Name: Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Lernen Sie die ATP-abhängige Reinigung von G4 Resolvase1 aus bakteriellen Systemen. Diese Methode isoliert nahezu reines, katalytisch aktives Enzym für biochemische in-vitro-Assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir möchten unsere Finanzierungsquellen zu danken, darunter ein großzügiges Geschenk von der Ware Foundation (auf JPV) Die National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (zu PJS), und der Ball State University Startfonds (zu PJS). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
<li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li>
<li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li>
<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26883636">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
<li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li>
<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
<li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
<li>BD Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf">http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf</a> (2016).</li>
<li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li>
<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll stellt eine hocheffiziente Expression, Reinigung und Quantifizierung Schema für die Isolierung des DHX36 Genprodukts, G4-Resolvase1 (G4R1, auch Rhau und DHX36 genannt) (Abbildung 1). Dieses Protokoll verwendet zwei Reinigungsschritte: His-Tag Affinitätsreinigung an Kobalt Affinitätsbeads und enzymatische Reinigung auf G4-DNA-konjugierten Perlen. Der letzte Schritt ist einzigartig, da es die Vorteile der engen Affinität nimmt, hohe Spezifität und katalytische Aktivität, die Abwickeln rG4...

G4 Strukturen sind hochstabile Nukleinsäuresekundärstrukturen, die innerhalb Guanin-reichen Regionen von DNA und RNA bilden. G4 Strukturen werden über Hoogsteen-Bindungswechselwirkungen stabilisiert und koordinative Bindung innerhalb des zentralen Hohlraums mit einwertigen Kationen (d. K + und Na +), die zu der bemerkenswerten thermischen Stabilität von G4 Strukturen 1, 2 wesentlich beitragen. Frühe Bioinformatik Studien vorgeschlagen , dass das menschliche Genom enthält&gt; 375.000 &quot;potential G4 bildenden Motive&quot; 3, 4. Neuere Studie Schätzungen deuten darauf hin , dass die Anzahl der G4 - Motive höher ist um einen Faktor von 2-5 5, während eine andere Studie 716.310 unterschiedliche Potential G4 bildenden prognostiziert 6 Sequenzen im menschlichen Genom. G4-bildende Sequenzen sind evolutionär konserviert und nicht willkürlich verteilt indas Genom. G4 - Motive sind in Gen kodierenden Regionen angereichert und nach oben von 40% der Gen - Promotoren enthalten G4 Motive 7. Interessanterweise hat der Grad der Anreicherung von G4-Motive in einem Gen demonstriert worden, um die Funktion des Gens zu suggerieren. Zum Beispiel haben proto-Onkogenen und Gene in Entwicklung beteiligt signifikant größere Anreicherung von G4 Strukturen als Tumorsuppressorgene 8, 9. Mit hoher thermischer Stabilität, eine fast allgegenwärtige Präsenz im gesamten Genom, und das Potenzial, deutlich größeren zellulären Prozesse beeinflussen, ist es wenig überraschend zu finden, dass die Zelle Enzyme zu verwalten, diese Strukturen entwickelt hat. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase1 (G4R1; auch Rhau und DHX36 genannt), die wir als die Quelle der meisten tetra G4-DNA Auflösungs Aktivität charakterisiert in menschlichen (HeLa) Zellen 10. Seitdem hat es sich gezeigt, That G4R1 fest bindet und abwickelt katalytisch tetra und unimolekularer G4-DNA und G4-RNA mit den engsten berichteten KDs für einen G4-bindendes Protein 11, 12, 13. Zusätzlich hat die G4-Auflösungs Aktivität von G4R1 wurde in einer Vielzahl von biochemischen und zellulären Prozessen beteiligt, einschließlich telomere / Telomerase biology 11, 14, 15, 16, Transkription und Splicing 17, 18, 19, 20, Entwicklung 21, Hämatopoese 21, und der Immunregulation 22, 23. Mit einem Übergewicht der G4-Sequenzen spezifisch im gesamten Genom und die diverse zelluläre p gelegenrozesse dass G4R1 die Fähigkeit hat zu verwickelt beteiligt mit kurzem wurde, zu exprimieren und zu reinigen, effizient hochaktiven rG4R1 von äußerster Wichtigkeit ist, die biochemischen Mechanismen, und das Verhalten dieses Proteins für die Aufklärung. Hier zeigen wir eine neuartige Expression und Reinigungsschema (Figur 1) , die die Vorteile der ATP-abhängige, G4-Auflösungs Aktivität von rG4R1 effizient isolieren aktiven Enzyms führt. Dieses Schema könnte angepasst werden, um andere ATP-abhängigen, für die Nukleinsäure-Enzyme zu reinigen das Produkt der enzymatischen Reaktion ist nicht länger ein Substrat für die Bindung, wie es der Fall für G4R1.

