Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, das G-Quadruplex-Helikase-Protein G4 Resolvase1 aus einem bakteriellen Expressionssystem mittels eines einzigartigen, ATP-abhängigen Reinigungsschritts zu isolieren, um nahezu reines und katalytisch aktives Enzym zu erhalten. Diese Methode kann Forschern helfen, nahezu reines und katalytisch aktives rekombinantes G4 Resolvase1-Protein für eine Vielzahl in vitro durchgeführter biochemischer Assays zu gewinnen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass fehlgefaltetes oder anderweitig katalytisch inaktives Enzym von der Proteinpräparation ausgeschlossen wird.

Die Idee, ATP zur Elution der G-Quadruplex-Helikase zu verwenden, entstand, nachdem es nicht möglich war, das katalytisch aktive Enzym von den G4-Kügelchen zu eluieren, selbst bei außergewöhnlich hohen Salzkonzentrationen. Bereiten Sie große bakterielle Kulturen vor und lassen Sie diese wachsen, die G-Quadruplex-Resolvase1 oder G4R1 exprimieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Tauchen Sie das bakterielle Pellet bei Raumtemperatur in drei Milliliter TN-Puffer auf.

Halten Sie die Flaschen in der Hand und schwenken Sie sie, um den Bakterienpellet aufzutauen und erneut in Suspension zu bringen. Sobald der Pellet aufgetaut ist und relativ gleichmäßig suspendiert vorliegt, wird das Volumen mit TN-Puffer auf fünf Milliliter aufgefüllt. Lösen Sie anschließend 20 Milligramm Lysozym pro Kultur in 250 Mikrolitern Wasser auf und geben Sie diese Lösung zu den resuspendierten Bakterien hinzu.

Lassen Sie das Lysozym die Bakterien etwa fünf bis 10 Minuten lang unter ständigem Schwenken der Flaschen im Handbereich verdauen. Die Farbe der Suspension beginnt sich leicht aufzuhellen, während die Verdauung fortschreitet, und die Suspension wird relativ niedrig viskos sein. Geben Sie 250 Mikroliter Protease-Inhibitoren-Cocktail, abgekürzt PIC, hinzu.

Dann ein 10 µL Aliquot Leupeptin hinzufügen und gründlich mischen. Die Suspension auf Eis stellen und 10 mL kalte TN-Pufferlösung sowie 22 µL Beta-Mercaptoethanol oder BME hinzufügen. Die Suspension in eine 50 mL-Röhrchen überführen.

Sonizieren Sie die Bakterien auf Eis mit einem digitalen Sonifikator, der auf 30 % Amplitude eingestellt ist. Geben Sie Impulse mit zwei Sekunden an und zwei Sekunden aus für eine Minute. Wiederholen Sie die Sonifikation dreimal, wobei die Proben zwischen den Sonifikationsschritten mindestens zwei Minuten lang auf Eis abkühlen müssen.

Fügen Sie anschließend ein gleiches Volumen kalter vierfacher X Salinen-Natriumcitrat-Lösung (SSC) mit BME, PIC und Leupeptin hinzu und mischen Sie die Suspension. Zentrifugieren Sie die Lysate in einer Tischzentrifuge, die auf vier Grad Celsius vorgekühlt wurde, 20 Minuten lang mit 2.300 × g. Danach überführen Sie das Überstand in frische, vorgekühlte 50-Milliliter-Röhrchen.

Nehmen Sie ein Milliliter Streptavidin-paramagnetische Kügelchen oder SPB-Suspension pro Kultur und überführen Sie diese in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die SPB mit einem Magneten. Anschließend waschen Sie die SPB zweimal mit zwei X SSC plus fünf Millimolar EDTA pH 8.

Als Nächstes die gewaschenen SPB in 200 µL derselben Lösung resuspendieren. Einen drei-OD-Aliquot von G4-DNA zur SPB-Suspension hinzufügen. Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren kurz vermischen.

