Name: pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit pHluorin-markierten Rezeptoren und TIRF-Mikroskopie die subzelluläre Lokalisation und den Transport von Membranproteinen in Maus-Neuroblastom-2A-Zellen in Echtzeit verfolgen können.

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Diese Arbeit wurde teilweise vom National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, dem National Institute on Drug Abuse DA 038817 und dem National Institute on Drug Abuse DA 040047 unterstützt.

1. Zellkultur und Transfektion <ol><li> Pflegen Maus Neuroblastom 2a (N2a) Zellen in Wachstumsmedien. <ol><li> Make 500 ml N2a Wachstumsmedien von 200 ml Dulbecco-Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose, 250 ml Serummedien reduziert, 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin / Streptomycin (100x). </li><li> Pflegen Zellen in einem T75 - Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Split Zellen 01.15 bei Bedarf oder bei etwa 80-90% Konfluenz. Dies ist typischerweise 2-3 mal pro Woche. </li></ol></li><li> Mantel 35 mm Glasbodenschale mit Poly-D-Lysin. <ol><li> In einem Biosicherheitsschrank laminare Strömung, 200 ul 0,1 ug / ml Poly-D-Lysin auf Glasbodenbereich von sterilen 35-mm-Schale. </li><li> Platzieren dish in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Spülen Sie vorsichtig Schale mit ddH 2 O 3-4 mal. </li><li> Lassen Sie Gerichte völlig trocken für mehr als 1 Stunde. </li><li> Sterilize Gerichte mit UV-Licht in der biologischen Sicherheit Kabinett, falls erforderlich. </li></ol></li><li> Platte N2a Zellen für TIRFM Bildgebung. <ol><li> Entfernen Wachstumsmedien von anhaftenden Zellen. </li><li> Abzulösen Zellen aus dem Kolben durch Inkubation mit 1 ml 1x Trypsin (+ EDTA) für 5 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Inactivate Trypsin durch Zugabe von 9 ml Wachstumsmedium. Medien-Mix, Trypsin und abgelösten Zellen mit einer Pipette. </li><li> Optisch zählen Zellen einer Zählkammer und berechnen Sie die richtige Volumen 90.000 Zellen zu jeder Poly-D-Lysin beschichtete Glasbodenschale hinzufügen verwenden. Diese Dichte ist für eine effiziente Transfektion und einzelne Zelle TIRF-Bildgebung erforderlich. </li><li> 2 ml Wachstumsmedium zu jedem Glasbodenschale mit 90.000 Zellen. </li><li> Inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 16-24 Std. </li></ol></li><li> N2a Transfektion <ol><li> Besorgen Sie sich ein Plasmidkonstrukt, enthaltend ein Fluorophor September aufgenommenin die extrazelluläre Region des Proteins von Interesse. Standard - Klonierungstechniken wie PCR - Amplifikation 5 kann das Konstrukt zu erzeugen , verwendet werden. HINWEIS SEP sollte in die extrazelluläre Region des Membranproteins eingebracht werden, so dass es innerhalb des Lumens des endoplasmatischen Retikulums oder Handels Vesikel befindet, und wird an extrazelluläre Lösung ausgesetzt, wenn sie auf der Plasmamembran. SEP in Größe ähnlich GFP und ähnliche Klonierungsstrategien verwendet werden können. </li><li> Ersetzen den Wachstumsmedien auf plattierten Zellen mit 1,5 ml reduzierte Serum - Medien (zB Opti-MEM), etwa 30 min vor der Zugabe des Transfektionsreagenz. ANMERKUNG: Um Medikament induzierte Veränderungen in Rezeptoren, eine