorsichtig in den perivitellinen Raum ein, der sich zwischen dem Dottersack und dem Paraderm des Zebrafisch-Embryos befindet.Zuletzt etwa 400 mit mCherry markierte Tumorzellen injizieren. Achten Sie darauf, den Dottersack nicht zu verletzen, um eine fehlplatzierte Implantation zu vermeiden. Um die Zellen in den Ductus Cuvieri zu injizieren, nähern Sie sich der Vene von der dorsalen Seite des Embryos aus, wobei die Nadel in einem Winkel von 45 Grad gehalten wird.Führen Sie die Nadel an der Startposition des Ductus Cuvieri ein, der dorsal zu der Stelle lokalisiert ist, an der sich der Ductus über dem Dottersack erweitert. Injizieren Sie anschließend etwa 400 Zellen. Überführen Sie schließlich die injizierten Zebrafischembryonen in Ei-Wasser und inkubieren Sie sie bei 33 Grad Celsius bis zur weiteren Analyse.Um die Metastasierung zu visualisieren, überführen Sie mit einer Pasteurpipette das injizierte Zebrafisch-Embryo in eine Glasboden-Polystyrol-Schale und entfernen Sie überschüssiges Ei-Wasser. Bilden Sie den gesamten Körper des Embryos mit einem konfokalen Mikroskop bei niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung ab, um ein allgemeines Muster der Tumorzellverbreitung zu erhalten. Verwenden Sie einen 488 Nanometer-Laser, um die Gef&auml;&szlig;struktur des Zebrafisch-Embryos sichtbar zu machen, und einen 543 Nanometer-Laser, um implantierte Tumorzellen, die mit einem roten fluoreszierenden Marker markiert sind, zu visualisieren.Als Nächstes scannen Sie das Embryo in acht bis zehn Schritten, um ein hochwertiges Bild zu erhalten. Hier dargestellt sind Aufnahmen von Zebrafisch-Embryonen, die drei Tage nach der perivitellinen Injektion von MDA-MB-231-Zellen mit einem konfokalen Mikroskop angefertigt wurden. Die MDA-MB-231-Zellen hatten sich weitreichend im Körper des Zebrafisches ausgebreitet und zeigten ein hohes invasives Potenzial.MCF10A-Ras-Zellen zeigten nach Implantation in Zebrafischembryonen eine moderate Invasivität, wobei nur wenige Zellen in entfernte Körperteile vordrangen. Nach Transplantation blieben MCF10A-Zellen nicht invasiv und konzentrierten sich am Injektionsort, was bestätigt, dass alle untersuchten Zellen unterschiedliches invasives Potenzial aufweisen. Der stark invasive Charakter der MDA-MB-231-Zellen spiegelte sich in ihrer erhöhten Migrationskapazität wider, die im perivitellinen Raum beobachtet wurde.In gewissem Maße wurde eine solche Migration auch für MCF10A-Ras-Zellen beobachtet. Im Gegensatz dazu migrierten MCF10A-Zellen nicht im perivitellinen Raum. Ein unterschiedliches metastatisches Verhalten von MDA-MB-231- und MCF10A-Ras-Zellen zeigte sich ebenfalls, wenn beide Zelltypen in den Ductus Cuvieri der Embryonen implantiert wurden.Wie gezeigt, wanderten die MDA-MB-231-Zellen unabhängig voneinander, während die MCF10A-Ras-Zellen dazu neigten, in Zellhaufen zu migrieren. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Untersuchungen wie beispielsweise die Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, etwa wie Krebszellen sich im Zebrabärbling vermehren und wie sie die umgebenden Wirtszellen beeinflussen. Nach Anschauen dieses Videos werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Zebrabärbling-Modell verwendet, um das invasive Verhalten sowie die Intravasations- und Extravasationskapazität menschlicher Brustkrebszellen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode für die Verabreichung von Brustkrebszellen in den perivitellinischen Raum von transgenen Zebrafischembryonen. Nach der Inkubation visualisieren wir den Embryo unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Invasion, Verbreitung und Metastasierung von Krebszellen zu beobachten.

zPDX-Analyse der Invasivität: Untersuchung des invasiven Verhaltens von metastasierten Krebszellen in Zebrafischembryonen Xenotransplantaten

Eine schnelle Weg zum Bildschirm für die Melanom-Modifikatoren mit einem Zebrafisch autochthonen Tumormodell vorgestellt. Es nutzt die miniCoopR Vektor, der zur Expression von Melanom-Kandidat Gene in Melanozyten ermöglicht. Verfahren zur Melanom Überleben Kurven, eine Invasion Assay, ein Protokoll für Antikörperfärbung Maßstab von Melanozyten und Melanomzellen eine Transplantation Assay erhalten werden beschrieben.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Dieses Verfahren nutzt Zebrabärblingembryonen effizient die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen. Fluoreszierende Krebszellen werden in den precardiac Sinus oder Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert. Krebszelle Gefäßinvasion und Extravasation wird über Fluoreszenzmikroskopie des Heckbereich 24 bis 96 Stunden später bewertet.

Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Die Transplantation von Krebszellen ist ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Krebsmechanismen und therapeutischen Reaktionen. Aktuelle Techniken hängen von immune-inkompetenten Tieren ab. Hier beschreiben wir eine Methode zur Transplantation von Zebrafisch-Tumorzellen in immunkompetenten Embryonen zur Langzeitanalyse des Tumorzellverhaltens und in vivo- Arzneimittelwirkungen.

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Ziel dieser Methode ist es, ein In-vivo-Modell der Tumorangiogenese zu generieren, indem Säugetiertumorzellen in einen Zebrafisch-Embryo mit fluoreszierend gekennzeichneten Blutgefäßen gexlüftet werden. Durch die Abbildung des Xenografts und der zugehörigen Gefäße kann eine quantitative Messung der angiogenen Reaktion erreicht werden.

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Zebrafish Xenograft-Modelle ermöglichen ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening und eine fluoreszierende Bildgebung menschlicher Krebszellen in einer in vivo Mikroumgebung. Wir haben einen Workflow für großangelegte, automatisierte Arzneimitteluntersuchungen an von Patienten abgeleiteten Leukämieproben in Zebrafischen mit hilfe einer automatisierten Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungseinheit entwickelt.

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Hier wird eine Methode beschrieben, mit der Zebrafischembryonen verwendet werden können, um die Fähigkeit funktionalisierter Nanopartikel zu untersuchen, menschliche Krebszellen in vivo anzugreifen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung und Auswahl optimaler Nanopartikel für zukünftige Tests bei Großen Tieren und in klinischen Studien.

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit voller Montätralisierung und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Diese Arbeit stellt die Methode der Entwicklung, Charakterisierung und Verfolgung in Echtzeit der Tumormetastasierung im Zebrafischmodell des Neuroblastoms vor, insbesondere in der transgenen Zebrafischlinie mit Überexpression von MYCN und LMO1, die spontan Metastasen entwickelt.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Xenotransplantation in das Eigelb von transparenten Zebrafischembryonen, das durch eine einfache, schnelle Staging-Methode optimiert wird. Die Analysen nach der Injektion umfassen das Überleben und die Beurteilung der Krankheitslast von xenotransplantierten Zellen durch Durchflusszytometrie.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Erfahren Sie die Mikroinjektion menschlicher Brustkrebszellen in embryonale Zebrabärblinge zur Untersuchung invasiven Verhaltens und Metastasierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Intravasation und Extravasation in vivo.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

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