Danach die Röhrchen auf einen Rotator stellen und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur rotieren lassen. Nach dieser Rotationsphase den mit G4 markierten SPB blockieren, indem ein Milliliter 0,4 %iger Lactalbumin-Lösung zugegeben wird, und bis zur weiteren Verwendung auf Eis lagern. Um rekombinantes, mit Histidin markiertes G4R1 an Kobalt-Kügelchen zu binden, jeweils einen Milliliter Kobalt-Kügelchen-Suspension zu jedem 50-Milliliter-Röhrchen mit geklärtem bakteriellem Lysat hinzufügen.

Die Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubieren. Nach der Inkubation die Kobalt-Kügelchen in einer Tischzentrifuge bei 110 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius abzentrifugieren. Die Flüssigkeit vorsichtig absaugen und ein paar Milliliter Flüssigkeit stehen lassen, um die pelletierten Kobalt-Kügelchen nicht aufzuwirbeln.

Anschließend die Kügelchen mit 10 bis 15 Milliliter kalter 4× SSC-Pufferlösung plus BME waschen und die Kügelchen erneut abzentrifugieren. Den nächsten geklärten Lysat auf die abzentrifugierten Kobaltkügelchen geben. 20 Minuten länger bei Raumtemperatur am Rotator inkubieren und die Kügelchen anschließend mit 10 bis 15 Milliliter 4× SSC-Pufferlösung plus BME waschen.

Schließlich die Perlen bei 100 × g fünf Minuten bei vier Grad Celsius pelletieren. Nach einer zweiten Waschung die Flüssigkeit abpipettieren und etwa zwei Milliliter der Perlen und Flüssigkeit am Röhrchenboden belassen. Die mit Protein beladenen Kobaltperlen mithilfe einer 1-Milliliter-Weitmund-Pipettenspitze in ein vorab gekühltes 2-Milliliter-Röhrchen überführen.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen kurz im 2-mL-Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius. Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig den Überstand mittels Pipettieren, wobei darauf geachtet werden muss, die kobaltgebundenen Proteinkügelchen nicht zu verlieren. Geben Sie 0,5 Milliliter Histidin-Elutionspuffer oder HEB auf die Kügelchen und resuspendieren Sie diese durch Vorsichtiges Umstülpen des Röhrchens.

Anschließend die Kobaltkügelchen in HEB fünf Minuten lang in einem Kühlschrank auf einem Rotator inkubieren. Danach die Suspension bei 18.000 × g in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius eine Minute lang zentrifugieren. Vorsichtig den proteinhaltigen Überstand durch vorsichtiges Pipettieren abheben, wobei eine kleine Menge Flüssigkeit auf der Oberfläche der Kobaltkügelchen verbleibt.

Überführen Sie den Überstand in ein vorab gekühltes 15-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie diese Schritte insgesamt dreimal für HEB-Elutionen. Anschließend erfolgt eine Elution mit 0,2 molarer EDTA bei pH 6,0.

Die Farbe der Kobaltkügelchen wechselt von rosa zu weiß, während EDTA das Kobalt chelatiert. Nachdem diese vierte und letzte Elution in das 15-Milliliter-Röhrchen überführt wurde, pipettieren Sie den restlichen Elutionspuffer von den Kobaltkügelchen unter Verwendung einer Gel-Ladepipettenspitze am Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab. Indem die Spitze bis zum Boden des Röhrchens eingetaucht wird, kann der restliche, Protein enthaltende Elutionspuffer aufgefangen werden.

Führen Sie die vorbereiteten G4-SPB mit einem Magneten an die Röhrenwand und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie dann ein Milliliter 3× Res-Puffer zu den G4-SPB und pipettieren Sie zur Mischung. Pipettieren Sie die in 3× Res-Puffer suspendierten G4-SPB in die 15-Milliliter-Röhrchen, die etwa zwei Milliliter proteinhaltiges HEB EDTA enthalten.

