Die Anwendung von genetisch kodierter Fluorescent Stickstoffmonoxid (NO) • Sonden, die geNOps, für Echtzeit-Imaging von NO • Signale in Einzelzellen
16. März 2017
Dieses Manuskript präsentiert Protokolle für die Anwendung neuartiger genetisch kodierter Stickstoffmonoxid (NO•)-Sonden (geNOps) zur Überwachung von NO•-Fluktuationen einzelner Zellen in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die Ca2+-getriggerte NO•-Bildung auf der Ebene einzelner Endothelzellen wurde durch die Kombination von geNOps mit einem chemischen Ca2+-Sensor sichtbar gemacht.
Das übergeordnete Ziel dieses bildgebenden Ansatzes ist es, die Stickoxid-Signale in Echtzeit auf der Ebene einzelner Zellen mit Hilfe einer neuartigen Klasse von genetisch kodierten fluoreszierenden Stickstoffmonoxid-Sonden, den geNOps, zu überwachen. In Anbetracht der Bedeutung von Stickstoffmonoxid in der Biologie und Physiologie ist seit seiner Entdeckung eine Visualisierung dieses Moleküls auf zellulärer oder sogar subzellulärer Ebene wünschenswert. Wir visualisieren die Stickoxid-Signale mit neuartigen, recht einfach aufgebauten, fluoreszierenden Protein-basierten Sonden, den geNOps.
Die geNOps reagieren direkt und unmittelbar auf Stickstoffmonoxid durch Fluoreszenz-Quench. Das bedeutet, dass Sie die Kinetik der Erzeugung, Diffusion und des Abbaus von Stickstoffmonoxid in einzelnen Zellen in Echtzeit überwachen können. Der Hauptvorteil von geNOps besteht darin, dass man Stickstoffmonoxid-Signale tatsächlich mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop betrachten kann.
Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den Lagerpuffer der Endothelzelllinie oder der HEK293-Zellen durch einen Milliliter der Eisen(II)booster-Lösung bei Raumtemperatur ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen genau 20 Minuten lang in der Dunkelheit. Das Eisenladeverfahren ist unerlässlich, um die volle Reaktionsfähigkeit der Sonden zu erreichen, und kann für verschiedene Zelltypen und Anwendungen angepasst werden.
Waschen Sie die Zellen danach einmal mit Lagerpuffer und inkubieren Sie jede Vertiefung mit zwei Millilitern Lagerpuffer für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen ausgleichen können. Ersetzen Sie dann den Speicherpuffer durch 3,3 Mikromolare Fura-2AM in einem Milliliter Speicherpuffer. Schützen Sie die Zellen vor Licht und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang.
Waschen Sie die Zellen nach 45 Minuten zweimal mit Lagerpuffer und inkubieren Sie sie erneut für mindestens 30 Minuten, damit sich die Zellen ausgleichen können. Zu Beginn des Eingriffs wird zunächst ein 30 Millimeter großes, mit der Endothelzelllinie oder HEK293-Zellen beschichtetes Deckglas in einer Perfusionskammer aus Metall fixiert. Schalten Sie das Bildgebungssystem ein und platzieren Sie dann die Metallperfusionskammer auf dem Mikroskop.
Verbinden Sie den Zuflussschlauch mit den Pufferbehältern und schalten Sie dann das Perfusionssystem ein. Schließen Sie nun den Ausfluss an eine Vakuumpumpe an, um einen gleichmäßigen Durchfluss zu gewährleisten und ein Abfließen des Deckglases zu vermeiden. Starten Sie die schwerkraftgetriebene Perfusion mit physiologischem Calciumpuffer unter Verwendung eines halbautomatischen Perfusionssystems.
Definieren Sie dann die Imaging-Einstellungen mit der entsprechenden Software. Wählen Sie die Anregungswellenlängen 340 Nanometer und 380 Nanometer für die Fura-2-Bildgebung und 480 Nanometer für die Anregung von G-geNOp. Wählen Sie anschließend den Bildgebungsbereich aus, indem Sie den xyz-Tisch des Mikroskops bewegen, bis mehrere Fluoreszenzzellen scharf sind.
