Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, das G-Quadruplex-Helikase-Protein G4 Resolvase1 aus einem bakteriellen Expressionssystem zu isolieren, wobei ein einzigartiger ATP-abhängiger Aufreinigungsschritt verwendet wird, um ein nahezu reines und katalytisch aktives Enzym zu isolieren. Diese Methode kann Forschern dabei helfen, nahezu reines und katalytisch aktives rekombinantes G4-Resolvase1-Protein für uns in einer Vielzahl von biochemischen In-vitro-Assays zu gewinnen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie fehlgefaltete oder anderweitig katalytisch inaktive Enzyme aus der Proteinzubereitung ausschließt.

Die Idee, ATP zur Eluierung der G-Quadruplex-Helikase zu verwenden, entstand, nachdem es nicht möglich war, das katalytisch aktive Enzym von den G4-Kügelchen zu eluieren, selbst bei außergewöhnlich hohen Salzkonzentrationen. Bereiten Sie große Bakterienkulturen vor und züchten Sie sie, die G-Quadruplex Resolvase1 oder G4R1 exprimieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Tauen Sie das Bakterienpellet in drei Millilitern TN-Puffer bei Raumtemperatur auf.

Halten Sie die Flaschen in der Hand und schwenken Sie, um das Bakterienpellet aufzutauen und wieder zu suspendieren. Nach dem Auftauen und relativ gleichmäßigen Schweben erhöhen Sie das Volumen mit TN-Puffer auf fünf Milliliter. Als nächstes lösen Sie 20 Milligramm Lysozym in 250 Mikrolitern Wasser pro Kultur auf und geben Sie es zu den resuspendierten Bakterien.

Lassen Sie das Lysozym die Bakterien etwa fünf bis 10 Minuten lang verdauen, während Sie die Flaschen in der Hand schwenken. Die Farbe der Suspension beginnt sich im Laufe des Aufschlusses leicht aufzuhellen, und die Suspension ist relativ unviskos. Fügen Sie 250 Mikroliter Proteasehemmer-Cocktail (abgekürzt PIC) hinzu.

Fügen Sie dann ein 10-Mikroliter-Aliquot Leupeptin hinzu und mischen Sie es gründlich. Legen Sie die Suspension auf Eis und fügen Sie 10 Milliliter kalten TN-Puffer und 22 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol oder BME hinzu. Übertragen Sie die Suspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Beschallen Sie die Bakterien auf Eis mit einem digitalen Ultraschallgerät, das auf eine Amplitude von 30 % eingestellt ist. Pulsieren Sie eine Minute lang mit zwei Sekunden an und zwei Sekunden aus. Wiederholen Sie die Beschallung dreimal, wobei die Proben zwischen den Beschallungsschritten mindestens zwei Minuten lang auf Eis abkühlen müssen.

Als nächstes fügen Sie ein gleiches Volumen kaltes vier x Kochsalzlösungs-Natriumcitrat oder SSC plus BME, PIC und Leupepin hinzu und mischen Sie die Suspension. In einer auf vier Grad Celsius vorgekühlten Tischzentrifuge werden die Lysate bei 2.300 mal G für 20 Minuten lysiert. Füllen Sie dann den Überstand in frische, vorgekühlte 50-Milliliter-Röhrchen um.

Nehmen Sie einen Milliliter paramagnetische Streptavidin-Kügelchen oder SPB-Suspension pro Kultur und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie den SPB mit einem Magneten. Waschen Sie dann den SPB zweimal mit zwei X SSC plus fünf Millimolar EDTA PH8.

Als nächstes resuspendieren Sie den gewaschenen SPB in 200 Mikrolitern derselben Lösung. Fügen Sie der SPB-Suspension ein Aliquot von G4-DNA mit drei OD hinzu. Mischen Sie schnell, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.

Legen Sie dann die Röhren auf einen Rotator und drehen Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach dieser Rotationsphase blockieren Sie das G4-gebundene SPB, indem Sie einen Milliliter 0,4 % Lactalbumin hinzufügen, und lassen Sie es bis zur Verwendung auf Eis. Um Histidin-markierte rekombinante G4R1 an Kobaltkügelchen zu binden, geben Sie einen Milliliter Kobaltkügelchenaufschlämmung in jedes 50-Milliliter-Röhrchen, das das geklärte Bakterienlysat enthält.

Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Nach der Inkubation werden die Kobaltkügelchen fünf Minuten lang in einer Tischzentrifuge von vier Grad Celsius bei 110 mal G heruntergeschleudert. Saugen Sie die Flüssigkeit vorsichtig an und lassen Sie ein paar Milliliter Flüssigkeit stehen, um die pelletierten Kobaltkügelchen nicht zu stören.

Waschen Sie dann die Kügelchen mit 10 bis 15 Millilitern kaltem vier X SSC plus BME und pelletieren Sie die Kügelchen wie zuvor. Gießen Sie das nächste geklärte Lysat auf die pelletierten Kobaltkügelchen. Inkubieren Sie weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Rotator und waschen Sie die Kügelchen mit 10 bis 15 Millilitern von vier X SSC plus BME.

Pelletieren Sie die Kügelchen dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 100 mal G. Nach einer zweiten Wäsche saugen Sie die Flüssigkeit ab und lassen Sie etwa zwei Milliliter Kügelchen und Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zurück. Übertragen Sie die proteingebundenen Kobaltkügelchen mit einer Pipettenspitze von einem Milliliter in ein vorgekühltes Zwei-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen in dem zwei Milliliter Röhrchen bei hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren, wobei Sie darauf achten müssen, die proteingebundenen Kobaltkügelchen nicht zu verlieren. Pipettieren Sie 0,5 Milliliter Histidin-Elutionspuffer oder HEB auf die Kügelchen und resuspendieren Sie sie, indem Sie das Röhrchen umdrehen.