30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter gelegentlichem Schütteln inkubieren, damit die Kügelchen nicht absinken. Nach dem Waschen der proteinbindenden G4-SPB gemäß der schriftlichen Protokollanleitung die G4-SPB mit einem Magneten auf Eis pelletieren und die Kügelchen in 100 Mikroliter prägewärmtem Elutionspuffer resuspendieren. Die Kügelchen unverzüglich in ein prägewärmtes PCR-Röhrchen überführen und 30 Sekunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Fügen Sie umgehend 12 Mikroliter Fünf-Molar-Natriumchlorid hinzu und pipettieren Sie 20 bis 30 Mal kräftig auf und ab. Die Kombination aus hohem Salzgehalt und ATP im Elutionspuffer dient dazu, rekombinantes G4R1 von den G4-Kügelchen zu eluieren. Zentrifugieren Sie die G4-SPB sofort mit einem Magneten und übertragen Sie das proteinhaltige Eluat in ein frisches PCR-Röhrchen auf Eis.

Nach der Wiederholung der Elution und Übertragung beträgt das Endergebnis etwa 200 Mikroliter Elutionspuffer, der gereinigtes rekombinantes G4R1 enthält. Führen Sie abschließend den Qualitätskontroll-Enzymaktivitätstest durch, um zu überprüfen, ob hochaktives rekombinantes G4R1 wie im Textprotokoll beschrieben gereinigt wurde. Der G4-Test liefert eine Messgröße für die enzymatische Aktivität von rekombinantem G4R1.

Im Bereich von 0,2 bis 0,013 Mikrolitern des Enzyms wird typischerweise beobachtet, dass 50 % von 0,2 Pikomol tetramethylrhodamin-markierter tetramolekularer G4-DNA in Monomere umgewandelt werden. Die Coomassie-Färbung des gereinigten rekombinanten G4R1 zeigt ein einzelnes Band bei der erwarteten Größe von 120 Kilodalton mit einem geringen kontaminierenden Band bei etwa 75 Kilodalton. Dieses Band könnte ein abgeschnittenes rekombinantes G4R1 darstellen, das die Fähigkeit beibehalten hat, an G4-DNA-Kügelchen zu binden und auf ATP-abhängige Weise zu eluieren.

Das Band von Interesse wird anhand einer Protein-Standardkurve quantifiziert. Mit diesem Protokoll erhält man typischerweise 200 Mikroliter einer 20 bis 100 Nanomolar gereinigten Enzymlösung pro Liter Bakterienkultur. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das G4 Resolvase1-Protein aus einem bakteriellen Expressionssystem mithilfe eines einzigartigen, ATP-abhängigen Reinigungsschritts gewinnen kann, um ein nahezu reines und katalytisch aktives Enzym zu isolieren.

Wenn die Methode beherrscht ist und die gefrorenen Bakterienpellets zuvor vorbereitet wurden, kann die Reinigung des rekombinanten G4R1 innerhalb von etwa sechs Stunden durchgeführt werden. Um die optimale katalytische Aktivität des Enzyms aufrechtzuerhalten, ist es wichtig, die Zubereitung auf Eis zu halten, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie stets Proteaseinhibitoren.

Vermeiden Sie Blasenbildung in den Röhrchen. Gefrieren Sie das gereinigte Enzym schnell ein und vermeiden Sie unnötige Einfrier- und Auftauzyklen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet den Weg, um die Bindungsaffinitäten und Helikaseaktivitäten dieses Proteins gegenüber einer breiten Palette von DNA- und RNA-Substraten genau zu bestimmen.

Diese Methode kann ebenfalls für die Reinigung anderer ATP-abhängiger Nukleinsäure-Enzyme angepasst werden, bei denen das Produkt der enzymatischen Reaktion kein Bindungssubstrat für das Enzym mehr ist.