pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Das übergeordnete Ziel dieser Fluoreszenzbildgebungsmethode ist es, Veränderungen des Membranproteintransports und der intrazellulären Verteilung zu überwachen. Diese Methode gibt Aufschluss über Veränderungen im Proteintransport, wie z.B. die Wirkung genetischer Mutationen oder pharmakologischer Wirkstoffe auf die Geschwindigkeit der Vesikelabgabe und der Proteinexpression auf der Zelloberfläche. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Messungen schnell, mit hoher Auflösung und in Echtzeit durchgeführt werden können, ohne die Probe zu zerstören.

48 Stunden vor der Bildgebung werden Maus-Neuroblastom-2A-Zellen mit einem Plasmidkonstrukt transfiziert, das SEP enthält, einen pH-empfindlichen Fluorophor, der in die extrazelluläre Region des interessierenden Proteins eingebaut ist. Wenn die transfizierten Zellen für die Bildgebung mit Totalreflexionsfluoreszenz oder TIRF-Mikroskopie bereit sind, fügen Sie den Zellen zwei Milliliter extrazelluläre Lösung (ECS) mit pH 7,4 hinzu. Stellen Sie eine Schale mit Zellen auf den Translationstisch und verwenden Sie Tischhalterungen, um die Schale an Ort und Stelle zu befestigen.

Fokussieren Sie im Epifluoreszenzmodus das Mikroskop und lokalisieren Sie die fluoreszierenden transfizierten Zellen. Zellen bleiben über mehrere Fokusebenen fokussiert. Lokalisieren Sie einzelne, isolierte Zellen, um mit TIRF fortzufahren.

Stellen Sie im Bildgebungsprogramm die Belichtungszeit auf 200 Millisekunden ein und optimieren Sie die Fluoreszenzintensität durch Einstellung der EM-Verstärkung. Übertragen Sie den Laserstrahl in TIRF, indem Sie den Schrittmotor verwenden, um den Strahl schrittweise über das Objektiv zu übertragen. Wenn sich der kritische Winkel nähert, wird der Strahl sichtbar über den Rand der Schale verschoben, bis er an dem Punkt der internen Totalreflexion auf der Probenebene konvergiert, wobei der Strahl an diesem Punkt entlang des Randes der Schale nicht mehr sichtbar ist.

Überprüfen Sie, ob sich die Zellen im TIRF-Modus befinden, indem Sie den Fokusknopf einstellen. Bei der TIRF kann nur eine Zellebene fokussiert werden, wodurch ein hochdefiniertes Bild mit hoher Auflösung der Plasmamembran erzeugt wird. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, lokalisieren Sie gesunde transfizierte Einzelzellen in der Bildgebungsebene.

Erfassen Sie ein fokussiertes Bild von Zellen bei einem pH-Wert von 7,4. SEP-markierte Rezeptoren auf der Plasmamembran und dem endoplasmatischen Retikulum sollten sichtbar sein. Blockieren Sie schnell, dass der Laserstrahl die Probe erreicht, um Photobleichen zu verhindern.

Verwenden Sie eine Mikroskop-Bildgebungssoftware, die in der Lage ist, mehrere XY-Positionen aufzuzeichnen, um die Tischpositionen aufzuzeichnen, die jeder Zelle entsprechen. Auf diese Weise können Sie Bilder von 20 bis 30 Zellen pro Schüssel aufnehmen, während Sie die Software verwenden, um die Position jeder Zelle aufzuzeichnen. Nachdem alle Zellbilder bei ph 7,4 gesammelt wurden, entfernen Sie das pH 7,4 ECS manuell, indem Sie pipettieren, ohne die Schale zu berühren.

Geben Sie vorsichtig zwei Milliliter pH 5,4 ECS in die Schüssel und warten Sie 10 Minuten. Speichern Sie während dieser Zeit die zuvor aufgenommenen Bilder. Bewegen Sie den Tisch unter den gleichen Bedingungen, die für die Aufnahme von Bildern bei einem pH-Wert von 7,4 verwendet werden, an jede gespeicherte Position und nehmen Sie ein Bild derselben Zelle bei einem pH-Wert von 5,4 auf.

Die Zellen sollten weniger definiert aussehen, da alle detektierten Fluoreszenzen von endoplasmatischen Retikulum-begrenzten SEP-markierten Rezeptoren stammen. Speichern Sie die pH 5,4-Zellbilder. Um einzelne Vesikelinsertionen abzubilden, ersetzen Sie zunächst die Wachstumsmedien der transfizierten Zellen durch zwei Milliliter pH 7,4 ECS.

