Name: Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Lernen Sie die Reinigung hochmolekularer genomischer DNA aus Echten Mehltau-Konidien für Long-Read-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung komplexer Pilzgenome und Pflanzen-Pathogen-Interaktionen.

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Dieses Protokoll wurde zur Unterstützung eines Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657) entwickelt. Die Arbeit wurde teilweise unterstützt von der Philomathia Foundation, der National Science Foundation (#0929226) und dem Energy Biosciences Institute to S. Somerville; und vom Schweizerischen Nationalfonds (#310030_163260) an B. Keller. Wir danken unseren Kollegen M. Figureroa und M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) und S. Xiao (University of Maryland) für ihre großzügige Beratung und dafür, dass sie ihre Protokolle freiwillig zur Verfügung gestellt haben, während wir das hier beschriebene Protokoll entwickelt haben.

1. Herstellung von Pilzmaterial <ol><li> Wachsende Echten Mehltaus <ol><li> Wachsen Pflanzen in Wachstumskammern mit den folgenden Bedingungen: 22 ° C Tagestemperatur, 20 ° C Nachttemperatur, 80% relative Luftfeuchtigkeit, 14 h Tag-Länge und eine Lichtintensität von 125 &amp; mgr; E / m 2 / s (bereitgestellt von Leuchtstofflampen ). </li><li> Infect Gurkenpflanzen (Cucumis sativa Sorte Bush Meister) mit Golovinomyces cichoracearum Stamm UCSC1 wie beschrieben 18, 29. </li></ol></li><li> Ernte Echten Mehltaus Konidien <ol><li> Ernte Konidien von infizierten Pflanzen auf 7 bis 10 Tage nach der Inokulation ein kleines Vakuum mit einem in-line-Filter (11 &amp; mgr; m), auf dem die Konidien akkumulieren. Leichten Druck, führen Sie die Vakuumdüse entlang der Oberfläche des Blattes der Konidien zu sammeln. HINWEIS: Die durchschnittliche Ausbeute von G. cichoracearum beträgt 20 mg von Konidien aus einem stark InFECTED Gurkenblatt von etwa 130 cm 2 Fläche. </li><li> Bürste um 150 mg der Konidien (ungefähr 375 &amp; mgr; l Volumen oder Konidien 7-8 infizierte Gurkenblätter) von dem Filter auf ein Blatt Papier sauber. Von hier aus übertragen Konidien in 2 ml-Kryoröhrchen mit zwei 5/32-Zoll-Durchmesser vorge gekühlt (in flüssigem Stickstoff) Stahl Mahlkugeln. Unmittelbar Rohre flüssigen Stickstoff zurück. Speicher Röhrchen bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Brechen öffnen Konidien durch Kugelmahlen <ol><li> Flash Aluminiumplatten der Kugelmühle in flüssigem Stickstoff einzufrieren. Last Kryoröhrchen in Kugelmühlenständer. Kräftig schütteln die Kryoröhrchen mit Konidien und Stahlkugeln in der Kugelmühle für 30 s bei 30 Zyklen / s (bei Raumtemperatur). Unmittelbar Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff wieder einfrieren. HINWEIS: Am Anfang Zugriff auf eine Probe von Konidien durch Mikroskopie bei 100-facher Vergrößerung für die Effizienz der Zellwand Bruch während des Schleifens. Bei Bedarf mahlt für weitere 1 bis 2 Runden von 30 s für 30 Zyklen / s, but hält die Anzahl der Runden auf ein Minimum. Routine Beurteilung der konidiale Bruch durch Mikroskopie in diesem Stadium ist nicht erforderlich, wenn optimale Bedingungen festgelegt wurden. </li></ol></li></ol> 2. Genomic DNA Purification <ol><li> Konidien Lysis <ol><li> schnell arbeitet Auftauen Konidien zu vermeiden, die Stahlkugeln aus Kryovials mit einem Magneten entfernen. Hinzufügen 700 &amp; mgr; l 65 ° C Lysepuffer (Tabelle 1) und vortex von 5 bis 10 s , bis eine Aufschlämmung