geeignete Konzentration des Wirkstoffs kann zum Zeitpunkt der Transfektion hinzugefügt werden studieren. </li><li> In 500 ng jedes gewünschte Plasmidkonstrukt zu 250 &amp; mgr; l reduziert Serum-Medien (Rohr 1). </li><li> Fügen Sie 2 ul des Transfektionsreagenz in ein separates Röhrchen containing 250 ul reduziert Serum-Medien. Inkubieren Rohr 2 bei Raumtemperatur für 5 min. Das Verhältnis von Transfektionsreagenz der Plasmid-DNA sollte jedes Protein von Interesse zu exprimieren optimiert werden. </li><li> Kombinieren Rohre 1 und 2, um eine Lösung herzustellen, die 500 ul Transfektionsreagenz und Plasmid-Mix. für 25 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Fügen Sie die 500 ul Transfektionsgemisch vorab plattierten Zellen für ein Gesamtvolumen von 2 ml pro Schale. </li><li> Inkubiere Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden Das Transfektionsgemisch zu entfernen und die Zellen mit Wachstumsmedium gespült und dann wurden 2 ml Wachstumsmedium zu jeder Schale hinzu. HINWEIS: Wenn ein Medikament zum Zeitpunkt der Transfektion hinzugefügt wurde, kann es in diesem Schritt aufgefüllt wieder. </li><li> Inkubiere Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Bild-Zellen 48 Stunden nach der Transfektion. </li></ol></li></ol> 2. Live Cell Imaging von Total Ininterne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) <ol><li> Imaging einrichten <ol><li> Führen Bildgebung mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop Set-up mit einem Scantisch wie in Abbildung 1 dargestellt. Dies erfordert eine Ausrichtung eines 488 nm DPSS-Laserquelle, einen Schrittmotor 488 nm Strahlposition und eine hohe numerische Apertur (1,49 NA) 60X oder 100X -Ölimmersionsobjektiv einzustellen. </li><li> Führen Sie den Laserstrahl durch den geeigneten Anregungsfilter (Band 488/10 nm). Richten des polarisierten Laserstrahl durch eine Einzelmodenfaser mit einem Abschuß verbunden montiert mit einem Schrittmotor. In Epifluoreszenz-Modus wird der Anregungsstrahl in der Mitte der hinteren Öffnung des Objektivs zentriert. </li><li> Zu TIRF erreichen, verwenden, um die Schrittmotor den fokussierten Laserstrahl über die hinteren Apertur der Objektivlinse zu übertragen, bis der kritische Winkel erreicht wird und Strahl wird nicht mehr durch die Probe übertragen und stattdessen vollständig die Glas cel wegreflektiertl-Schnittstelle. </li><li> Aufnehmen von Bildern ein EMCCD (512 x 512 Pixel) gesteuert mit Imaging - Software (zB Metamorph) mit dem entsprechenden Emissionsfilter montiert im Emissions Weg mit (525/50 nm). </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Imaging - Lösung <ol><li> Bereiten 200 ml extrazelluläre Lösung (ECS) durch Mischen von 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES und 10 mM Glucose in ddH 2 O. Stammlösungen von NaCl, KCl, MgCl 2, und CaCl 2 kann im Voraus und in Kombination mit frischem HEPES und Glucose am Tag der Abbildungs hergestellt werden. </li><li> Der pH-Wert einer Lösung, die 100 ml ECS auf pH 7,4. Passen Sie die restlichen 100 ml ECS zu einem pH-Wert von 5,4. Spülen Sie die Zellen, die mit 2 ml ECS (pH 7,4). </li><li> 2 ml ECS (pH 7,4) zu den transfizierten Zellen vor der Bildgebung. </li></ol></li><li> Live - Cell - Imaging in