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS kompetente Zellen</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Terrific Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 & Mikro; g/mL in Bakterienplatten/Großkulturen</td></tr><tr><td>Carbenicillin (auf Pflanzenzellkultur getestet)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &micro; g/ml in Bakterienplatten/Großkulturen</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta; -D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym (aus Hühnereiweiß)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1963-B</td><td>oder aus Standardquelle</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1966</td><td>oder aus Standardquelle</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCl, pH 8,8</td><td></td><td></td><td>Zum Gießen von auflösendem Gel (für Proteinquantifizierungsgel); Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6,8</td><td></td><td></td><td>Zum Gießen von Stapelgel (für Proteinquantifizierungsgel); Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetat, pH 7,8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1981</td><td>oder aus Standardquelle</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (1&nbsp; M Lösung)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1665</td><td>oder aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin-Hemisulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Paramagnetische Kügelchen</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8&nbsp;</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>0718</td><td>oder aus einer Standardquelle</td></tr><tr><td>0,2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td></td><td>Aus der Standardquelle; stellen Sie den pH-Wert zunächst mit NaOH ein und stellen Sie ihn dann wieder mit HCl nach unten. &nbsp;</td></tr><tr><td>A-Lactalbumin (Typ 1 aus Rindermilch)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Kobaltmetall-Affinitätsperlen</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure, Eiszeit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5'-Triphosphat (aus bakterieller Quelle)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40 % Acrylamid/Bis-Lösung (37,5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>zur Herstellung von Proteingel-Laufpuffer (192 mM Glycin, 25 mM Tris Base, 0,1 % SDS)</td></tr><tr><td>10 % Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1667</td><td>zur Herstellung von Proteingel-Laufpuffer (192 mM Glycin, 25 mM Tris Base, 0,1 % SDS); oder aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>oder aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>Trisbase</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>zur Herstellung von Proteingel-Laufpuffer (192 mM Glycin, 25 mM Tris Base, 0,1 % SDS); Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range Protein MW Marker</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Z33-Oligo ("Z33-Bio")</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-Biotin 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 Oligo ("Z33-TAM")</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>Fluorbeschichtete DC-Platte</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30 % in H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Multiband-UV-Lampe</td><td></td><td></td><td>Kann UV-Licht bei 365 nm</td></tr> <tr><td>emittierenTischzentrifuge (mit schwingendem Schaufelrotor)</td><td></td><td></td><td>Kann auf 4 &/� gekühlt werden; C</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td>Kann auf 4 & Grad gekühlt werden; C</td></tr><tr><td>Digitaler Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>oder gleichwertig in der Lage, Ultraschallimpulse abzugeben (30 % Amplitude, 2 s EIN/2 s AUS)</td></tr><tr><td>50 &deg; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td>Zur Bildung von Z33 zu Quadruplex</td></tr><tr><td>37 &deg; C-Inkubator für Bakterien</td><td></td><td></td><td>Für die bakterielle Transformation und das anfängliche Wachstum über Nacht von großen Kulturen von Rosetta2 E. coli transformiert mit TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &deg; C/14&nbsp; &deg; C-Schüttel-Inkubator für Bakterien</td><td></td><td></td><td>Für das Wachstum und die Proteininduktion großer Kulturen von Rosetta2 E. coli transformiert mit TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td></td><td></td><td>, das OD600 ablesen kann; kann Oligomerkonzentrationen basierend auf der Basensequenz ablesen (z. B. Biorad SmartSpec 3000)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Aus</td></tr><tr><td>Standardquelle PCR-Streifenröhrchen</td><td></td><td></td><td>Aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>15 und 50 mL Zentrifugenröhrchen (Polypropylen)</td><td></td><td></td><td>Aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (2,0 mL)</td><td></td><td></td><td>Aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>500 mL Zentrifugenflaschen (Polypropylen)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Array an Pipettenspitzen und serologischen Pipetten</td><td></td><td></td><td>Aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>Gelladespitzen</td><td></td><td></td><td>Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>Automatische Repeating-Pipette</td><td></td><td></td><td>Für die schnelle Aliquotierung von rG4R1; Aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td>Aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td></td><td></td><td>Aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>Trockeneis</td><td></td><td></td><td>Aus der Standardquelle</td></tr><tr><td>Laemlli Probenpuffer</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Vorrichtung zum Laufen großer Plattengele</td><td>Biorad</td><td></td><td>Wir haben das Protean II xi Zellgerät von Biorad</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>verwendet. Wir verwenden einen Magneten von One Lambda (jetzt eine Marke von Thermo Fisher Scientific); und Life ist auch eine Tochtergesellschaft von Thermo, und daher sollte der hier aufgeführte Magnet ein geeigneter Ersatz sein</td></tr><tr><td>. Rasierklingen</td><td></td><td></td><td>Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>Filterpapier und Trichter</td><td></td><td></td><td>Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>Auflaufform</td><td></td><td></td> aus Glas <td>Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td></td><td></td><td>Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>Aus Standardquelle</td></tr><tr><td>Klarsichthüllen</td><td></td><td></td><td>Schutzhüllen aus Standardquelle</td></tr><tr><td>Scanner und zugehörige TWAIN-Software</td><td></td><td></td><td>Von der Standardquelle</td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td></td><td></td><td>wie Fuji Multiguage oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>oder gleichwertig</td></tr></tbody></table>

