Mit einer vollständigen immunhistochemischen Methode, um die Innervation der Gallenwege zu studieren Suncus murinus
15. Juni 2017
Ein ganzheitlicher immunhistochemischer Ansatz, um die Neurofilament-Protein-Expression im extrahepatischen Gallengang in Suncus murinus zu visualisieren. Wird hier vorgestellt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Innervation aller viszeralen Organe in S. murinus oder anderen Spezies zu analysieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die immunhistochemische Färbung des gesamten Mount zur Visualisierung der Nervenverteilung innerhalb der Gallenwege von Suncus murinus einzusetzen. Mit dieser Methode kann die Nervenverteilung der viszeralen Organe vieler Spezies analysiert werden, insbesondere bei unregelmäßigen oder kleinen Organen, die mit Standardmethoden nur schwer zu beurteilen sind. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass die Bedienung einfach ist.
Es erfordert keine komplizierten Verfahren und hat eine hohe Erfolgsquote. Yidan Dai, ein Doktorand, und Shuang-Qin Yi, ein Forschungsstipendiat, beide aus meinem Labor, werden das Verfahren mit mir demonstrieren. Beginnen Sie damit, das Tier mit einzelnen PBS- und 4%-Paraformaldehyd-Perfusionen in einem Abzug zu spülen.
Injizieren Sie dann zwei bis drei Milliliter weißes Neoprenlatex durch den Perfusionskatheter in die Bauchschlagader, um die Blutgefäße zu markieren. Und wenn alle Gewebe von Interesse markiert sind, extrahieren Sie die Bauchorgane und die zugehörigen Nerven und Gefäße. Injizieren Sie dann etwa 0,1 Milliliter blaues Neoprenlatex in die Gallenblase, um das Gallensystem zu markieren, und fixieren Sie das Gewebe über Nacht bei 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius für die Immunfärbung der gesamten Halterung.
Am nächsten Morgen geben Sie die Probe in ein Glasfläschchen für vier einstündige Waschgänge bei Raumtemperatur in destilliertem Wasser auf einem Nährwert. Nach der letzten Wäsche inkubieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter 1%iger orthoperiodischer Säure, um intrinsische Peroxidasereaktionen zu vermeiden. Anschließend wird die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation in frisch zubereitetem 0,004 %-Papillon in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit konstanter Temperatur unter leichtem Schaukeln.
Waschen Sie die Probe am Ende der Inkubation 50 bis 60 Minuten lang mit destilliertem Wasser. Lagern Sie das Gewebe dann über Nacht in 4%-Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen waschen Sie die Probe wie gerade gezeigt in destilliertem Wasser, gefolgt von einer weiteren zweistündigen Inkubation in frisch vorbereitetem Papillon.
Waschen Sie die Probe weitere 50 bis 60 Minuten in destilliertem Wasser, gefolgt von einer Fixierung über Nacht in 4 % Paraformaldehyd. Waschen Sie das Gewebe am dritten Morgen viermal in destilliertem Wasser, gefolgt von einem Eintauchen in drei aufeinanderfolgende aufsteigende 30-minütige Saccharose-Inkubationen. Anschließend frieren Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten ein, gefolgt von einem vollständigen Auftauen bei Raumtemperatur.
Nach dem dritten Gefrier-Tau-Zyklus wird die Probe in 2 %Triton X-100 überführt, um sie über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Am nächsten Morgen wird die Probe in einen Behälter mit dem primären Antikörper von Interesse umgefüllt, um den Nutator je nach Größe der Probe drei bis sechs Tage lang bei vier Grad Celsius sanft zu schaukeln. Nach der entsprechenden Markierungsphase wird der ungebundene Primärantikörper mit vier einstündigen Waschgängen in PBS bei Raumtemperatur entnommen und die Probe drei Tage lang unter leichtem Schaukeln bei vier Grad Celsius mit dem entsprechenden Sekundärantikörper markiert.