TIRF <ol><li> Schalten Sie das gesamte System, including 488 nm Laser, Kamera, Übersetzungsstufe und Bildbearbeitungsprogramm. Focus der Epifluoreszenz Strahl und stellen Sie die Leistung auf etwa 1 mW am 60X Ziel. </li><li> In Öl auf das Ziel und legen Sie eine Schale von transfizierten Zellen auf der Translationsstufe. Befestigen Sie die Schale an Ort und Stelle montiert mit Bühne, damit es nicht in Bezug auf die Bühne bewegt, so dass die Zellen mehrfach abgebildet werden. </li><li> In Epifluoreszenz-Modus fokussieren Sie das Mikroskop und die fluoreszierenden, transfizierten Zellen zu lokalisieren. Die Zellen bleiben über mehrere Fokusebenen fokussiert. Suchen Sie einzelne, isolierte Zellen mit TIRF, um fortzufahren. </li><li> Im Imaging-Programm, stellen Sie die Belichtungszeit auf 200 ms und die Optimierung der Fluoreszenzintensität durch die EM-Verstärkungseinstellung. </li><li> Übergang des Laserstrahls in TIRF durch den Strahl über das Ziel in einer schrittweisen Art Übersetzen des Schrittmotors verwendet wird. Da der kritische Winkel nähert, wird der Strahl sichtbar über den Rand der Schale zu übersetzen, bis sie an th konvergierte Punkt der totalen inneren Reflexion an der Probenebene. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Zellen in TIRF-Modus sind durch den Fokusknopf einstellen. In TIRF kann nur eine Ebene von Zellen (dh etwa 150 nm aus Glas - Schnittstelle) fokussiert werden, ein sehr scharfes Bild mit hoher Auflösung von der Plasmamembran. </li></ol></li><li> Imaging September subzelluläre Lokalisierung zu bestimmen <ol><li> Lokalisieren gesund, transfiziert, einzelne Zellen in der Abbildungsebene. </li><li> Erwerben Sie ein scharfes Bild der Zelle bei pH 7,4. September markierten Rezeptoren auf der Plasmamembran und endoplasmatisches Retikulum sollte sichtbar sein. </li><li> Schnell den Laserstrahl blockieren die Probe erreicht Photobleaching zu verhindern. </li><li> Prägen Sie sich die Tischpositionen zu jeder Zelle entsprechende mehrere xy Stellen mit Mikroskop-Imaging-Software in der Lage, die Aufnahme. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1-2.4.4 für 20-30 Zellen pro Schale, während die Software die Position der einzelnen Zelle zu erfassen. </li><li> After alle Zellbilder bei pH 7,4 gesammelt werden, manuell mit einer Pipette pH 7,4 ECS-Lösung zu entfernen. Berühren Sie das Gericht nicht, da dies die gespeicherten Tischpositionen bewegen konnte. </li><li> Vorsichtig 2 ml pH 5,4 ECS in die Schale und 10 Minuten warten. Während dieser Zeit sparen zuvor aufgenommenen Bilder. </li><li> Unter dem gleichen Satz an Bedingungen verwendet, um Bilder bei pH 7,4 zu sammeln, um die Bühne zu jeder gespeicherten Position zu bewegen und ein Bild der gleichen Zelle bei pH 5,4 erhalten. Die Zellen sollten weniger aussehen definiert, da alle erfassten Fluoreszenz von endoplasmatischen Retikulum September beschränkt Ursprung markiert Rezeptoren. Speichern Sie die pH 5,4 Zellbildern. </li></ol></li><li> Imaging einzelne Vesikel Insertion Ereignisse in lebenden Zellen <ol><li> Ersetzen Wachstumsmedien von Zellen, die mit 2 ml pH-Wert 7,4 ECS oder mit Leibovitz L-15-Medien. Der pH - Wert von Leibovitz L-15 Medium ist CO 2 unabhängig, so dass Abbildungs