ein g-quadruplex-dna-affinität ansatz zur reinigung von enzymatisch aktiven g4 resolvase1

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Höherwertige Nukleinsäurestrukturen G-Quadruplexe (G4S, G4 Strukturen) in guaninreichen Regionen sowohl DNA als auch RNA und sind thermisch hochstabile Form genannt. Es gibt&gt; 375.000 putative G4 bildenden Sequenzen im menschlichen Genom, und sie sind in Promotorregionen, untranslatierten Regionen (UTRs) angereichert, und innerhalb der telomeren Wiederholungs. Aufgrund des Potenzials für diese Strukturen zellulärer Prozesse zu beeinflussen, wie beispielsweise Replikation und Transkription wurde die Zellenzyme entwickelt sie zu verwalten. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase 1 (G4R1), die biochemisch wurde zusammen gekennzeichnet durch unser Labor und Nagamine et al. und zu binden , extrem eng sowohl G4-DNA und RNA-G4 (K d im Nieder pM - Bereich) gefunden. G4R1 ist die Quelle der Mehrzahl der G4-Auflösungsaktivität in Lysaten HeLa-Zelle und hat eine Rolle, da eine Rolle bei telomere Stoffwechsel, Lymphe Entwicklung, Gentranskription, Hämatopoese und Immunüberwachung spielen. Die Fähigkeit, efzient Expression und Aufreinigung katalytisch aktive G4R1 von Bedeutung ist für die Laboratorien an weiteren Einblick in die kinetische Interaktion von G4 Strukturen und G4-Lösung Enzyme zu gewinnen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren zur Reinigung von rekombinantem G4R1 (rG4R1). Das beschriebene Verfahren beinhaltet die herkömmliche affinitätsbasierte Reinigung eines C-terminalen Histidin-markiertes Enzym in menschlichen Codon-optimierten ausgedrückt Bakterien mit der Ausnutzung der Fähigkeit von rG4R1 zu binden und G4-DNA Entspannen hochaktive Enzym in einer ATP- zu reinigen abhängige Elutionsschritt. Das Protokoll enthält außerdem ein Qualitätskontrollschritt, bei dem die enzymatische Aktivität von rG4R1 durch Untersuchung der Fähigkeit des gereinigten Enzyms gemessen wird G4-DNA zu entspannen. Außerdem wird ein Verfahren beschrieben, das für die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 ermöglicht. Alternative Anpassungen dieses Protokolls werden diskutiert.

Dieses Protokoll (Abbildung 1) ergibt routinemäßig fast rein, katalytisch aktive rG4R1. Als Maß der enzymatischen Aktivität wird typischerweise beobachtet , dass 50% von 0,2 pmol von TAMRA-markierten tetra G4-DNA in Monomere innerhalb der 0,2 umgewandelt wird - 0,013 uL Bereich von rG4R1 durch die G4 - Aktivitätstest getestet , wie oben (Abbildung dargelegt 2). Coomassiefärbung von gereinigtem rG4R1 zeigt eine einzelne Bande bei der erwarteten 120 kDa Größe, mit einem k...

G4 Resolvase1 bindet an G-Quadruplex (G4) Strukturen mit dem engsten berichteten Affinität für ein G4-Bindungsprotein und stellt die Mehrheit der G4-DNA Abwickeln Aktivität in HeLa-Zellen. Wir beschreiben ein neuartiges Protokoll, das die Affinität und ATP-abhängige Abwickeln Aktivität von G4-Resolvase1 nutzt gezielt katalytisch aktive rekombinante G4R1 reinigen.

