Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, mit Hilfe von präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten (PCLS) die Lokalisation und den Transport verschiedener Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Immunologie zu beantworten, wie z.B. die Lokalisation und Migrationsmuster von Immunzellen in der Lunge. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere Wechselwirkungen im lebenden ex vivo-Gewebe sichtbar gemacht werden können, wodurch die dreidimensionale Architektur der Lunge erhalten bleibt.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Lokalisation und den Transport von Immunzellen während einer Entzündung geben kann, kann sie auch zur Visualisierung der Kontraktion von Atemwegs- und glattem Muskelgewebe verwendet werden. Um das Lungengewebe zu entnehmen, öffnen Sie zunächst mit einer Schere die Haut und das Bauchfell von der Mitte des Bauches bis zum Kiefer einer sechs bis 12 Wochen alten Maus und bewegen Sie den Darm an die Seite der Bauchhöhle. Schneiden Sie die untere Hohlvene ab, um das Blut aus der Lunge abzuleiten, und stechen Sie mit der scharfen Spitze der Schere das Zwerchfell durch, um eine Ausdehnung des Brustkorbs zu ermöglichen.

Verwenden Sie als Nächstes eine Pinzette, um die Speicheldrüsen und anderes Gewebe manuell von der Luftröhre wegzuziehen, und verwenden Sie eine feine Pinzette, um einen Schnitt in die Luftröhre auf der vorderen Seite des dicksten Knorpelbandes zu machen, das gerade groß genug ist, um eine 20-Gauge-Nadel eindringen zu lassen. Schieben Sie nun eine 1,5-Zoll-Nadel mit 20 Gauge auf einen Abschnitt aus Polyethylenschlauch und schneiden Sie den Schlauch in einem Winkel von etwa 45 Grad. Befestigen Sie die Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze und ziehen Sie 0,8 Milliliter Agarose mit 40 Grad Celsius und einem niedrigen Schmelzpunkt in die Spritze.

Wenn die gesamte Agarose geladen ist, führen Sie das abgeschrägte Ende des Schlauchs in den Schnitt ein und injizieren Sie die Agarose langsam in die Lunge. Kleben Sie die Spritze, ohne die Nadel oder die Spritze zu bewegen, auf die Polystyrolbasis, um die Nadel in der Luftröhre zu sichern, und legen Sie das Tier für mindestens 10 Minuten in eine 4 Grad Celsius heiße Lagerung. Sobald die Agarose fest geworden ist, verwenden Sie eine Schere, um die Lungen vorsichtig herauszuschneiden, und legen Sie sie in eine drei Zentimeter große Schale mit eiskaltem PBS.

Drehen Sie dann den Lappen zum Schneiden des Gewebes, so dass der innere Teil der Lunge, der mit der Luftröhre verbunden ist, nach unten zeigt. Um das Lungengewebe zu durchtrennen, geben Sie zuerst einen kleinen Tropfen All Purpose No Run Gel-Sekundenkleber auf einen Metallspritzenkolben und verteilen Sie den Kleber in kreisenden Bewegungen. Wenn der gesamte Kleber aufgetragen ist, greife mit einer Pinzette sofort, aber vorsichtig die herausgeschnittene Lungenröhre nach unten, und tupfe den Lappen auf ein Taschentuch, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Legen Sie den getrockneten Lappen vorsichtig auf den Kolben und schneiden Sie überschüssiges Gewebe ab, das über den Rand des Kolbens hinausragt. Bewegen Sie den Kolben nach unten, so dass sich die Seiten der Metallspritze nach oben und über das Gewebe bewegen, so dass mit der Lunge am Boden des Spritzenschafts eine Vertiefung entsteht, die nicht mehr als einige Zentimeter tief ist. Klebe den Boden der Spritze mit Klebeband ab, um den Kolben an Ort und Stelle zu halten.

Gießen Sie dann vorsichtig 40 Grad Celsius 2%Low Melt Agarose in die Spritze, so dass sie nur die Oberseite des Lappens bedeckt, und umgeben Sie die Metallspritze mit einem eiskalten Kühlblock. Legen Sie nach ein bis zwei Minuten die Probenspritze in den automatisierten Slicer und richten Sie die frische Klinge aus. Füllen Sie anschließend den Puffertank mit eiskaltem PBS.

Richten Sie den Schrittmotorantrieb auf die Probenspritze aus und entfernen Sie das Klebeband. Drehen Sie den Schalter in die Schnellvorlaufposition, bis der Schrittmotorantrieb nur die Rückseite des Stößels berührt. Legen Sie die Einstellungen für die Gewebedicke, die kontinuierliche Einzelscheibe, die Oszillation und die Geschwindigkeit am Slicer fest.