über einen langen Zeitraum bei Bedarf zu übernehmen. </li><li> Place die Schale transfizierter Zellen auf der Bühne des Mikroskops. folgenden Schritt 2.3 Sichern und eine einzelne Zelle in TIRF konzentrieren. </li><li> Falls vorhanden, stellen Sie den Autofokus, so wird der Fokus nicht über den Zeitraum der Bildgebung driften. </li><li> Aufzeichnen einer Serie von 1000 Rahmen, kontinuierlich Bilder mit einer Bildrate von 200 msec zu erfassen. Bursts der Fluoreszenz wird während dieser Zeit, entsprechend niedrigem pH Handel Vesikel Verschmelzen mit der Plasmamembran, Belichten der SEP an die extrazelluläre pH 7,4 sichtbar. </li><li> Einen weiteren Einzelzelle und wiederholen Sie den Schritt. Autofokus zurückgesetzt, falls erforderlich. </li></ol></li></ol> 3. Bildanalyse und Datenverarbeitung <ol><li> Analyse September Fluoreszenz zu bestimmen subzelluläre Lokalisierung <ol><li> Öffnen Sie die Zelle Bilder mit einer Bildanalysesoftware wie Metamorph oder ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Ziehen Sie den Hintergrund von sowohl pH 5,4 und pH 7,4 Bilder, um die Rollkugel-Einstellung.</li><li> Verwenden Sie eine Intensität basierend Fluoreszenzschwellen aus einer einzigen Zelle zu quantifizieren. Wählen Sie manuell eine Region von Interesse rund um die Zelle in dem pH-Wert 7,4 Bild. </li><li> Messen Sie den Zellbereich, mittlere Intensität und integrierte Dichte unter Verwendung eines Plug-in ImageJ oder mit der in Funktion &quot;Messen&quot; unter der Registerkarte Analysieren gebaut. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1-3.1.3 für die gleiche Zelle bei pH 5,4, sorgfältig die Intensität basierend Schwelle und der Region von Interesse in der gleichen Art und Weise anpassen. </li><li> Nachdem die integrierte Dichte für die Zell Bilder sowohl bei pH 7,4 und 5,4 erhalten wird, berechnet die Plasmamembran integriert Dichte durch den pH-Wert 5,4 Wert aus dem pH-Wert 7,4 subtrahiert wird. Die Differenz entspricht der relativen Anzahl Rezeptoren auf der Plasmamembran innerhalb der TIRF Anregungsbereich. </li><li> Als Maß für Handel, die Berechnung der relativen Prozentsatz SEP Rezeptoren markiert auf der Plasmamembran liegt im Vergleich zu den restlichen Rezeptoren sichtbar in den TIRF excitatiauf Volumen, das durch die Plasmamembran integriert Dichte durch die gesamte integrierte Dichte bei pH 7,4, multipliziert mit 100 geteilt wird. </li></ol></li><li> Analyse einzelne Vesikel Einführungsveranstaltungen <ol><li> Öffnen Sie die Serie von 1000 TIFF-Bilder mit einer Bildanalysesoftware. Ziehen Sie den Hintergrund aus allen Rahmen, die die Rollkugel-Einstellung. </li><li> Passen Sie die Farbbalance der Aufnahme intensiver Regionen zu maximieren entsprechenden Einführungsveranstaltungen Vesikel. Zählen Sie manuell die Ausbrüche von Fluoreszenz einer Dauer von mehr als 3 Bilder (&gt; 600 ms). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Die pH - Empfindlichkeit SEP ermöglicht Rezeptoren auf der Plasmamembran wohn aus intrazellulären Rezeptoren im endoplasmatischen Retikulum zu unterscheiden, und es kann verwendet werden , um Einfügungs Ereignisse von Rezeptor-tragenden Vesikeln 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 zu lösen . Verschieden...

