Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Durchblutung von Blutzellen in der Mausretina mithilfe eines Scanning-Laser-Ophthalmoskops sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu retinalen Erkrankungen zu beantworten, beispielsweise wie die Dynamik von Leukozyten und Erythrozyten im retinalen Bereich ist und inwiefern ihre Flussdynamik zur Krankheitspathogenese beiträgt. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie Aufschluss über unterschiedliche Krankheitsphänotypen gibt und zudem sehr einfach durchzuführen ist.

Dieses Verfahren wird von unseren Teammitgliedern Praveen, Bo Bo und Neha demonstriert. Um die Schicht der Mausblutzellen zu isolieren, frisch gesammeltes Vollblut auf eine 1:1-Lösung aus Polysucrose und Natriumdiatrizoat in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen auftragen. Anschließend das Röhrchen 30 Minuten lang zentrifugieren.

Als Nächstes das plasmatische Überstand abspitzen und verwerfen. Danach sorgfältig die Buffy-Coat-Schicht, bestehend aus Leukozyten, sowie die darunterliegende Schicht aus Erythrozyten in separaten Röhrchen sammeln. Anschließend die Erythrozyten mit 1×PBS waschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und in einem Volumen PBS resuspendieren.

Überführen Sie anschließend Aliquote von je einem halben Milliliter der Suspension in Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Aliquote, entfernen Sie den Überstand und geben Sie etwa 200 Mikroliter 40 % 1x PBS zu den pellettierten Erythrozyten hinzu. Mischen Sie gründlich.

Und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach fünf Minuten geben Sie 100 Mikroliter ICG zu jeder Suspension hinzu. Mischen Sie die Röhrchen durch mehrmaliges Umstülpen und inkubieren Sie sie anschließend bei Raumtemperatur für fünf Minuten.

Fügen Sie anschließend 300 Mikroliter 1×PBS hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang unter leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann die Suspensionen, bewahren Sie die pelletierten Zellen auf und resuspendieren Sie sie in einem Milliliter 1×PBS. Waschen Sie die Zellen weiterhin mit 1×PBS, bis der Überstand klar ist.

Nach dem Abgießen des Überstandes ein Volumen 1 % BSA in PBS hinzufügen, um einen Hämatokrit von 50 % für mit ICG markierte Erythrozyten zu erreichen. Danach die Gewinnung des Buffy Coats fortsetzen. Zunächst die Zellen einmal mit 10 Milliliter 1×PBS waschen, um Verunreinigungen zu entfernen.

Zentrifugieren Sie die Proben erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 900 µL 1x PBS. Geben Sie anschließend 100 µL 10 % Natriumfluorescein hinzu und inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die markierten Lymphozyten abschließend dreimal mit je 10 mL 1x PBS.

Zentrifugieren und in 100 µL 1x PBS resuspendieren. Um die mit ICG markierten Erythrozyten für die Injektion vorzubereiten, zunächst ein Aliquot für die Injektion auf einen Hämatokrit von 5 % oder 1 % verdünnen. Die Maus anästhesieren und ihre Pupillen weiten.

Dann Augensalbe auf beide Augen auftragen und eine Kontaktlinse über einem der Augen platzieren. Nun die Maus mithilfe einer konfokalen SLO-Kamera mit einer positiven 25-Dioptrien-Linse abbilden, um die Refraktion des Auges auszugleichen.

Frisch perfekt richten Sie die Hornhaut auf den optischen Kopf des SLO-Geräts aus. Schalten Sie anschließend das Abbildungsmodul ein und bewegen Sie es, bis der Sehnerv im Zentrum des Bildschirms sichtbar ist. Nehmen Sie dann bei einem Winkel von 30 Grad die Infrarot-Fundusaufnahmen vor.

Nehmen Sie anschließend ein Infrarot-Fundus-Video auf. Schalten Sie den 790-Nanometer-ICG-Filter ein, stellen Sie den Kameramodus auf hohe Geschwindigkeitsaddition ein und belassen Sie den Sichtwinkel bei 15 bis 30 Grad. Stellen Sie danach die ICG-Intensität für alle Messungen auf 85 ein.

Klicken Sie auf dem Bedienfeld auf die Schaltfläche „Erfassen“, um ein Baseline-Video mit 8,8 bis 15 Bildern pro Sekunde für eine Minute aufzunehmen. Danach 100 µL ICG-markierte Erythrozyten in eine Insulinspritze mit einer 30-Gauge-Nadel laden und die Zellen in die Schwanzvene oder retroorbital injizieren. Unmittelbar nach der Injektion ein neues infrarotes Fundusbild und ein neues ICG-Filter-Video aufnehmen.

Nachdem die Videos aufgenommen wurden, exportieren Sie diese im TIFF-Format zur Bildanalyse. Verarbeiten Sie die Bilder mit dem frei verfügbaren Bildverarbeitungssoftwarepaket MHJ. Nach dem Öffnen der Datei stellen Sie das Bildintervall des Videobilds für Geschwindigkeitsmessungen ein.

Öffnen Sie dann das MtrackJ-Plugin. Wählen Sie im Menü die Option „Tracking“ und aktivieren Sie die Option, nach dem Hinzufügen eines Punkts zum nächsten Zeitrahmenindex zu wechseln. Suchen Sie nun eine Zelle von Interesse und verfolgen Sie diese durch jeden Frame.

Wählen Sie im Menü „add“ aus, um eine neue Spur hinzuzufügen, und klicken Sie anschließend auf die gewählte Zelle. Klicken Sie dann fortlaufend auf die aktuelle Position der Zelle, während die Bilder von Frame zu Frame fortschreiten. Sobald die Verfolgung abgeschlossen ist, ändern Sie die Anzeigeoption für die Trajektorie aus den verfügbaren Auswahlmöglichkeiten und wählen Sie aus, nur die Spurpunkte zum aktuellen Zeitpunkt anzuzeigen.

Klicken Sie weiter, bis die Bahn der Zelle angezeigt wird, und speichern Sie dann die Spur. Fahren Sie nun mit der Verfolgung der nächsten Zelle fort, beginnend mit dem Hinzufügen-Befehl und genauso wie bei der ersten Zelle vorgehend. Nachdem alle Zellen von Interesse verfolgt wurden, öffnen Sie die Anzeige aller Spurmessungen mithilfe der Messoption.

Speichern Sie dann die Ausgabe zur weiteren Analyse. Erythrozyten, die mit 1,5 % ICG markiert waren, wurden in der Netzhautdurchblutung von C57 black 6J-Mäusen mit einem Hämatokrit von 1 % oder 5 % visualisiert; die Zellen waren unterscheidbar, bei einem Hämatokrit von 1 % waren die markierten Zellen jedoch leichter zu erkennen. Bei beiden injizierten Konzentrationen war ein gewisser Erythrozytenstau im parapapillären Bereich beobachtbar, der bei einem Hämatokrit von 5 % deutlicher sichtbar war.

Leukozyten wurden mit 1% Natriumfluorescein markiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie als grün markierte Zellen visualisiert. Es wurde eine gewisse Agglomeration beobachtet. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von sechs Stunden durchgeführt werden.

Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Pupillen zu weiten, um qualitativ hochwertige Netzhautbilder und -videos zu erhalten.