Drücken Sie dann auf Start und verwenden Sie einen dünnen Spatel, um jedes PCLS aufzufangen, während es in den Puffertank fällt, und legen Sie die Scheiben in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit eiskaltem PBS. Für die statische PCLS-Bildgebung werden die Lungenproben, die den anatomischen Bereich von Interesse enthalten, in einzelne Drei-Zentimeter-Schalen übertragen, die einen Milliliter des entsprechenden Antikörpercocktails enthalten. Nach 30 bis 60 Minuten auf Eis mit Schaukeln und lichtgeschützt die Scheiben zweimal mit einem Milliliter eiskaltem PBS abspülen.

Geben Sie dann 50 Mikroliter PBS in eine neue, drei Zentimeter lange runde Glasschale pro Probe und geben Sie die Scheiben schnell in jeden Tropfen, wobei Sie die Gewebestücke vorsichtig manipulieren, so dass sie flach verteilt sind. Aspirieren Sie dann das PBS mit einer Pipette und geben Sie einen Tropfen Einbettmedium bei Raumtemperatur auf den Objektträger, gefolgt von einem Glasdeckglas. Um das Gewebe abzubilden, stellen Sie die Schale auf einen konfokalen Mikroskoptisch unter einem 20-fachen Objektiv und verwenden Sie das Kachelwerkzeug, um die Ränder des Gewebes in der konvexen Schaleneinstellung zu lokalisieren und zu markieren, um die Zeit für den Kachelscan zu verkürzen.

Legen Sie dann den Z-Stapelbereich fest und achten Sie darauf, dass die eingestellten Bereiche in mehreren Bereichen des Slices geeignet sind, insbesondere entlang der Kanten. Für die Bildgebung lebender Zellen werden die Scheiben nach 30 Minuten Inkubation in dem betreffenden Antikörpercocktail zweimal mit einem Milliliter kaltem Leibovitz 10 abgespült. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter frischen Leibovitz 10 in einen Schlitz eines gekammerten Deckglases pro Probe, gefolgt von der sofortigen Übertragung jedes PCLS auf das Medium, wobei die Gewebe vorsichtig manipuliert werden, bis sie flach verteilt sind.

Verwenden Sie dann eine Pipette, um das Medium aus jeder Kammer zu aspirieren, und verankern Sie jedes PCLS mit einem Platingewicht. Pipettieren Sie die frisch zubereitete eiskalte extrazelluläre Matrix vorsichtig auf jedes PCLS und achten Sie darauf, dass das Gel auf die Lungenscheiben gelegt wird und dass die Scheiben nicht auf dem Gel schwimmen. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius wird der Objektträger in eine auf 37 Grad Celsius eingestellte konfokale Mikroskopkammer unter einem 20-fach-Objektiv überführt.

Legen Sie dann den Z-Stapel und die Kachelbereiche basierend auf dem gewünschten Intervall zwischen den Frames fest, indem Sie mit dem Kachelwerkzeug den interessierenden Bereich im Gewebe kennzeichnen, und mit der Einstellung für zentriertes Raster, um die Probe im Sichtfeld zu zentrieren. CD11b-hohe konventionelle dendritische Zellen lokalisieren im Lungenparenchym, während CD103-positive konventionelle dendritische Zellen hauptsächlich um die Atemwege und den subpleuralen Bereich herum leben. Die Co-Färbung von CD88 und CD172a ermöglicht die Unterscheidung von CD172a-negativen, CD88-positiven Alveolarmakrophagen von CD172a-positiven, CD88-positiven interstitiellen Makrophagen, von denen letztere bevorzugt im Parenchym und nicht im subepithelialen Bereich lokalisiert sind.

Die gemeinsame Markierung von CD90.2, einem bekannten T-Zell-Marker, und dem TdTomato-Fluoreszenzprotein, einem Transgen unter der transkriptionellen Kontrolle eines für die Lymphagiogenese notwendigen Master-Transkriptionsfaktors, erleichtert die Identifizierung lymphatischer Strukturen in der Lunge. CD103-positive konventionelle dendritische Zellen finden sich in mehreren anatomischen Bereichen, einschließlich des CD324-exprimierenden Atemwegsepithels, der Lymphgefäße und des subpleuralen Bereichs. Zellbewegungen und Zell-zu-Zell-Interaktionen können mit Hilfe von Live-Zell-Imaging aufgezeichnet werden, wie gerade gezeigt.

Zum Beispiel können im repräsentativen Experiment 16 Stunden nach der oralen Eizellen-LPS-Installation CD103-positive dendritische Zellen deutlich beobachtet werden, die über einen Zeitraum von vier Stunden mit adoptiv übertragenen eizellspezifischen T-Zellen interagieren. Einmal gemeistert, können die Gewebevorbereitung und die Schneidetechniken in zweieinhalb Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, eine gute Agarose-Lungeninflation zu erreichen und anschließend die empfindlichen Lungenscheiben für die Bildgebung so flach wie möglich zu halten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die Behandlung von PCLS mit Acetylcholin oder Methacholin, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Kalziumsignalgebung und zur Kontraktilität der Atemwege unter verschiedenen Krankheitsbedingungen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man präzise geschnittene Lungenscheiben generiert, um die Lokalisierung, den Transport und die Wechselwirkungen von Immunzellen in der Lunge zu visualisieren.