Veränderungen der Rezeptor - Expression, Verteilung und Anordnung haben zu einer Vielzahl von Krankheiten verbunden ist, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, zystischer Fibrose und Drogenabhängigkeit 1, 2, 3, 4, 5. Zum Beispiel beeinflussen Nikotin und andere Nikotinliganden des Handels mit nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) , was zu Veränderungen in Handel, Ausdruck und upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nikotin erhöht sich die Gesamtzahl der zusammengesetzten nAChRs innerhalb einer Zelle erhöht Handel in Richtung der Plasmamembran, eind ändert die Montage von Untereinheiten eine hohe Empfindlichkeit Version einiger Subtypen zu begünstigen. Beheben von deutlichen Veränderungen in Handel, Montage und Expression von Rezeptoren in einem Krankheitsmodell liefert wichtige mechanistische Details, die Droge wesentlich sind Ziele zu definieren. Ein idealer Ansatz würde zwischen intrazelluläre Rezeptoren und diejenigen, lokalisiert auf der Plasmamembran schnell unterscheiden. Dies ist besonders anspruchsvoll in Fällen, in denen eine Mehrheit eines bestimmten Proteins intrazellulär befindet, wie mit nAChRs. Da die Mehrheit der nAChR zum endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind, fehlt traditionelle Messungen die räumlich-zeitliche Auflösung erforderlich Lokalisierung und -handel Veränderungen entlang des sekretorischen Weg zu lokalisieren. Receptor Handel und Expressionsstudien von nAChR wurden in erster Linie durchgeführt unter Verwendung von Radioligand 11 Bindung, Biotinylierung Assays 12, Western - Blot - 13 oder Immunpräzipitation techniq<html> ues 12. Diese sind abhängig von der Bindungsspezifität eines Reportermoleküls oder Fixierung der Zellen und fehlt die Fähigkeit, gleichzeitig zwischen Plasmamembran resident und intrazelluläre Rezeptoren unterscheiden. Daher haben Studien an Ionenkanalanordnung und Vesikel Dynamik weitgehend stützte sich auf niedrigem Durchsatz elektro Techniken 14. Superior räumliche und zeitliche Auflösung ist möglich, mit den Fortschritten in der Fluoreszenzmikroskopie. Genetisch kodierte Reportermoleküle, wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) und dessen Varianten, unspezifische Bindung Probleme beseitigen und 15 Empfindlichkeit erhöhen. Eine pH - empfindliche Variante von GFP, wie superecliptic pHluorin (SEP) bekannt ist , kann verwendet werden , um inhärente Unterschiede zwischen pH Kompartimenten innerhalb einer Zelle auszunutzen Lokalisierungs 5, 7, 8, um zu bestimmen ,ref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. fluoresziert September , wenn der pH - Wert höher als 6 ist, aber bei niedrigeren pH - Wert in einem Aus - Zustand bleibt. Daher SEP markierten Rezeptoren auf ihrer luminalen Seite , wenn sie in das endoplasmatische Retikulum detektiert werden ( ER) oder beim Einführen in die Plasmamembran (PM), aber nicht, wenn sie einer Handel Vesikel eingeschlossen. Manipulation der extrazellulären pH in Kontakt mit Rezeptoren auf der Plasmamembran ändert folglich die Fluoreszenz und damit Nachweis dieser Rezeptoren. Wenn die gleiche Zelle sequentiell sowohl bei einem neutralen extrazellulären pH abgebildet wird und dann einen pH - Wert niedriger als 6 ist , die Differenz zwischen den Bildern an Rezeptoren auf der Plasmamembran zurückgeführt wird. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Messung von intrazellulärem (peripheral ER) und Plasmamembran resident Rezeptoren 5, 7, 8 </sup&gt;, 9. Einzelne Vesikel Insertion Ereignisse können auch aufgelöst werden, wenn der extrazellulären pH neutral ist. Wenn ein niedriger pH Handel Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt, wird der luminalen Seite des Vesikels in die neutrale extrazellulären Lösung ausgesetzt wird , einen Übergang als Burst von Fluoreszenz nachgewiesen verursacht 7, 18, 19, 20. September ermöglicht die Messung von Rezeptoren auf der Plasmamembran und peripheren endoplasmatischen Retikulum lokalisiert und stellt ein Mittel Handel von Rezeptoren zwischen diesen subzelluläre Bereiche 5 zu messen, 7, 18. Um eine höhere Auflösung in der Plasmamembran zu erreichen, ein Rezeptor SEP genetisch kodiert wird durch innere Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) abgebildet. Dieses Verfahren ist insbesonderenützlich, wenn die Mehrheit der Rezeptoren an intrazelluläre Regionen lokalisiert, da TIRFM erhöht die Sichtbarkeit der Plasmamembran. TIRFM ermöglicht auch die Auflösung des Menschenhandels Dynamik einzelner Vesikel September-markierten Rezeptoren beim Einsetzen in die PM trägt. Eine innere Totalreflexion tritt mit unterschiedlichen Brechungsindizes an der Grenzfläche von Materialien, wie beispielsweise zwischen einer Zelle und einem Glasdeckglas 21, 22. September fluoresziert, wenn es mit 488 nm Anregung bestrahlt, die ausgerichtet ist, eine innere Totalreflexion an der Grenzfläche des Glases und Zelllösung zu erreichen. Dadurch ergibt sich eine abklingende Welle, die etwa 150 nm in die Probe eindringt, nur spannende Fluorophore innerhalb dieses Volumens. Nur September Rezeptoren in einem neutralen pH-Umgebung innerhalb dieses Bereichs von Anregungs werden enthaltenden detektiert, die denen entsprechen, auf der Plasmamembran oder peripheren endoplasmatischen Retikulum befinden. Da Erkennung begrenzt to Anregung durch die abklingende Welle, die Hintergrundfluoreszenz von der intrazellulären Region verringert und das Signal - Rausch - Verhältnis 21 erhöht, 22. Darüber hinaus, da Strahlung nicht den Großteil der Zelle nicht durchdringen, wird Lichtschäden minimiert die Bildgebung im Laufe der Zeit lebenden Zellen erlaubt. Als Ergebnis gekoppelt TIRFM mit genetisch kodierten September bietet die hohe Auflösung und Empfindlichkeit erforderlich subzelluläre Lokalisation und -handel Dynamik von Membranrezeptoren entlang des sekretorischen Weg zu messen.