Stellen Sie als Nächstes die Schale mit den transfizierten Zellen auf den Tisch des Mikroskops und verwenden Sie Tischhalterungen, um die Schale an Ort und Stelle zu befestigen. Fokussieren Sie eine einzelne Zelle in TIRF, wie zuvor gezeigt. Falls vorhanden, stellen Sie den Autofokus so ein, dass der Fokus während der Bildgebung nicht driftet.

Nehmen Sie eine Serie von 1.000 Bildern kontinuierlich auf und erfassen Sie Bilder mit einer Bildrate von 200 Millisekunden. Während dieser Zeit sind Fluoreszenzausbrüche sichtbar, die dem Transport von Vesikeln mit niedrigem pH-Wert entsprechen, die mit der Plasmamembran verschmelzen und das SEP dem extrazellulären pH-Wert von 7,4 aussetzen. Um mit der Analyse der SEP-Fluoreszenz zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation zu beginnen, öffnen Sie die Zellbilder mit einer Bildanalysesoftware wie ImageJ.

Subtrahieren Sie den Hintergrund sowohl von Bildern mit pH 5,4 als auch von pH 7,4 mit der Einstellung für Rollkugeln. Verwenden Sie einen intensitätsbasierten Schwellenwert zur Quantifizierung der Fluoreszenz aus einer einzelnen Zelle bei pH 7,4, wählen Sie zuerst das Bild aus, passen Sie ihn an und passen Sie den Schwellenwert an. Wählen Sie dann manuell einen Interessenbereich um die Zelle aus.

Messen Sie mit der integrierten Messfunktion auf der Registerkarte "Analysieren" die Zellfläche, die mittlere Intensität und die integrierte Dichte. Wiederholen Sie diese Messungen für dieselbe Zelle bei einem pH-Wert von 5,4. Nachdem die integrierte Dichte für Zellbilder bei pH 7,4 und 5,4 erhalten wurde, berechnen Sie die integrierte Dichte der Plasmamembran, indem Sie den pH-Wert 5,4 vom pH-Wert 7,4 subtrahieren.

Die Differenz entspricht der relativen Anzahl der Rezeptoren auf der Plasmamembran innerhalb des TIRF-Anregungsbereichs. Als Maß für den Transport berechnen Sie den relativen Prozentsatz der SEP-markierten Rezeptoren, die sich auf der Plasmamembran befinden, im Vergleich zu den verbleibenden Rezeptoren, die im TIRF-Erregungsvolumen sichtbar sind, indem Sie die integrierte Dichte der Plasmamembran durch die gesamte integrierte Dichte bei pH 7,4 dividieren, multipliziert mit 100. Um einzelne Vesikelinsertionsereignisse zu analysieren, öffnen Sie die Serie von 1.000 TIFF-Bildern mit einer Bildanalysesoftware.

Subtrahieren Sie den Hintergrund von allen Frames mit der Einstellung für rollende Kugeln. Passen Sie die Farbbalance der Aufzeichnung an, um intensive Bereiche zu maximieren, die Vesikelinsertionsereignissen entsprechen. Zählen Sie manuell die Fluoreszenzblitze, die länger als drei Bilder oder 600 Millisekunden dauern.

Dieses Beispiel eines Zellbildes bei pH 7,4 zeigt Rezeptoren, die sich auf der Plasmamembran und dem endoplasmatischen Retikulum befinden. Bei einem pH-Wert von 5,4 fluoreszieren die Rezeptoren auf der Plasmamembran nicht, so dass nur die im endoplasmatischen Retikulum ansässigen Rezeptoren sichtbar sind. Die Differenz zwischen der integrierten Dichte der Fluoreszenz bei pH 7,4 und pH 5,4 entspricht Rezeptoren, die an der Plasmamembran lokalisiert sind.

Einzelne Vesikelinsertionsereignisse werden bei pH 7,4 als Fluoreszenzstoß an der Plasmamembran sichtbar, der mindestens 600 Millisekunden dauert. Unmittelbar vor einer Insertion ist kein Burst erkennbar. Eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität ist zu beobachten, wenn ein Transportvesikel mit SEP eintrifft.

Die SEP-markierten Rezeptoren diffundieren dann durch die Plasmamembran, bis sie nicht mehr von zuvor eingefügten Rezeptoren zu unterscheiden sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 45 Minuten pro Gericht durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Veränderungen in der Proteinverteilung zwischen dem peripheren ER und der Plasmamembran überwachen können.