gebildet wird. </li><li> Hinzufügen von 300 &amp; mgr; l vorgewärmtes (65 ° C) 5% (v / v) Sarkosyl und sanft invertieren mischen (1 Invertierung pro 3 s) fünfmal. Die Röhrchen für 30 min bei 65 ° C; invertieren sanft 3-mal bei 10, 20 und 30 min. Unter Verwendung einer Breitbohrungspipettenspitze übertragen gesamte Lösung neues 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. In allen nachfolgenden Schritten, Mischung durch schonendes, langsames Inversion und überträgt die DNA-haltige Lösungen mit weiter Bohrung Pipettenspitzen. </li></ol></li><li> DNA-Extraktion I <ol><li> 1 Volumen von ChlorForm: Isoamylalkohol (24: 1 v / v) zu der Lyselösung und sanft invertieren fünfmal zu mischen. Inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur, auf halber Strecke fünfmal zu mischen und erneut am Ende der Inkubation vorsichtig invertieren. Zentrifuge bei Raumtemperatur für 15 min bei 14.000 x g. Breitbohrungspipettenspitze, überträgt sorgfältig die wässrige Schicht zu neuen 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen; einschließlich Material von der Oberfläche vermeiden. </li></ol></li><li> DNA-Niederschlag I <ol><li> 1 Volumenraumtemperatur 100% Isopropanol (etwa 750 ul) und Invertzucker sanft sechsmal zu mischen. Zentrifuge bei Raumtemperatur für 15 min bei 14.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. </li><li> Hinzufügen 450 ul vorgekühlten (-20 ° C) 70% Ethanol. Zentrifuge 5 min bei Raumtemperatur bei 14000 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. Zentrifuge bei 1000 × g für 3 s, entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit feiner Pipettenspitze und entsorgen. Luft-Trocknen des Pellets für 15 min eint Raumtemperatur. Trocknen Sie nicht länger als 15 min. </li><li> Das Pellet in 300 ul TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM Ethylendiamintetra-Essigsäure, pH 8,0). Inkubiere über Nacht bei 4 ° C. Flick vorsichtig jegliches Restmaterial zu suspendieren, die nicht in Lösung ging. </li></ol></li><li> Um RNA-Kontamination zu entfernen, mit 10 ul RNase A (10 mg / ml). vorsichtig umdrehen dreimal zu mischen. Zentrifuge bei 1000 × g für 3 s. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h. </li><li> II DNA Extraction <ol><li> In 300 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1 v / v) und vorsichtig invertieren fünfmal zu mischen. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur sanft am Ende der Inkubation bei der Halbzeit fünf Mal zu mischen und wieder umgekehrt wird. Zentrifuge 15 min bei Raumtemperatur bei 14000 x g. Unter Verwendung einer Breitbohrungspipettenspitze, den Überstand in neue 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> DNA-Präzipitation II <ol><li> 0.01 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 (approximately 3 &amp; mgr; l), invertieren fünfmal sanft zu mischen. Hinzufügen 2,5 Volumen vorgekühlten (-20 ° C) 100% Ethanol (etwa 750 ul). vorsichtig umdrehen fünf Mal mischen. Inkubieren über Nacht bei -20 ° C </li><li> Zentrifuge 30 min bei 4 ° C bei 14000 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. </li><li> Hinzufügen 450 ul vorgekühlten (-20 ° C) 70% Ethanol. Zentrifuge 5 min bei 4 ° C bei 14000 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. Zentrifuge bei 1000 × g für 3 s. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit feiner Pipettenspitze und entsorgen. </li><li> Luft-Trocknen des Pellets für 30-60 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren des Pellets in 27,5 &amp; mgr; l TE. Inkubiere über Nacht bei 4 ° C. Flick vorsichtig jegliches Restmaterial zu suspendieren, die nicht in Lösung ging. </li><li> 2,5 ul Aliquot in 22,5 &amp; mgr; l TE (Endvolumen 25 ul) für Qualitätskontrolltests (siehe unten). Store-DNA-Proben bei 4 ° C bis zur Vorlage für die Sequenzierung. Für die langfristige Lagerung, Aufbewahrung von ProbenGefrier-Auftau-Zyklen bei -80 ° C und Scher minimieren zu verhindern. HINWEIS: Achten Sie bei bei diesem Schritt als hochmolekulare genomische DNA Pipettieren kann schwierig sein, richtig zu pipettieren, und es ist wichtig, um sicherzustellen, dass „QC Aliquot“ ist eine genaue Darstellung der genomischen DNA-Probe. </li></ol></li></ol> 3. Qualitätskontrolle <ol><li> Probe Reinheit <ol><li> Verwendung eines TE blank, beurteilen die Probe Reinheit der DNA durch Laden von 1 &amp; mgr; l Aliquot des QC auf einem kleinvolumigen Spektrophotometer. Nehmen Sie A260 / A280 und A260 / A230 Lesungen. Reine DNA wird ein A260 / A280-Verhältnis von etwa 1,8 und A260 / A230-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,2 aufweist. </li></ol></li><li> Quantifizierung von genomischer DNA <ol><li> Führen Quantifizierung von QC Aliquot Kommerzielle doppelsträngige DNA Quantifizierungsassay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> DNA Quality Assessment I <ol><li> Last etwa 60 ng genomische DNA und eineDNA-Leiter auf einem 0,7% Agarosegel in 1X TAE (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA, pH 8,0). Führen Gelvorrichtung bei 70 V für 40 bis 45 min bis genomische DNA-Banden sind ungefähr 2 cm von dem Bohrloch und Bandtrennung in dem Leiter ist offensichtlich. Diese Bedingungen müssen basierend auf den verfügbaren Gelelektrophorese Vorrichtung angepasst werden. </li></ol></li><li> DNA Quality Assessment II <ol><li> Last etwa 60 ng genomischer DNA und einen hochmolekulare DNA-Leiter (geeignet für Pulsfeld-Gel-Elektrophorese) auf einem 1% igen Agarosegel in 0,5 × TBE (44,5 mM Tris, 44,5 mM Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8,3) und läuft in 0,5x TBE Laufpuffer unter Verwendung eines 5 - 80 kbp Wellenform Pulsfeld-Gel-Elektrophorese-Protokoll für 16 h. </li></ol></li><li> Beurteilung von Bakterien-, Pilz- und Pflanzen Kontaminanten <ol><li> Durchführen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die entsprechenden internen transkribierten Abstandshalter (ITS) Regionen der ribosomalen Gene zu amplifizieren unter Verwendung der Primer und Amplifikationsbedingungen Listeed in Tabelle 2. Last 10 &amp; mgr; l der erhaltenen Reaktions auf einem Gel. HINWEIS: Eine Bande, die den echten Mehltau ITS-Region sollte mit dem Pilz-ITS-Primer amplifiziert werden. DNA aus diesem Amplicon und jeden erzeugten Amplikons mit den bakteriellen, pflanzlichen oder Primer sollte den Ursprung der Verunreinigung zu bestimmen, sequenziert werden. Nur Mehltau ITS-Sequenzen sollten in der Pilz-Amplikon zu finden. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Um rein, hochmolekulare genomische DNA aus den obligaten biotrophe echten Mehltaupilzen zu erhalten, eine modifizierte Version des zuvor beschriebenen Verfahrens wurde 30 entwickelt. Die durchschnittliche Ausbeute dieses optimierten Protokoll 7 ug DNA pro 150 mg Konidien, eine Verdoppelung der Ausbeute bei einem früheren Protokoll erhalten. Auch erhöhte sich die durchschnittliche Größe von etwa 20 kbp auf über 48,5 kbp. Dieses Protokoll wurde in dem Gurken- G. cichoracearum System optimi...

