In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin zu untersuchen, wie Veränderungen der Genexpression – entweder innerhalb sich entwickelnder Zellen oder in deren umgebendem Milieu – zeitliche Prozesse während der Entwicklung beeinflussen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu beantworten, beispielsweise ob die zeitliche Steuerung der Zellspezifikation durch Gene gesteuert wird, die zellautonom innerhalb einer Zelle exprimiert werden, oder zellnicht-autonom in benachbarten Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, einzelne Vorläuferzellen in einem lebenden Wirbeltier zu verfolgen, während sich diese in genetisch unterschiedlichen Umgebungen entwickeln.

Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Stefanie Dudczig, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Nach der Vorbereitung von Zebrafischembryonen sowie von Mikroinjektionsnadeln mit Morpholinos oder mRNA gemäß dem Textprotokoll tauchen Sie die Nadelspitze in einen Tropfen Mineralöl in einer Schale. Messen Sie das Injektionsvolumen, indem Sie das Fußpedal betätigen, und stellen Sie den Gasdruck und/oder die Dauer so ein, bis das Injektionsvolumen einem Nanoliter entspricht, gemessen mit einem Objektmikrometer oder alternativ mit dem Okularmikrometer.

Legen Sie einen Objektträger in eine Petrischale und geben Sie mit einer Transferpipette Einzelzell-Embryonen entlang der Kante des Objektträgers ab. Entfernen Sie anschließend mit einer feinen Transferpipette so viel Flüssigkeit wie möglich, um Bewegungen während der Injektionen zu verhindern. Richten Sie dann die Embryonen mit einer Microloader-Pipettenspitze, bei der die Hälfte der dünnen Spitze abgeschnitten wurde, in einer einzigen Spalte aus.

Danach senken Sie die Nadel in Richtung eines Embryos im Einzelzellstadium und durchdringen in einer fließenden Bewegung die Chorion- und Dotterhülle. Sobald sich die Nadelspitze mittig im Dotter befindet, betätigen Sie einmal das Fußpedal und injizieren mittels Mikroinjektion ein Nanoliter H2AGFP- oder H2BRFP-mRNA in den Dotter des Embryos im Einzelzellstadium. Entfernen Sie die Injektionsnadel, bewegen Sie die Schale mit den Embryonen, um den nächsten Embryo in Position zu bringen, und setzen Sie die Injektionen fort, bis die gesamte Reihe der Embryonen injiziert ist.

Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, kippen Sie die Schale um 30 bis 45 Grad und verwenden Sie einen sanften Strom von E3-Medium aus einer Druckflasche, um die injizierten Embryonen in eine neue, saubere Petrischale zu überführen. Drei Stunden nach der Befruchtung überprüfen Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 2- bis 5-facher Vergrößerung mithilfe eines RFP-Filters die Donorembryonen auf Markierungssignal. Wählen Sie gut entwickelte Embryonen mit starkem Fluoreszenzsignal aus.

Nachdem die Injektionsplatten und Petrischalen gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, schneiden Sie die Spitze einer langen, fein gezogenen Glas-Pasteurpipette mit einem Diamantmesser so ab, dass die Länge eine bequeme Handhabung ermöglicht, indem Sie die Nadel unter Drehung ritzen, bis die Spitze abfällt. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt gerade ist. Um entchorionierte Embryonen anschließend nicht zu beschädigen, polieren Sie die Übertragungspipette aus Glas, indem Sie die Schnittfläche in einer Bunsenbrennerflamme drehen, um glatte Enden zu erzeugen.

Um Embryonen von der Chorion zu befreien, geben Sie gut entwickelte Wirt- und Spenderembryonen in zwei separate 10-Milliliter-Erlenmeyerkolben aus Glas und entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich. Geben Sie 5 Milliliter der zuvor hergestellten Protease-Lösung mit einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter zu jedem Kolben hinzu und schwenken Sie die Embryonen vorsichtig, während Sie sie unter einem Stereomikroskop beobachten. Während des weiteren Schwenkens spülen Sie, sobald das erste Embryo die Chorion verlassen hat, dreimal schnell mit E3-Medium, um die Protease-Lösung zu entfernen, indem Sie den größten Teil der Flüssigkeit abgießen und den Kolben anschließend vorsichtig entlang der Wand mit E3 auffüllen.

Beenden Sie die enzymatische Dechorionierung durch schnelles, aber schonendes Spülen, sobald die ersten wenigen dechorionierten Embryonen zu erkennen sind. Wählen Sie für die Transplantationen ausschließlich dechorionierte Embryonen mit einer symmetrischen Zellmasse und ohne offensichtliche Deformationen oder Schäden am Dottersack. Um Blastulatransplantationen durchzuführen, montieren Sie die Nadel in der Nadelhalterung und verbinden Sie sie mit der Schlauchleitung der Transplantationsvorrichtung.

Überprüfen Sie die Dichtheit, indem Sie die Spritze manuell betätigen, um Flüssigkeit in die Nadel hinein- und wieder herauszusaugen. Übertragen Sie anschließend mit einer Glaspipette die Donorembryonen in die erste Spalte der Agaroseform. Danach bringen Sie die Wirtsembryonen in die Spalten zwei bis sechs der Agaroseform.