Dann inkubieren Sie die Kobaltkügelchen in HEB auf einem Rotator für fünf Minuten in einem kalten Raum. Als nächstes zentrifugieren Sie die Suspension bei 18.000 Mal G in einer vier Grad Celsius heißen Mikrozentrifuge für eine Minute. Entfernen Sie vorsichtig den proteinhaltigen Überstand durch vorsichtiges Pipettieren, wobei Sie eine kleine Menge Flüssigkeit auf den Kobaltkügelchen belassen.

Den Überstand in ein vorgekühltes 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Wiederholen Sie diese Schritte für insgesamt drei HEB-Elutionen. Anschließend einmal mit 0,2 molaren EDTA bei PH 6,0 eluieren.

Die Farbe der Kobaltkügelchen ändert sich von rosa zu weiß, wenn das EDTA das Kobalt chelatisiert. Nachdem diese vierte und letzte Elution in das 15-Milliliter-Röhrchen übertragen wurde, pipettieren Sie den restlichen Elutionspuffer aus den Kobaltkügelchen, indem Sie eine Gelladespitze am Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze verwenden. Durch Eintauchen der Spitze in den Boden des Röhrchens kann das restliche Protein, das Elutionspuffer enthält, aufgefangen werden.

Den vorbereiteten G4 SPB mit einem Magneten an die Seite des Rohres steuern und den Überstand wegwerfen. Geben Sie dann einen Milliliter drei X Res Puffer in den G4 SPB und pipettieren Sie zum Mischen. Pipettieren Sie das G4 SPB, suspendiert in drei X Res-Puffer, in das 15-Milliliter-Röhrchen, das etwa zwei Milliliter Protein enthält, das HEB EDTA enthält.

Inkubieren Sie 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad mit gelegentlichem Rühren, damit sich die Kügelchen nicht absetzen. Nach dem Waschen des proteingebundenen G4 SPB, wie im Textprotokoll beschrieben, wird das G4 SPB mit einem Magneten auf Eis pelletiert und die Kügelchen in 100 Mikrolitern vorgewärmtem Elutionspuffer resuspendiert. Übertragen Sie die Kügelchen sofort in ein vorgewärmtes PCR-Röhrchen und inkubieren Sie sie 30 Sekunden lang bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie sofort 12 Mikroliter Natriumchlorid mit fünf Molaren hinzu und pipettieren Sie 20 bis 30 Mal kräftig auf und ab. Die Kombination aus dem hohen Salzgehalt und dem im Elutionspuffer enthaltenen ATP dient dazu, rekombinantes G4R1 aus den G4-Kügelchen zu eluieren. Pelletieren Sie das G4 SPB sofort mit einem Magneten und übertragen Sie das eluhaltige Protein in ein frisches PCR-Röhrchen auf Eis.

Nach Wiederholung der Elution und des Transfers besteht das Endprodukt aus etwa 200 Mikrolitern Elutionspuffer, der gereinigtes rekombinantes G4R1 enthält. Führen Sie abschließend den enzymatischen Aktivitätsassay der Qualitätskontrolle durch, um zu testen, ob hochaktives rekombinantes G4R1 wie im Textprotokoll beschrieben gereinigt wurde. Der G4-Assay liefert ein Maß für die rekombinante enzymatische Aktivität von G4R1.

Innerhalb des Bereichs von 0,2 bis 0,013 Mikrolitern im Enzym wird typischerweise beobachtet, dass 50% von 0,2 Pikosolen Tetramethylrhodamin-markierter tetramolekularer G4-DNA in Monomere umgewandelt werden. Der Coomassie-Bestand der gereinigten rekombinanten G4R1 deutet auf eine einzelne Bande bei der erwarteten Größe von 120 Kilodalton und eine kleinere kontaminierende Bande bei etwa 75 Kilodalton hin. Diese Bande kann ein verkürztes rekombinantes G4R1 darstellen, das seine Fähigkeit beibehalten hat, G4-DNA-Kügelchen in einer ATP-abhängigen Weise an Elue zu binden.

Die interessierende Bande wird anhand einer Protein-Standardkurve quantifiziert. Dieses Protokoll erhält typischerweise 200 Mikroliter eines 20 bis 100 nanomolar gereinigten Enzyms pro einem Liter Bakterienkultur. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das G4-Resolvase1-Protein aus einem bakteriellen Expressionssystem mit einem einzigartigen ATP-abhängigen Aufreinigungsschritt aufreinigt, um ein nahezu reines und katalytisch aktives Enzym zu isolieren.

Nach der Beherrschung und vorheriger Vorbereitung der gefrorenen Bakterienpellets kann die Aufreinigung von rekombinantem G4R1 in etwa sechs Stunden durchgeführt werden. Um die optimale katalytische Aktivität des Enzyms aufrechtzuerhalten, ist es wichtig, das Präparat auf Eis zu halten, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie immer Proteasehemmer.

Vermeiden Sie Blasenbildung in den Röhren. Frieren Sie gereinigte Enzyme schnell ein und vermeiden Sie unnötige Gefrier-Auftauzyklen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf diesem Gebiet, die Bindungsaffinitäten und Helikase-Aktivitäten dieses Proteins an eine Vielzahl von DNA- und RNA-Substraten genau zu definieren.

Dieses Verfahren kann auch für die Aufreinigung anderer ATP-abhängiger Nukleinsäureenzyme angepasst werden, bei denen das Produkt der enzymatischen Reaktion kein Bindungssubstrat mehr für das Enzym ist.