Am Ende der Periode der Markierung von sekundären Antikörpern waschen Sie die Probe viermal in PBS. Dann inkubieren Sie das Gewebe in 10 Mikrolitern 30%igem Wasserstoffperoxid in 100 Millilitern frisch zubereiteter 0,002%iger DAB-Färbelösung bei vier Grad Celsius für 16 bis 72 Stunden unter leichtem Schaukeln. Wenn die optimale Färbeintensität erreicht ist, überführen Sie die Probe in 0,04 % Natriumazid in PBS, um die Färbereaktion zu stoppen.
Tauchen Sie dann die Probe vorsichtig in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit frischem PBS und nehmen Sie mit einer an einem Stereomikroskop montierten Kamera Bilder des Gewebes auf. Neben der Visualisierung der Innervation der extrahepatischen Gallenwege ermöglicht die Markierung mit Antikörpern gegen Neurofilament-positive Nervenfasern auch die eindeutige Identifizierung der Lauf- und Verteilungsdichte des Vagusnervs entlang der Speiseröhre bis in den Magen. Die Markierung der Blutgefäße der Gallenblase mit weißem Neoprenlatex zeigt eine dünne Nervenfibrose in hohem Kontrast zu den umgebenden Geweben mit einer höheren Innervationsdichte, die im Hals der Gallenblase beobachtet wird als im Fundus.
Im oberen Gallengang werden zwei Arten von Nervenbündeln bezeichnet, die feinen Nervenbündel, die ein unregelmäßiges und dichtes Nervennetz bilden und adhäsiv auf und in den Gallenwegen verlaufen, und die dickeren Nervenbündel, die parallel zur Oberfläche der Gallenwege verteilt sind. Die Markierung des Gallengangs communis mit blauem Neoprenlatex und der Gefäße mit weißem Neoprenlatex ermöglicht die Visualisierung der dünnen Nervenfasern am Ende des Gallengangs communis und des Papillenbereichs des Zwölffingerdarms. Bevor Sie dieses Verfahren ausprobieren, sollten Sie den Zeitplan für jedes der Experimente durchspielen, da der gesamte Prozess zwei bis drei Wochen in Anspruch nimmt.
Um eine Beschädigung der Probe beim Wechseln der Lösungen zu vermeiden, gießen Sie die Lösungen immer aus, anstatt die Probe mit einer Pinzette zu entfernen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, diese Technik auf die Markierung einer Reihe von Nerven in verschiedenen viszeralen Organen anzuwenden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Immunhistochemie-Methode für Präparate in Ganzpräparaten vorgestellt, um die Expression von Neurofilamentproteinen im extrahepatischen Gallengang von Suncus murinus sichtbar zu machen. Die Methode ermöglicht die Analyse der Nervenverteilung in viszeralen Organen, insbesondere solchen, die klein oder unregelmäßig geformt sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunhistochemie
- Analyse viszeraler Organe
Hintergrund
- Die Immunhistochemie am Gesamtpräparat ist eine Technik zur Visualisierung der Nervenverteilung.
- Suncus murinus dient als Modellorganismus zur Untersuchung der Innervation viszeraler Organe.
- Diese Methode bietet Vorteile bei kleinen oder unregelmäßigen Organen, die mit Standardverfahren schwer zu beurteilen sind.
- Das Protokoll ist einfach und weist eine hohe Erfolgsrate auf.
Zweck der Studie
- Die Nervenverteilung im Gallensystem von Suncus murinus sichtbar machen.
- Eine zuverlässige Methode zur Analyse der Innervation verschiedener viszeraler Organe bereitstellen.
- Das Verfahren zu Lehrzwecken demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Spülung des Tieres mit PBS und 4 % Paraformaldehyd-Perfusion.
- Ganzpräparat-Immunhistochemie-Färbung.
- Sichtbarmachung der Neurofilament-Proteinexpression.
- Demonstration durch Doktoranden und wissenschaftliche Mitarbeiter.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Nervenverteilung im Gallengangsystem.
- Nachweis der Wirksamkeit der Methode für kleine und unregelmäßige Organe.
- Hohe Erfolgsrate der Ganzpräparat-Immunhistochemie-Technik.
Schlussfolgerungen
- Die Immunhistochemie an Ganzpräparaten eignet sich zur Analyse der Nervenverteilung.
- Diese Technik kann auf verschiedene Arten jenseits von Suncus murinus angewendet werden.