<html> Echte Mehltaupilze sind eine Gruppe von obligater biotrophen pilzliche Pflanzenpathogene , dass, wenn sie zusammengenommen, ist die größte Ursache für Pflanzenkrankheiten weltweit 1. Es gibt über 900 beschriebene Arten von Mehltau, der taxonomisch in fünf Stämme innerhalb der Familie Erisyphaceae 2 zusammengefasst wurde. Sowohl auf ihre wirtschaftlichen Bedeutung und die intimen Beziehung, die sie mit ihren Wirten zu entwickeln haben, Mehltau Krankheiten für&gt; 100 Jahre sind der Gegenstand der Forschung. Bei Infektion, entlocken Echte Mehltau drastische Veränderungen in der Zellstruktur, den Stoffwechsel und Molekularbiologie ihrer Wirte, diese Erreger zu profitieren. Das Studium der Echten Mehltau ist jedoch besonders schwierig aufgrund ihres obligater Lebensstil, und das Wachstum des Pilzes in Reinkultur ist noch nicht 3 beschrieben wurde, 4, 5,&quot;Xref&quot;&gt; 6, 7, 8. Zuverlässige, stabile genetische Transformation von Echten Mehltau hat auch noch nicht erreicht worden, obwohl transiente Transformation 9 bei einigen Arten berichtet, 10. Die Sequenzierung und Montage von Echtem Mehltau Genome hat sich als schwierig erwiesen, aufgrund einer Reihe von Merkmalen des Genoms selbst. Mehltaus Genomen sind groß (120-180 MBP) relativ zu anderen Pilz-Genomen, und bestehen aus 60 bis 90% gleichmäßig verteilt repetitiven Elementen 11. Diese Elemente sind nicht-long terminal repeats, sowie uncategorized repetitive Elemente. Zwei formae speciales einer einzigen echten Mehltau - Arten, Blumeria graminis f. sp. hordei und f. sp. tritici (Bgh und Bgt, respectively) sowie die Traubenmehltau Erysiphe necator, haben Bienenn sequenziert und Entwurf Genomen für mehr andere wurde 12 abgeschlossen, 13, 14. Die sich wiederholenden Natur der Genome hat Montage erschwert und das fertige Bgh - Genom wurde in 6.989 supercontigs mit L50 von 2 Mb 12 montiert. Trotz des großen Genoms scheint der Echte Mehltau eine kleine Anzahl von Protein - kodierenden Genen zu haben, mit 5.845 und 6.540 Genen vorhergesagt in Bgh und Bgt ist. Die sequenzierten echte Mehltaue scheinen auch mindestens 99 Kern Gene zu fehlen , die in anderen Pilzen wesentlich sind, die mit der Abhängigkeit der Pilze auf ihrer Wirtspflanze für das Überleben 11, 12, 13, 14 im Einklang steht. Repetitive Sequenzen nahe Telomere, Centromere, ribosomale RNEin Gen - Arrays und Regionen in transponierbaren Elementen angereichert sind schlecht aus Kurz gelesen Sequenzierungsstrategien zusammengesetzt und sind oft unterrepräsentiert in Genomanordnungen 15. Solche Bereiche für viele der Lücken verantwortlich sein wird angenommen , dass in Genomsequenzen auftreten, und dies gilt auch für die echte Mehltaue mit ihren umfangreichen Erweiterung von repetitiven Elementen 16. Highly Kunststoff Genomregionen oft in einem solchen repetitiven Regionen 3 gefunden. Sie dienen als Gebiet von Chromosomenumlagerungen und oft codieren Gene unter starkem Selektionsdruck, wie beispielsweise die Gene, die für Proteine ​​Effektor und die Gene Enzyme des Sekundärstoffwechsels kodieren. Die Fortschritte in der Einzelmolekül - Lang lesen Sequenzierungstechnologien bieten eine mögliche Lösung für die Sequenzierung durch sich wiederholende Regionen von Genomen 15. Zum Beispiel Faino et al. (2015) fanden heraus, dass auch lange Sequenz gelesen Technologien und m optischenapping ließ sie für zwei Stämme der pilzliche Pflanzenpathogen Verticillium Dahlia eine lückenlose Genomsequenz erzeugen, den Anteil der sich wiederholenden DNA - Sequenzen in das Genom zu verdreifachen, die Anzahl der Gen Annotationen erhöht (und die Verringerung der Anzahl von Teil oder fehlende Gen Annotationen ) und aufschlussreich Genom - Rearrangements 17. Um diese langfris las Sequenzierungstechnologien, hohe Konzentrationen von hohen Qualität genomischer DNA, mit minimalen Größen&gt; 20 kbp zu verwenden, benötigt. Hier beschreiben wir unsere Methoden zur konidiale Sammlung, Reinigung von hochmolekularer DNA von Konidien und unsere Qualitätskontrolle Einschätzungen Mehltauart Golovinomyces cichoracearum auf Gurken angebaut mit 