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, das G-Quadruplex-Helikase-Protein G4 Resolvase1 aus einem bakteriellen Expressionssystem mittels eines einzigartigen, ATP-abhängigen Reinigungsschritts zu isolieren, um nahezu reines und katalytisch aktives Enzym zu erhalten. Diese Methode kann Forschern helfen, nahezu reines und katalytisch aktives rekombinantes G4 Resolvase1-Protein für eine Vielzahl in vitro durchgeführter biochemischer Assays zu gewinnen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass fehlgefaltetes oder anderweitig katalytisch inaktives Enzym von der Proteinpräparation ausgeschlossen wird.Die Idee, ATP zur Elution der G-Quadruplex-Helikase zu verwenden, entstand, nachdem es nicht möglich war, das katalytisch aktive Enzym von den G4-Kügelchen zu eluieren, selbst bei außergewöhnlich hohen Salzkonzentrationen. Bereiten Sie große bakterielle Kulturen vor und lassen Sie diese wachsen, die G-Quadruplex-Resolvase1 oder G4R1 exprimieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Tauchen Sie das bakterielle Pellet bei Raumtemperatur in drei Milliliter TN-Puffer auf.Halten Sie die Flaschen in der Hand und schwenken Sie sie, um den Bakterienpellet aufzutauen und erneut in S

a-g-quadruplex-dna-affinity-approach-for-purification-enzymatically

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Kristallstruktur von Protein-DNA-Komplexe können Einblick in Proteinfunktion, Mechanismus, sowie, die Natur der spezifischen Wechselwirkung bereitzustellen. Hier berichten wir, wie die Länge, Sequenz und Enden der DNA-Doppelstrang für Co-Kristallisation zu optimieren...

Iterative Optimierung der DNA-Duplexes für Kristallisation von SeqA-DNA-Komplexen

Wir beschreiben sensitive, gelbasierte diskontinuierliche Assays, um die Kinetik der Verzögerungsstranginitiierung mit den Replikationsproteinen des Bakteriophagen T7 zu untersuchen.

Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine

Methoden zur Generierung von groß angelegten gRNA Bibliotheken sollte einfach, effizient und kostengünstig sein. Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung von gRNA Bibliotheken basierend auf enzymatische Verdauung von Ziel DNA. Diese Methode CORALINA (umfassende gRNA Bibliothek Generation durch kontrollierte Nuklease Aktivität) stellt eine Alternative zu teuren benutzerdefinierte Oligonukleotid-Synthese.

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

Eine magnetische Pinzette Einzelmolekül-Plattform, G-Quadruplexe zu manipulieren wird berichtet was ermöglicht das Studium der G4 Stabilität und Verordnung durch verschiedene Proteine.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines schnellen, 3-stufigen, Aptamer-basierten exponentiellen Amplifikations-Assays zur Detektion von Targets. Probenvorbereitung, Signalverstärkung und Farbentwicklung werden behandelt, um dieses System zu implementieren, um das Vorhandensein von Theophyllin gegenüber dem von Koffein zu erkennen.

Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

Bis-3-Chloropiperidine (B-CePs) sind nützliche chemische Sonden, um G-Quadruplex-Strukturen in DNA-Matrizen in vitro zu identifizieren und zu charakterisieren. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung von Sondierungsreaktionen mit B-CePs und zur Auflösung von Reaktionsprodukten durch hochauflösende Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

Ein wesentliches Hindernis für Technologien wie CRISPR sind die Off-Target-Ereignisse, die lebenswichtige Gene stören können. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) ist eine Technik zur Identifizierung unbeabsichtigter Spaltstellen. Diese Methode bildet die genomweite Aktivität von CRISPR-Cas9 mit hoher Sensitivität und ohne Verzerrung ab.

CIRCLE-Seq zur Abfrage von Off-Target-Gen-Editing

Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Dieses Protokoll stellt einen auf Fluoreszenzmikroskopie basierenden Einzelmolekül-DNA-Replikationsassay dar, der die Echtzeit-Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen DNA-Polymerasen und Hindernissen wie G-Quadruplex-Strukturen ermöglicht.

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Visualisierung der DNA-Polymerase-Dynamik an G-Quadruplexen

Ein Protokoll für die Produktion, Reinigung und Verwendung von enzymverpackten äußeren Membranvesikeln (OMV), das eine verbesserte Enzymstabilität für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen bietet, wird vorgestellt.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

Lernen Sie die ATP-abhängige Reinigung von G4 Resolvase1 aus bakteriellen Systemen. Diese Methode isoliert nahezu reines, katalytisch aktives Enzym für biochemische in-vitro-Assays.

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Weitere Videos entdecken