Definieren Sie dann die Interessenbereiche. Zeichnen Sie für jedes Bildgebungsfeld die Regionen, die mehrere ganze einzelne Fluoreszenzzellen umfassen. Definieren Sie anschließend einen Hintergrundbereich ähnlicher Größe.
Beginnen Sie mit der Datenerfassung an einem inversen und fortschrittlichen Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Probentisch und einer monochromatischen Lichtquelle. Alternativ können die Zellen bei 340 Nanometern für Fura-2AM bzw. 480 Nanometern für G-geNOp angeregt werden. Stellen Sie die jeweiligen Belichtungszeiten so ein, dass ein klares Fluoreszenzsignal über die Zeit für alle Kanäle nachweisbar ist.
Erfassen Sie das emittierte Licht bei 510 Nanometern für Fura-2AM und 520 Nanometern für G-geNOp mit einer CCD-Kamera mit einem entsprechenden Filtersatz, der aus dem 500-Nanometer-Erreger, einem dichroitischen 495-Nanometer-Emitter und einem 510-520-Nanometer-Emitter besteht. Nehmen Sie dann alle drei Sekunden einen Gesamtframe auf. Zeichnen Sie die ersten drei Minuten in physiologischem Kalziumpuffer auf, um die Ausgangswerte der jeweiligen Fluoreszenzsignale zu erhalten.
Sobald eine stabile Ausgangsfluoreszenz beobachtet wird, wechseln Sie zu 100-Mikromol-Histamin oder ATP, das physiologischen Kalziumpuffer enthält, um die Zellen drei Minuten lang zu stimulieren. Schalten Sie anschließend für fünf Minuten wieder auf den physiologischen Kalziumpuffer ohne Histamin oder ATP und L-NNA um, um die Verbindungen aus den Zellen zu entfernen. Anschließend wird 10-mikromolares NOC-7 im physiologischen Calciumpuffer für zwei Minuten mit Hilfe des Perfusionssystems verabreicht.
Der Stickstoffmonoxid-Donor beeinflusst die G-geNOp-Fluoreszenz stark und verringert die Zellen in der Regel um mehr als 20% als Reaktion auf 10-mikromolares NOC-7. In EA.hy926-Zellen ist der NOC-7-Effekt im Vergleich zur Agonisten-induzierten G-geNOp-Fluoreszenz-Quench stärker. Waschen Sie danach die Stickstoffmonoxid-freisetzende Verbindung etwa 10 Minuten lang mit dem physiologischen Calciumpuffer aus und stoppen Sie die Aufzeichnung, sobald die basale Fluoreszenz wiederhergestellt ist.
Hier sind die repräsentativen Weitfeld-Fluoreszenzbilder von EA.hy926-Zellen zu sehen, die G-geNOp exprimieren und mit Fura-2AM beladen sind. Und hier ist der repräsentative Zeitverlauf der gleichzeitigen Aufzeichnung von Fura-2- und G-geNOp-Signalen als Reaktion auf 100-mikromolares Histamin. Wie angegeben, wurde das Histamin nach drei Minuten mit Hilfe eines Perfusionssystems entfernt.
Diese Kurven stellen die gleichzeitige Aufzeichnung von zytosolischen Calcium- und Stickstoffmonoxidsignalen einer einzelnen Fura-2AM-beladenen Endothelzelle dar, die vorübergehend G-geNOp exprimiert. Die Zellen wurden drei Minuten lang mit 100-mikromolarem Histamin in einem kalziumhaltigen Puffer stimuliert. Und hier sind die repräsentativ gleichzeitig aufgezeichneten Calcium- und Stickstoffmonoxid-Signale über die Zeit einer EA.hy926-Zelle, die vor der Messung mit 500-mikromolarem L-NNA vorbehandelt wurde.
Die Zellen wurden mit 100-mikromolarem Histamin in Gegenwart von zwei Millimolaren Kalzium behandelt. Diese Abbildung zeigt die durchschnittlichen Kurven, die zytosolische Stickstoffmonoxidsignale als Reaktion auf ein mikromolares ATP darstellen, gefolgt von einer zweiten Zellstimulation mit 100-mikromolarem ATP. Einmal gemeistert, ermöglicht Ihnen diese Technik, Stickstoffmonoxid-Signale mit minimalem Aufwand in Echtzeit zu visualisieren.