18. Dieses Protokoll basiert auf einem Protokoll im Labor Gruppe B. Keller entwickelt (Universität Zürich, Zürich Schweiz) 13, 19und umfasst mehrere Modifikationen, die zu einem erhöhten DNA-Ausbeuten und einen höheren Anteil an DNA&gt; 48,5 kbp in Größe geführt. Das Protokoll enthält auch die Qualitätskontrolle Schritte basieren auf den Empfehlungen aus den Vereinigten Staaten Department of Energy Joint Genome Institute 20, 21, 22. Die Funktion jedes Reagenz in dem Lysepuffer enthalten ist , und die Gründe für jeden Reinigungsschritt werden , wie in Henry (2008) 23 beschrieben. Verfügbare veröffentlichte Protokolle zur Isolierung von hochmolekulare genomische DNA aus pflanzlichen und mikrobiellen Geweben wurden auch bei der Gestaltung dieses Protokolls 24, 25, 26 angehört, 27, 28.

<table><tbody><tr><td>MM400 Kugelmühle</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>oder gleichwertige Kugelmühle</td></tr><tr><td>2 mL Röhrchen zum Kugelmahlen</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>5/32" Edelstahl-Fräskugeln</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprozessorgesteuertes Wasserbad der Serie 280 Voreingestellt auf 65 > C&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>oder gleichwertiges Wasserbad</td></tr><tr><td>Mikroprozessorgesteuertes Wasserbad der Serie 280 Voreinstellung auf 37 > C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>oder gleichwertiges Wasserbad</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R gekühlte Mikrozentrifuge</td><td>Krakeler Scientific</td><td>38-022621807</td><td>oder gleichwertige Mikrozentrifuge</td></tr><tr><td>Chlorform:IAA (24:1 v/v)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0549</td><td>Gefahrgefährlich bei Berührung mit der Haut oder Einatmen. Tragen Sie Nitrilhandschuhe, eine Schutzbrille, einen Laborkittel und arbeiten Sie in einer chemischen</td></tr><tr><td>Haube Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>Bei Hautkontakt oder Einatmen gefährlich. Tragen Sie Nitrilhandschuhe, eine Schutzbrille, einen Laborkittel und arbeiten Sie in einer chemischen Haube</td></tr><tr><td>100% Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>W292907</tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34923</td><td>Kälte bis -20 Grad C Vorverwendung</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnase, Dnase-frei (10 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Kaliummetabisulfit</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>Natriumlauryl-Sakroinat</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Tris Basis</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>10708976001</tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>Oder gleichwertige Brille</td></tr><tr><td>High Five COBALT Nitril Handschuhe, LARGE</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>Oder gleichwertige Handschuhe</td></tr><tr><td>GelRed Nukleinsäure Gel Stain 10.000x in Wasser</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>Gefährlich bei Hautkontakt. Tragen Sie Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen</td></tr><tr><td>Agarose Ultrareines Bioreagenz</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb CHEF DNA-Größenstandards</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>Oder gleichwertige Pulsfeld-Gel-Aparatus</td></tr><tr><td>Whatman qualitatives Filterpapier, Klasse 1</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>WHA1001042</td><td>Oder gleichwertige Wachstumskammer</td></tr><tr><td>Percival Wachstumskammer</td><td>Percival</td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>Oder gleichwertiges Spektralphotometer</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE Puffer (Tris-Acetat-EDTA) (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>Vor Gebrauch 1/50 mit Wasser verdünnen (auf 1x)</td></tr><tr><td>TE Puffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA, 10x Lösung (Elektrophorese)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>Vor Gebrauch 1/10 mit Wasser verdünnen (auf 1x)</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td></td><td></td><td>Flüssiger Stickstoff (-196 &de; C) stellt eine Frostgefahr dar. Es dehnt sich auch beim Erwärmen schnell aus und sollte nicht in einem fest verschlossenen Behälter aufbewahrt</td></tr></tbody></table> werden