<table><tbody><tr><td>Reagenz/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen mit Filterkappe, steril, Greiner Bio One, 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen mit Glasboden, steril</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium&lrm; (DMEM), hoher Glukosegehalt</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-965-084&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serummedium</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert, US-Herkunft, Standard (sterilgefiltert)&nbsp;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1x), kein Phenolrot</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Lösung</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, kein Phenolrot</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Optionales</td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td>Vorsichtig mischen; Nicht wirbeln</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Objektives Immersionsöl&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Typ F</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>60X, 1.49 NA Öl-Immersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Tisch</td><td>Prior</td><td>IXPROXY</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Aktuator (Schrittmotor)</td><td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph (oder ein anderes Bildgebungsprogramm)</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm Laser</td><td>Market Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Singlemode-Faser</td><td>Thorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Bandpassfilter, 488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Bandpassfilter, 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

phluorin-getaggt receptors verwendung zu überwachen subzelluläre lokalisierung und handel

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Verstehen Membranprotein Handel, Montage und Ausdruck erfordert einen Ansatz, der zwischen die Personen mit Wohnsitz in intrazellulären Organellen und die lokalisierte auf der Plasmamembran unterscheidet. Traditionelle fluoreszenzbasierte Messungen fehlt die Fähigkeit Membranproteinen zu unterscheiden in unterschiedlichen Organellen befinden. Modernste Methoden überwinden traditionellen Methoden durch pH-sensitive Fluorophore mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) Kopplung. TIRF Beleuchtungs regt die Probe bis zu etwa 150 nm von der Glasprobe Schnittstelle, wodurch Hintergrund abnimmt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und zu verbessern Auflösung. Das Anregungsvolumen in TIRFM umfasst die Plasmamembran und in der Nähe Organellen wie die periphere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) ist ein pH-empfindliche Version von GFP. Genetisch September kodiert, in die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins von Interesse positioniert das Fluorophor aufdie luminale Seite des ER und in der extrazellulären Region der Zelle. SEP fluoreszierend, wenn der pH-Wert größer als 6 ist, sondern bleibt in einem Aus-Zustand bei niedrigeren pH-Werten. Daher Rezeptoren SEP fluoreszieren markiert, wenn in dem endoplasmatischen Reticulum (ER) oder beim Einführen in die Plasmamembran (PM) aufhalten, jedoch nicht, wenn sie einer Handel Vesikel oder andere Organellen wie der Golgi beschränkt. Die extrazelluläre pH kann eingestellt werden, um die Fluoreszenz von Rezeptoren auf der Plasmamembran zu diktieren. Der Unterschied in der Fluoreszenz zwischen TIRF Bilder bei neutralen und sauren extrazellulären pH-Wert für die gleiche Zelle entspricht einer relativen Anzahl von Rezeptoren auf der Plasmamembran. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Messung von intrazellulären und Plasmamembran-Rezeptoren resident. Single Vesikel Insertionsereignisse kann auch gemessen werden, wenn der extrazelluläre pH neutral ist, entsprechend einem niedrigen pH Handel Vesikel mit der Plasmamembran verschmelzen und in einen fluoreszierenden Zustand übergeht. Diese versatilE-Technik kann die Lokalisierung, Ausdruck und Handel von Membranproteinen zu untersuchen ausgenutzt werden.