Ich glaube, dass diese Technik den Weg für Forscher ebnen wird, Stickstoffmonoxid-Signale in verschiedenen Zellmodellen zu erforschen und neu zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die geNOps-Technologie für die Echtzeit-Bildgebung von Stickstoffmonoxid in Ihrem Modellsystem verwenden können.
Überblick
Dieses Manuskript präsentiert Protokolle für die Verwendung genetisch kodierter Stickoxid (NO•) Sonden (geNOps) zur Echtzeitüberwachung von NO•-Fluktuationen in Einzelzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die Studie visualisiert Ca2+-ausgelöste NO•-Bildung in einzelnen Endothelzellen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Stickoxid spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen.
- Die Echtzeitvisualisierung von NO• auf zellulärer Ebene war ein langjähriges Ziel.
- Genetisch kodierte Sonden bieten einen neuartigen Ansatz zur Überwachung der NO•-Dynamik.
- Hohe räumliche und zeitliche Auflösung ist mit herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie erreichbar.
Zweck der Studie
- Protokolle für die Echtzeit-Bildgebung von Stickoxidsignalen in Einzelzellen zu entwickeln.
- GeNOps zur Überwachung der NO•-Bildung, Diffusion und Degradation zu nutzen.
- Das Verständnis der Rolle von Stickoxid in der zellulären Signalübertragung zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Präparation der Endothelzelllinie oder HEK293-Zellen mit Eisen(II)-Booster-Lösung.
- Verwendung von Fura-2AM für Calcium-Bildgebung zusammen mit geNOps.
- Fluoreszenzmikroskopie zur Erfassung von Echtzeitdaten zu NO• und Calcium-Signalen.
- Stimulation von Zellen mit Histamin oder ATP zur Beobachtung der NO•-Antwort.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Stickoxidsignalen in Echtzeit.
- Nachgewiesene Effekte von Histamin und ATP auf die NO•-Produktion.
- Eine Baseline für Fluoreszenzsignale vor und nach Stimulation etabliert.
- Zeigen die Ansprechbarkeit von geNOps auf Stickoxid-Donoren.
Schlussfolgerungen
- Die geNOps-Technologie ermöglicht eine effektive Echtzeit-Bildgebung von Stickoxid.
- Diese Methode kann weitere Forschung zur Stickoxid-Signalübertragung in verschiedenen Zellmodellen erleichtern.
- Zukünftige Studien können die Auswirkungen von NO• in unterschiedlichen physiologischen Kontexten untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Real-time, single-cell imaging of nitric oxide (NO•) dynamics addresses a critical gap in understanding rapid signaling events relevant to disease biology and drug discovery. The geNOps platform enables high-resolution quantification of NO• generation and degradation, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This capability enhances predictive confidence for portfolio triage and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of NO• signaling kinetics in live cells for functional target interrogation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying stimulus-dependent NO• responses at the single-cell level.
- Facilitates pathway clarification by correlating NO• fluctuations with upstream triggers such as Ca2+ influx.
- Improves predictive confidence for advancing NO•-modulating targets.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, genetically encoded probe system for reproducible NO• detection in diverse cell models.
- Enables quantitative, real-time readouts suitable for assay standardization and downstream screening workflows.
- Supports dual-parameter imaging (e.g., NO• and Ca2+) for multiplexed assay development.
- Facilitates reliable evaluation of NO• donor compounds and pathway modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling NO• monitoring in physiologically relevant cell types.
- Supports translational biomarker development by linking NO• dynamics to functional cellular outcomes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation for NO•-related mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative NO• signaling data.
Pipeline & Workflow Integration
The geNOps technology integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway mapping by enabling real-time NO• signal quantification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Provides high-resolution temporal and spatial data for comparative analysis of NO• responses.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling NO• monitoring in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, genetically encoded platform adaptable across cell types and experimental setups.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in NO•-related pathways.
- Operational Value: Standardizes NO• detection with scalable, reproducible protocols for diverse R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust functional readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of NO•-modulating targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to advanced imaging systems with appropriate filter sets and software.
- Demands cross-team standardization of probe loading and imaging protocols.
- Adaptation may be necessary for different cell types or experimental conditions.
- Probe responsiveness depends on iron loading and cell-specific factors.