reinigung von high molecular weight genomischer dna aus echten mehltaus für long-read-sequenzierung

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Die Echten Mehltaupilze sind eine Gruppe von wirtschaftlich bedeutenden pilzliche Pflanzenpathogene. Relativ wenig ist von gut entwickelten genetischen und genomischen Ressourcen auf einen Mangel auf Grund über die Molekularbiologie und Genetik dieser Erreger, teilweise bekannt. Diese Organismen haben große, sich wiederholende Genome, die gemacht haben Genom-Sequenzierung und Montage prohibitiv schwierig. Hier beschreiben wir Methoden zur Erfassung, Extraktion, Reinigung und Bewertung der Qualitätskontrolle von hochmolekularem genomischer DNA aus einem echten Mehltau - Arten, Golovinomyces cichoracearum. Das beschriebene Protokoll umfasst mechanische Störung durch eine optimierte Phenol / Chloroform-Extraktion genomische DNA gefolgt Sporen. Eine typische Ausbeute betrug 7 &amp; mgr; g DNA pro 150 mg Konidien. Die genomische DNA , die dieses Verfahren isoliert wird , verwendet , ist geeignet für die Lang lesen Sequenzierung (dh&gt; 48,5 kbp). Maßnahmen zur Qualitätskontrolle, die Größe, die Ausbeute und Reinheit der genomischen DNA, um sicherzustellen, sind auchin diesem Verfahren beschrieben. Die Sequenzierung der genomischen DNA der hier beschriebenen Qualität wird für die Montage und den Vergleich von mehreren Mehltau Genome, die wiederum erlauben zu einem besseren Verständnis führen wird und eine verbesserte Steuerung dieser landwirtschaftlichen Erreger.

Ein repräsentatives Beispiel für gereinigter genomischer DNA aus G. 60 ng cichoracearum auf einem Agarosegel unter Verwendung von Gelelektrophorese laufen und unter Verwendung von Pulsfeld - Gelelektrophorese sind in den 1 bzw. 2 gezeigt. Genomische DNA-Präparate, die verstreichen, geringfügig übergeben und die Qualitätskontrolle nicht vertreten sind. Genomische DNA-Präparate, die vollständig Qualitätskontrolle passiere...

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Qualitätskontrolle von genomischer DNA aus dem obligat biotrophen Pilzerreger, dem Echten Mehltau, zur Verwendung in der Long-Read-Genomsequenzierung.

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, genomische DNA mit hohem Molekulargewicht aus haploiden Konidien von Mehltau für die Langreihen-Sequenzierung des Genoms zu isolieren. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der biologischen Forschung zu pflanzlichen pathogenen Pilzen beantworten, beispielsweise bezüglich der Struktur und Zusammensetzung schwer zu untersuchender Genome. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Gewinnung hochwertiger genomischer DNA aus einem Pathogen ermöglicht, mit dem sich nur schwer arbeiten lässt.Um das Experiment zu beginnen, entfernen Sie die Stahlkugeln mithilfe eines Magneten schnell aus den Konidien-Kryoröhrchen. Geben Sie 700 Mikroliter Lysepuffer mit 65 Grad Celsius hinzu und wirbeln Sie die Lösung fünf bis zehn Sekunden lang im Vortex. Nach fünf bis zehn Sekunden bildet sich ein Brei.Fügen Sie 300 µL vorgewärmtes Sarkosyl (5 % V/V) bei 65 °C hinzu und invertieren Sie vorsichtig fünfmal. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten bei 65 °C. Überführen Sie mithilfe einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser die gesamte Lösung in ein neues 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.Geben Sie ein Volumen Chloroform-Isoamylalkohol zur Lyse-Lösung hinzu und mischen Sie vorsichtig durch fünfmaliges Invertieren des Röhrchens. Inkubieren Sie das Gemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur. Mischen Sie erneut vorsichtig durch fünfmaliges Invertieren des Röhrchens zur halben Inkubationszeit und ein weiteres Mal am Ende der Inkubation.Anschließend zentrifugieren und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser vorsichtig die wässrige Phase in ein neues zweimilliliter-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und dabei vermeiden, Material aus der Grenzfläche mitzuübertragen. 