September Einbau in einen Rezeptor erlaubt den direkten Nachweis des Rezeptors in einer lebenden Zelle. Gekoppelt mit TIRFM ermöglicht dies die Bewertung der relativen Expressionsniveaus auf der Plasmamembran und der Verteilung von Rezeptoren innerhalb der subzellulären Orten im Bereich der TIRF Erregung. Einzelne Vesikeltransport Ereignisse können auch gelöst werden. Relative Expression von September-markierten Rezeptoren auf Pl...

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Das übergeordnete Ziel dieser Fluoreszenzbildgebungsmethode besteht darin, Veränderungen im Membranproteintansport und in der intrazellulären Verteilung zu überwachen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Veränderungen des Proteintansports, wie beispielsweise die Auswirkungen genetischer Mutationen oder pharmakologischer Substanzen auf die Geschwindigkeit der Vesikeltransporte und die Proteinausprägung an der Zelloberfläche. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Messungen schnell, mit hoher Auflösung, in Echtzeit und ohne Zerstörung der Probe durchgeführt werden können.48 Stunden vor der Bildgebung werden Maus-Neuroblastom-2A-Zellen mit einem Plasmid-Konstrukt transfiziert, das SEP enthält, einen pH-empfindlichen Fluorophor, der in den extrazellulären Bereich des Proteins der Untersuchung eingebaut ist. Wenn die transfizierten Zellen bereit für die Bildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie oder TIRF-Mikroskopie sind, geben Sie zwei Milliliter pH-7,4-extrazelluläre Lösung oder ECS zu den Zellen hinzu. Stellen Sie eine Zellkultur-Schale auf den Verschiebestage und sichern Sie die Schale mit Hilfe von Halterungen am Stage.Im Epifluoreszenzmodus das Mikrosko

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von Live Cell Imaging und Photobleichmittels Techniken, um die Oberfläche Ausdruck, Transportwege und-handel Kinetik der exogen exprimiert, pH-sensitiven GFP-markierten Proteine ​​an der Plasmamembran von Nervenzellen zu ermitteln.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

Wir beschreiben hier die Verwendung einer pH-empfindlichen grünen fluoreszierenden Proteinvariante, pHLuorin, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Beratungsrezeptorenhandels an der Zelloberfläche zu untersuchen. Der pHluorin-markierte Rezeptor wird sowohl in der Zellkultur als auch in vivomit Elektroporation des Kükenembryons exprimiert.

Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse.

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

Eine genaue Quantifizierung vesikulärer Transportereignisse liefert oft wichtige Einblicke in die Rolle bestimmter Proteine und die Auswirkungen von Mutationen. In diesem Artikel werden Methoden zur Verwendung von superekliptikem pHluorin, einer pH-sensitiven GFP-Variante, als Werkzeug zur Quantifizierung endozytärer Ereignisse in lebenden Zellen mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie vorgestellt.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Bild-Zellen, die das grün fluoreszierende Protein-markierten Angiotensin Typ 1a-Rezeptoren während der Endozytose durch Angiotensin-II-Behandlung eingeleitet werden. Diese Technik beinhaltet die Kennzeichnung Lysosomen mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, und dann Software die Co-Lokalisierung des Rezeptors und Lysosom in drei Dimensionen über die Zeit zu analysieren, verwendet.

Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

Erfahren Sie, wie Sie mit pHluorin-markierten Rezeptoren und TIRF-Mikroskopie die subzelluläre Lokalisation und den Transport von Membranproteinen in Maus-Neuroblastom-2A-Zellen in Echtzeit verfolgen können.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

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