Mit einer vollständigen immunhistochemischen Methode, um die Innervation der Gallenwege zu studieren Suncus murinus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die immunhistochemische Färbung des gesamten Mount zur Visualisierung der Nervenverteilung innerhalb der Gallenwege von Suncus murinus einzusetzen. Mit dieser Methode kann die Nervenverteilung der viszeralen Organe vieler Spezies analysiert werden, insbesondere bei unregelmäßigen oder kleinen Organen, die mit Standardmethoden nur schwer zu beurteilen sind. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass die Bedienung einfach ist.

Es erfordert keine komplizierten Verfahren und hat eine hohe Erfolgsquote. Yidan Dai, ein Doktorand, und Shuang-Qin Yi, ein Forschungsstipendiat, beide aus meinem Labor, werden das Verfahren mit mir demonstrieren. Beginnen Sie damit, das Tier mit einzelnen PBS- und 4%-Paraformaldehyd-Perfusionen in einem Abzug zu spülen.

Injizieren Sie dann zwei bis drei Milliliter weißes Neoprenlatex durch den Perfusionskatheter in die Bauchschlagader, um die Blutgefäße zu markieren. Und wenn alle Gewebe von Interesse markiert sind, extrahieren Sie die Bauchorgane und die zugehörigen Nerven und Gefäße. Injizieren Sie dann etwa 0,1 Milliliter blaues Neoprenlatex in die Gallenblase, um das Gallensystem zu markieren, und fixieren Sie das Gewebe über Nacht bei 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius für die Immunfärbung der gesamten Halterung.

Am nächsten Morgen geben Sie die Probe in ein Glasfläschchen für vier einstündige Waschgänge bei Raumtemperatur in destilliertem Wasser auf einem Nährwert. Nach der letzten Wäsche inkubieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter 1%iger orthoperiodischer Säure, um intrinsische Peroxidasereaktionen zu vermeiden. Anschließend wird die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation in frisch zubereitetem 0,004 %-Papillon in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit konstanter Temperatur unter leichtem Schaukeln.

Waschen Sie die Probe am Ende der Inkubation 50 bis 60 Minuten lang mit destilliertem Wasser. Lagern Sie das Gewebe dann über Nacht in 4%-Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen waschen Sie die Probe wie gerade gezeigt in destilliertem Wasser, gefolgt von einer weiteren zweistündigen Inkubation in frisch vorbereitetem Papillon.

Waschen Sie die Probe weitere 50 bis 60 Minuten in destilliertem Wasser, gefolgt von einer Fixierung über Nacht in 4 % Paraformaldehyd. Waschen Sie das Gewebe am dritten Morgen viermal in destilliertem Wasser, gefolgt von einem Eintauchen in drei aufeinanderfolgende aufsteigende 30-minütige Saccharose-Inkubationen. Anschließend frieren Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten ein, gefolgt von einem vollständigen Auftauen bei Raumtemperatur.

Nach dem dritten Gefrier-Tau-Zyklus wird die Probe in 2 %Triton X-100 überführt, um sie über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Am nächsten Morgen wird die Probe in einen Behälter mit dem primären Antikörper von Interesse umgefüllt, um den Nutator je nach Größe der Probe drei bis sechs Tage lang bei vier Grad Celsius sanft zu schaukeln. Nach der entsprechenden Markierungsphase wird der ungebundene Primärantikörper mit vier einstündigen Waschgängen in PBS bei Raumtemperatur entnommen und die Probe drei Tage lang unter leichtem Schaukeln bei vier Grad Celsius mit dem entsprechenden Sekundärantikörper markiert.

Am Ende der Periode der Markierung von sekundären Antikörpern waschen Sie die Probe viermal in PBS. Dann inkubieren Sie das Gewebe in 10 Mikrolitern 30%igem Wasserstoffperoxid in 100 Millilitern frisch zubereiteter 0,002%iger DAB-Färbelösung bei vier Grad Celsius für 16 bis 72 Stunden unter leichtem Schaukeln. Wenn die optimale Färbeintensität erreicht ist, überführen Sie die Probe in 0,04 % Natriumazid in PBS, um die Färbereaktion zu stoppen.

Tauchen Sie dann die Probe vorsichtig in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit frischem PBS und nehmen Sie mit einer an einem Stereomikroskop montierten Kamera Bilder des Gewebes auf. Neben der Visualisierung der Innervation der extrahepatischen Gallenwege ermöglicht die Markierung mit Antikörpern gegen Neurofilament-positive Nervenfasern auch die eindeutige Identifizierung der Lauf- und Verteilungsdichte des Vagusnervs entlang der Speiseröhre bis in den Magen. Die Markierung der Blutgefäße der Gallenblase mit weißem Neoprenlatex zeigt eine dünne Nervenfibrose in hohem Kontrast zu den umgebenden Geweben mit einer höheren Innervationsdichte, die im Hals der Gallenblase beobachtet wird als im Fundus.

Im oberen Gallengang werden zwei Arten von Nervenbündeln bezeichnet, die feinen Nervenbündel, die ein unregelmäßiges und dichtes Nervennetz bilden und adhäsiv auf und in den Gallenwegen verlaufen, und die dickeren Nervenbündel, die parallel zur Oberfläche der Gallenwege verteilt sind. Die Markierung des Gallengangs communis mit blauem Neoprenlatex und der Gefäße mit weißem Neoprenlatex ermöglicht die Visualisierung der dünnen Nervenfasern am Ende des Gallengangs communis und des Papillenbereichs des Zwölffingerdarms. Bevor Sie dieses Verfahren ausprobieren, sollten Sie den Zeitplan für jedes der Experimente durchspielen, da der gesamte Prozess zwei bis drei Wochen in Anspruch nimmt.

Um eine Beschädigung der Probe beim Wechseln der Lösungen zu vermeiden, gießen Sie die Lösungen immer aus, anstatt die Probe mit einer Pinzette zu entfernen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, diese Technik auf die Markierung einer Reihe von Nerven in verschiedenen viszeralen Organen anzuwenden.