750 Mikroliter Raumtemperatur-100%-Isopropanol hinzufügen und das Röhrchen vorsichtig sechsmal umdrehen.Anschließend die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Vorsichtig den Überstand entfernen und verwerfen. 450 Mikroliter vorab gekühltes 70 % Ethanol hinzufügen.Zentrifugieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Zentrifugieren Sie bei 1000 × g für drei Sekunden.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer feinen Pipettenspitze und entsorgen Sie den Überstand. Trocknen Sie das Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Luft. Lösen Sie das Pellet in 300 Mikroliter TE auf. Inkubieren Sie die DNA über Nacht bei vier Grad Celsius.Am nächsten Morgen vorsichtig schütteln, um jegliche DNA erneut in Suspension zu bringen, die nicht in Lösung gegangen ist. Um RNA-Verunreinigungen zu entfernen, 10 Mikroliter RNase hinzufügen. Das Röhrchen vorsichtig dreimal umdrehen und die DNA bei 1000 × g für drei Sekunden zentrifugieren.Anschließend die DNA zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. 300 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzufügen und vorsichtig fünfmal umstülpen, um zu mischen, und die DNA danach 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Probe zur Mischung erneut vorsichtig zum halben und am Ende der Inkubationszeit jeweils fünfmal umstülpen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur. Überführen Sie mit einer Pipettenspitze mit großer Öffnung das Überstandsgemisch in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie drei Mikroliter 3-molarer Natriumacetatlösung (pH 5,2) hinzu und invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig fünfmal.Gebe 750 Mikroliter vorgekühlten 100%igen Ethanol hinzu und mische die Probe durch fünfmaliges vorsichtiges Umstülpen des Reaktionsgefäßes. Inkubiere die Mischung über Nacht bei 20 Grad Celsius. Am folgenden Morgen zentrifugiere das Gefäß 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig den Überstand. Geben Sie 450 µL vorab gekühlten 70%igen Ethanol hinzu. Zentrifugieren Sie danach das Gefäß fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nachdem die DNA pelletiert wurde, vorsichtig den Überstand entfernen. Das Röhrchen erneut bei 1000 × g für drei Sekunden zentrifugieren, um restlichen Überstand abzutrennen. Den restlichen Überstand mit einer feinen Pipettenspitze entfernen.Trocknen Sie das Pellet 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft. Lösen Sie das Pellet nach der Lufttrocknung in 27,5 Mikrolitern TE auf. Am nächsten Tag vorsichtig umdrehen, um restliches Material, das nicht in Lösung gegangen ist, erneut aufzususpenderen. Aliquotieren Sie 2,5 Mikroliter in 22,5 Mikroliter TE für Qualitätskontrolltests. Bewahren Sie die DNA-Proben bis zur Abgabe zur Sequenzierung bei vier Grad Celsius auf. Für die Langzeitlagerung lagern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius und minimieren Sie Gefrier-Tau-Zyklen, um ein Scheren zu verhindern. Mithilfe des Protokolls wurde gereinigte genomische DNA verwendet, um eine Gelelektrophorese durchzuführen, wodurch DNA erhalten wurde, die die Qualitätskontrolle bestanden hat, mit einem intensiven einzelnen Band oberhalb von 20 kbp und geringer Verschmierung, DNA mit einem grenzwertigen Ergebnis mit einem einzelnen Band oberhalb von 20 kbp sowie ein fehlgeschlagenes Ergebnis mit Verschmierung unterhalb von 20 kbp und Fragmenten bei 100 bp.Die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) wurde durchgeführt, um zwischen einer akzeptablen DNA-Probe, bei der der Großteil der DNA größer als 48,5 kbp ist, und einer minderwertigen DNA-Probe, bei der der Großteil der DNA zwischen 20 und 48,5 kbp liegt, zu unterscheiden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Einzelmolekül-Langsequenzierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zum Genom des Mehltaus zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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