Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, präzisionsgeschnittene Lungenpräparate (PCLS) zu verwenden, um die Lokalisation und den Verkehr verschiedener Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Lokalisation und Migrationsmuster von Immunzellen in der Lunge. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass mehrere Interaktionen im lebenden ex vivo-Gewebe sichtbar gemacht werden können, das die dreidimensionale Architektur der Lunge erhält.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Lokalisation und den Transport von Immunzellen während einer Entzündung ermöglichen kann, lässt sie sich auch zur Visualisierung der Kontraktion von Atemwegs- und glattem Muskelgewebe verwenden. Um das Lungengewebe zu gewinnen, öffnen Sie zunächst mit einer Schere die Haut und das Peritoneum von der Mitte des Abdomens bis zum Kiefer eines sechs bis zwölf Wochen alten Mäuschen und schieben Sie den Darm zur Seite der Bauchhöhle. Schneiden Sie die untere Hohlvene an, um das Blut aus den Lungen abfließen zu lassen, und durchstechen Sie mit der scharfen Spitze der Schere das Zwerchfell, um eine Ausdehnung des Brustkorbs zu ermöglichen.

Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Speicheldrüsen und anderes Gewebe manuell von der Luftröhre zu lösen, und führen Sie mit einer feinen Pinzette einen Schnitt in die Luftröhre an der vorderen Seite des dicksten Knorpelrings durch, wobei die Öffnung gerade groß genug sein sollte, um eine Nadel der Größe 20 Gauge durchzulassen. Stecken Sie nun eine 1,5 Zoll lange Nadel der Größe 20 Gauge auf ein Stück Polyethylen-Schlauch und schneiden Sie den Schlauch in einem Winkel von etwa 45 Grad ab. Befestigen Sie die Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze und ziehen Sie 0,8 Milliliter 2 %igen Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt von 40 Grad Celsius in die Spritze ein.

Nachdem das gesamte Agarose aufgetragen wurde, wird das abgeschrägte Ende des Schlauchs in den Einschnitt eingeführt und die Agarose langsam in die Lungen injiziert. Ohne die Nadel oder die Spritze zu bewegen, wird die Spritze mit Klebeband an der Polystyrolplatte befestigt, um die Nadel in der Luftröhre zu fixieren, und das Tier wird mindestens 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius gelagert. Sobald die Agarose erstarrt ist, werden die Lungen vorsichtig mit einer Schere ausgeschnitten und in eine 3 cm-Dish mit eiskalter PBS gelegt.

Drehen Sie dann das Lungenlappen zur Gewebeschnittvorbereitung so, dass der innere Abschnitt der Lunge, der mit der Luftröhre verbunden ist, nach unten zeigt. Um das Lungengewebe zu schneiden, geben Sie zunächst einen kleinen Tropfen All-Purpose-No-Run-Gel-Sekundenkleber auf einen metallenen Spritzenkolben und verteilen den Kleber kreisförmig. Sobald der gesamte Kleber aufgetragen ist, greifen Sie mit einer Pinzette sofort, aber vorsichtig, das ausgeschnittene Lungenlappen mit der Luftröhre nach unten und tupfen das Lungenlappen auf ein Tuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Platzieren Sie das getrocknete Läppchen vorsichtig auf dem Kolben und schneiden Sie überschüssiges Gewebe ab, das über den Rand des Kolbens hinausragt. Bewegen Sie den Kolben nach unten, sodass die Seiten der Metallspritze nach oben und über das Gewebe gleiten und einen Hohlraum bilden, wobei die Lunge am Boden des Spritzenrohrs liegt und die Tiefe nicht mehr als einige Zentimeter beträgt. Wickeln Sie Klebeband um das untere Ende der Spritze, um den Kolben an seiner Position zu fixieren.

Danach vorsichtig 40 Grad Celsius warme 2 % Low-Melt-Agarose in die Spritze gießen, sodass die Spitze des Läppchens gerade bedeckt ist, und die Metallspritze mit einem eiskalten Kühlblock umgeben. Nach einer bis zwei Minuten die Probenspritze in den automatisierten Schneideapparat einlegen und die neue Klinge ausrichten. Anschließend den Pufferbehälter mit eiskaltem PBS füllen.

Richten Sie den Schrittmotortreiber mit der Probenspritze aus, und entfernen Sie das Klebeband. Schalten Sie auf die Vorwärtsposition, bis der Schrittmotortreiber die Rückseite des Kolbens gerade berührt. Stellen Sie die Schnittdicke, den kontinuierlichen Einzelschnitt, die Oszillation und die Geschwindigkeit am Schneidegerät ein.

Drücken Sie dann auf Start und sammeln Sie mithilfe eines dünnen Spatels jeden PCLS, sobald er in den Pufferbehälter fällt, wobei Sie die Schnitte in einzelne Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit eiskaltem PBS geben. Für die statische PCLS-Bildgebung überführen Sie die Lungenschnitte, die den anatomischen Bereich von Interesse enthalten, in einzelne 3 cm-Dishs, die jeweils ein Milliliter der gewünschten Antikörpercocktail-Lösung enthalten. Nach 30 bis 60 Minuten auf Eis mit Schütteln und Lichtschutz spülen Sie die Schnitte zweimal mit jeweils einem Milliliter eiskaltem PBS aus.

Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter PBS pro Probe in eine neue, dreizentimeterige, runde Glasbodenkulturschale hinzu und überführen Sie die Schnitte schnell in jeden Tropfen, wobei Sie die Gewebestücke vorsichtig so manipulieren, dass sie flach ausgebreitet liegen. Danach saugen Sie den PBS mit einer Pipette ab und geben einen Tropfen Einbettmedium mit Raumtemperatur auf den Objektträger, gefolgt von einem Deckglas. Um das Gewebe abzubilden, stellen Sie die Schale auf die Probenebene eines konfokalen Mikroskops unter ein 20x-Objektiv und verwenden Sie das Kachelwerkzeug, um die Ränder des Gewebes in der konvexen Hülle einzurichten und zu markieren, um die Dauer des Kachelscans zu verkürzen.

Stellen Sie dann den Z-Stack-Bereich ein und achten Sie darauf, dass die eingestellten Bereiche an mehreren Stellen des Schnitts, insbesondere entlang der Ränder, geeignet sind. Für die Live-Cell-Bildgebung spülen Sie die Schnitte nach einer 30-minütigen Inkubation im gewünschten Antikörper-Cocktail zweimal mit einem Milliliter kaltem Leibovitz 10 ab. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter frisches Leibovitz 10 in eine Kammer einer Chambered Coverglass pro Probe und überführen Sie unverzüglich jeden PCLS in das Medium, wobei Sie das Gewebe vorsichtig so manipulieren, dass es flach ausgebreitet liegt.

Verwenden Sie dann eine Pipette, um das Medium aus jeder Kammer zu aspirieren, und befestigen Sie jeden PCLS mit einem Platin-Gewicht. Geben Sie sorgfältig frisch zubereitete, eiskalte extrazelluläre Matrix auf jeden PCLS, wobei darauf zu achten ist, dass das Gel direkt auf den Lungenschnitten aufliegt und die Schnitte nicht auf dem Gel schwimmen. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius wird der Objektträger in eine vorgewärmte Kammer des konfokalen Mikroskops bei 37 Grad Celsius unter einer 20x-Objektivlinse überführt.

Danach den Z-Stack und die Kachelbereiche basierend auf dem gewünschten Intervall zwischen den Einzelbildern einstellen, wobei das Kachelwerkzeug verwendet wird, um den interessierenden Bereich im Gewebe zu markieren, und die zentrierte Raster-Einstellung dafür sorgt, dass die Probe im Bildfeld zentriert ist. CD11b-hohe konventionelle dendritische Zellen lokalisiert im Lungengewebe, während CD103-positive konventionelle dendritische Zellen vorwiegend um die Atemwege und den subpleuralen Bereich angesiedelt sind. Eine Ko-Färbung für CD88 und CD172a ermöglicht die Unterscheidung von CD172a-negativen, CD88-positiven alveolären Makrophagen von CD172a-positiven, CD88-positiven interstitiellen Makrophagen, wobei letztere bevorzugt im Parenchym und nicht im subepithelialen Bereich lokalisiert sind.

Die Doppelfärbung für CD90.2, ein bekanntes T-Zell-Markerprotein, und das fluoreszierende Protein TdTomato, ein Transgen unter transkriptioneller Kontrolle eines wichtigen Transkriptionsfaktors, der für die Lymphangiogenese notwendig ist, erleichtert die Identifizierung lymphatischer Strukturen in der Lunge. Konventionelle dendritische Zellen, die CD103 positiv sind, finden sich in mehreren anatomischen Bereichen, einschließlich des CD324 exprimierenden Atemwegepithels, der Lymphgefäße und des subpleuralen Bereichs. Zellbewegungen und Zell-Zell-Interaktionen können mittels Live-Cell-Imaging erfasst werden, wie gerade gezeigt wurde.

Beispielsweise können im repräsentativen Experiment 16 Stunden nach oraler Ova-LPS-Applikation CD103-positive dendritische Zellen über einen Zeitraum von vier Stunden deutlich bei ihrer Interaktion mit adoptiv übertragenen ova-spezifischen T-Zellen beobachtet werden. Sobald die Techniken beherrscht sind, können die Gewebevorbereitung und das Schneiden der Schnitte bei korrekter Durchführung innerhalb von zweieinhalb Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine gute Agarose-Inflation der Lunge zu erzielen und anschließend die empfindlichen Lungen­schnitte für die Bildgebung so flach wie möglich zu halten.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden, wie die Behandlung von PCLS mit Acetylcholin oder Methacholin, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Kalziumsignalgebung und zur Bronchialkontraktilität unter verschiedenen Krankheitsbedingungen zu beantworten. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie präzisionsgeschnittene Lungenpräparate hergestellt werden, um die Lokalisation, den Transport und die Wechselwirkungen von Immunzellen in der Lunge sichtbar zu machen.