Legen Sie die Transplantationsnadel vorsichtig auf die Blastomerenzellen eines Spenderembryos und saugen Sie langsam etwa 20 bis 50 Zellen in die Transplantationsnadel auf. Achten Sie darauf, das Eiweiß nicht aufzusaugen. Heben Sie die Transplantationsnadel mit Hilfe des Mikromanipulators vom Spenderembryo ab.

Bewegen Sie die Injektionsschale nach links und führen Sie die Transplantationsnadel von der Seite in die Zellmasse hinein, bis zur Animalregion des ersten Wirtsembryos. Deponieren Sie fünf bis 10 Zellen nahe der Oberfläche, entsprechend einer Fate-Mapping-Analyse, die zeigt, dass dieser Bereich das Vorderhirn-Augenfeld bildet. Um die Embryonen zur Bildgebung vorzubereiten, saugen Sie maximal fünf Embryonen in eine Plastik-Transferpipette und lassen Sie die Embryonen durch Schwerkraft an der Spitze ansammeln.

Berühren Sie die Transferpipette mit der Oberfläche eines zuvor vorbereiteten Plastikröhrchens, das 1 % Niedrigschmelz-Agarose enthält, und lassen Sie die Embryonen in das Röhrchen absinken, wobei die Menge der übertragenen E3-Lösung begrenzt wird. Übertragen Sie anschließend die fünf Embryonen aus dem Agarose-Plastikröhrchen in eine Petrischale mit 0,5 bis einem Milliliter Agarose, und entfernen Sie mit derselben Transferpipette überschüssige Agarose, sodass nur noch ein kleiner Tropfen verbleibt. Richten Sie die Embryonen seitlich mit einer Mikroladepipette, deren Spitze abgebrochen wurde, aus, bis die Agarose erstarrt ist.

Danach weiterhin jeweils bis zu fünf Embryonen in einzelnen Agarose-Tropfen einbetten. Wenn mit einem aufrechten Mikroskop abgebildet wird, Embryonen außerhalb eines Bereichs von einem Zentimeter vom Umfang der Petrischale entfernt platzieren. Weitere 1 %ige Low-Melt-Agarose verwenden, um die Agarose-Tropfen an der Seite der Schale miteinander zu verbinden, um ein Lösen und seitliches Verschieben während der Bildaufnahme zu verhindern.

Wählen Sie Embryonen mit dem korrekten Montagewinkel und einem kräftigen Herzschlag sowie einigen transplantierten Donorzellen, die sich hauptsächlich im vorderen ventralen Quadranten der sich entwickelnden Netzhaut befinden, wo die Welle der Genexpression beginnt. Führen Sie die Bildgebung gemäß dem Textprotokoll durch. Wie in dieser Abbildung gezeigt, führt die Mikroinjektion von einem Nanoliter mRNA in das Eiweiß von Embryonen im Einzelzellstadium innerhalb von drei Stunden nach der Befruchtung zur Expression des fluoreszierenden Reportereiweißes, wobei zu diesem Zeitpunkt die hellsten Donoren ausgewählt werden.

24 Stunden nach der Befruchtung wurden Embryonen mit transplantierten Donorzellen an den relevanten Netzhautstellen 16 bis 24 Stunden lang einer Zeitrafferaufnahme unterzogen. Dieses konfokale Bild eines einzelnen optischen Z-Schnitts zeigt eine Überlagerung des Hellfelds im roten Kanal am sich entwickelnden Auge, wobei sich einige markierte Donorzellen in Rot innerhalb einer ansonsten nicht markierten Wirtsumgebung befinden. Diese Mikroaufnahmen stammen aus Zeitrafferaufnahmen sich entwickelnder Wildtyp-Donorzellen aus atoh7:gapGFP-transgenen Embryonen, die in einen nicht markierten Wildtyp-Wirt transplantiert wurden.

Der Beginn der transgenen Expression wird für einige Zellen angezeigt, wie hier zu sehen ist. Nachdem die Technik beherrscht ist, können die Mikroinjektionen innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, und die Embryoselektion, -vorbereitung sowie -transplantation können am selben Tag innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden. Im Anschluss an diese Verfahren oder parallel dazu können wir Embryonen zudem zu bestimmten Zeitpunkten fixieren, um eine postmortale Analyse durchzuführen.

Beispielsweise können wir quantifizieren, welcher Anteil der Spenderzellen ein bestimmtes Gen oder Protein exprimiert, eine spezifische Morphologie aufweist oder an einen bestimmten Ort migriert ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zebrafischembryonen genetisch verändert und Chimeren zwischen genetisch unterschiedlichen Spender- und Wirtsembryonen erzeugt. Außerdem sollten Sie in der Lage sein, die Embryonen für die in-vivo-Zeitraffmikroskopie vorzubereiten, um Fragen zu beantworten, die mit fixiertem Gewebe nicht zu klären sind.