- Das Protokoll ist einfach und für Forschende leicht zugänglich.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese immunhistochemische Ganzpräparat-Methode ermöglicht die Visualisierung der Nervenverteilung in viszeralen Organen und unterstützt die Zielstrukturenvalidierung in der Neurogastroenterologie und der Forschung zum autonomen Nervensystem. Durch die Bereitstellung hochauflösender Abbildungen von Innervationsmustern in kleinen oder unregelmäßig geformten Organen leistet sie einen Beitrag zur mechanistischen Ent-Risikobewertung therapeutischer Zielstrukturen, die an der Funktion der Gallenwege beteiligt sind. Der Ansatz bietet eine vorhersagende Sicherheit für frühe Entdeckungsprogramme, die auf die neuronale Modulation der Physiologie viszeraler Organe ausgerichtet sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die mit der Funktion des Vagusnervs und der viszeralen Nerven im Zusammenhang mit der Regulation der Gallenwege verbunden sind.
- Operationaler Wert: Bietet eine zuverlässige Methode zur funktionellen Zielstrukturvalidierung durch direkte Visualisierung der Verteilung neurofilamentpositiver Nervenfasern.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem die Beteiligung neuronaler Bahnen an der Homöostase der Gallenwege und an Krankheitsmodellen geklärt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Bildschirmierung vor, indem Baseline-Innervationskarten der Gallenwege erstellt werden.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die Messung der Nervenfaserdichte und Verteilungsmuster und unterstützt so die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays.
- Plattformnutzung: Anpassbar an andere neuronale Antikörper, wodurch eine skalierbare Anwendung über verschiedene viszerale Organsysteme hinweg nach initialer Optimierung möglich ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem eine konsistente Analyse der Innervation von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung ermöglicht wird.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem der Einfluss des Nervensystems auf die Funktion der Gallenwege in präklinischen Modellen geklärt wird.
- Biomarker-Ausrichtung: Ermöglicht die Korrelation struktureller Veränderungen der Innervation mit funktionellen Messgrößen bei der translationale Entwicklung von Biomarkern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Testung von Zielhypothesen über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung, insbesondere für neuromodulatorische Ansätze bei Gallenwegs- und viszeralen Organerkrankungen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Visualisierung der Nervenverteilung im Gallengangsystem und in assoziierten Organen wie Speiseröhre und Magen.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Gewebevorbereitung und immunhistochemische Färbungen mit hoher Erfolgsrate, wodurch eine zuverlässige Bewertung der Wirkstoffeffekte auf neuronale Strukturen ermöglicht wird.
- Analytik: Erzeugt quantitative neuroanatomische Daten zur Dichte und Verteilung von Nervenbündeln und unterstützt so den Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung mit der präklinischen Kontinuität, indem eine konsistente Beurteilung der Innervation über verschiedene Modellsysteme hinweg ermöglicht wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare histologische Plattform für Untersuchungen zur Versorgung viszeraler Organe durch Nerven, die an verschiedene Arten und neuronale Marker anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten bei der neuronalen Steuerung viszeraler Organe verringert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch einen einfachen Protokollablauf mit hoher Erfolgsrate und minimiert so die technische Variabilität.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem klare Daten zur neuronalen Anatomie bereitgestellt werden, wodurch das biologische Risiko in neuro-viszeralen Therapieprogrammen in späteren Entwicklungsstadien reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten Innervationsmustern in krankheitsrelevanten Systemen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunhistochemie, Gewebedissection sowie konfokaler oder stereoskopischer Mikroskopie für die Ganzpräparat-Bildgebung.
- Setzt den Zugang zu primären und sekundären Antikörpern, enzymatischen Inaktivierungsreagenzien und DAB-Substrat für die farbmetrische Detektion voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Fixierung, Permeabilisierung (z. B. Triton X-100) und Antikörper-Inkubationsbedingungen über verschiedene Labore hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung auf verschiedene viszerale Organe oder Spezies, insbesondere bezüglich der Optimierung von Antikörpern und Permeabilisierungszeiten.
- Eingeschränkt durch den zeitlichen Rahmen von zwei bis drei Wochen pro Experiment, was eine sorgfältige Planung für Längsschnittstudien notwendig macht.
