Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, genomische DNA mit hohem Molekulargewicht aus haploiden Konidien des Mehltaus für die Long-Read-Genomsequenzierung zu isolieren. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der pflanzenpathogenen Pilzbiologie beantworten, wie z.B. die Struktur und Zusammensetzung schwer zu untersuchender Genome. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Extraktion hochwertiger genomischer DNA aus einem Krankheitserreger ermöglicht, mit dem nur schwer zu arbeiten ist.

Um das Experiment zu beginnen, entfernen Sie schnell Stahlkugeln mit einem Magneten von den Kryofläschchen der Konidien. Fügen Sie 700 Mikroliter 65 Grad Celsius heißen Lysepuffer hinzu und wirbeln Sie die Lösung fünf bis 10 Sekunden lang ein. Nach fünf bis 10 Sekunden bildet sich eine Aufschlämmung.

Fügen Sie 300 Mikroliter 65 Grad vorgewärmtes 5%Vol.-% Sarkosyl hinzu und invertieren Sie es vorsichtig fünfmal. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Übertragen Sie die gesamte Lösung mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Geben Sie ein Volumen Chloroform-Isoamylalkohol in die Lyselösung und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um fünfmal zu mischen. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um es nach der Hälfte und erneut am Ende der Inkubation fünfmal zu mischen.

Anschließend zentrifugieren und 15 Minuten bei Raumtemperatur erhitzen. Übertragen Sie die wässrige Schicht vorsichtig mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung auf ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und vermeiden Sie es, Material aus der Grenzfläche aufzunehmen. Fügen Sie 750 Mikroliter Volumen bei Raumtemperatur 100% Isopropanol hinzu und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig sechsmal um.

Dann zentrifugieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie 450 Mikroliter vorgekühltes 70%iges Ethanol hinzu.

Zentrifugieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Zentrifugieren Sie drei Sekunden lang bei 1000 mal g.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer feinen Pipettenspitze und entsorgen Sie den Überstand. Trocknen Sie das Pellet 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern TE. Inkubieren Sie die DNA über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Morgen schnippen Sie vorsichtig, um die DNA, die nicht in Lösung gegangen ist, wieder zu resuspendieren. Um RNA-Kontaminationen zu entfernen, fügen Sie 10 Mikroliter RNase hinzu. Drehen Sie das Röhrchen dreimal vorsichtig um und zentrifugieren Sie die DNA drei Sekunden lang bei 1000 mal g.

Dann inkubieren Sie die DNA zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie 300 Mikroliter Phenolchloroform-Isoamylalkohol hinzu und invertieren Sie vorsichtig, um fünfmal zu mischen, und inkubieren Sie die DNA 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um die DNA nach der Hälfte der Zeit und erneut am Ende der Inkubation fünfmal zu mischen.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie drei Mikroliter 3 molare Natriumacetate mit einem pH-Wert von 5,2 hinzu und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig fünfmal um.

Fügen Sie 750 Mikroliter vorgekühltes 100%iges Ethanol hinzu und drehen Sie das Rohr fünfmal vorsichtig um. Inkubiere die Mischung über Nacht bei 20 Grad Celsius. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie 450 Mikroliter vorgekühltes 70%iges Ethanol hinzu. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Nach dem Pelletieren der DNA wird der Überstand vorsichtig entfernt. Drehen Sie das Röhrchen erneut mit dem 1000-fachen g für drei Sekunden, um den Restüberstand zu entfernen. Restüberstand mit einer Pipette mit feiner Spitze entfernen.

Trocknen Sie das Pellet 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Nach dem Trocknen an der Luft resuspendieren Sie das Pellet in 27,5 Mikrolitern TE. Am nächsten Tag vorsichtig wenden, um das Restmaterial, das nicht in Lösung gegangen ist, wieder zu suspendieren. Aliquotieren Sie 2,5 Mikroliter in 22,5 Mikroliter TE für Qualitätskontrolltests.

Lagern Sie die DNA-Proben bei vier Grad Celsius, bis sie zur Sequenzierung eingereicht werden. Lagern Sie die Proben für die Langzeitlagerung bei 80 Grad Celsius und minimieren Sie die Auftauzyklen beim Einfrieren, um ein Scheren zu verhindern. Unter Verwendung des Protokolls wurde gereinigte genomische DNA verwendet, um eine Gelelektrophorese durchzuführen, die DNA erhielt, die die Qualitätskontrolle mit einer starken Einzelbande über 20 kbp und minimalem Verschmieren bestanden hatte, DNA, die ein marginales Ergebnis mit einer einzelnen Bande über 20 kbp ergab, und ein fehlgeschlagenes Ergebnis, das ein Verschmieren unter 20 kbp aufweist und Fragmente bei 100 bp enthält.

Die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) wurde durchgeführt, um zwischen einer akzeptablen DNA-Probe mit einem DNA-Großteil von mehr als 48,5 kbp und einer marginalen DNA-Probe mit einem DNA-Großteil zwischen 20 und 48,5 kbp zu unterscheiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Einzelmolekül-Long-Read-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Genom des Mehltaus zu beantworten.