Name: Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Lernen Sie die Patch-Clamp-Technik zur Bestimmung der Chloridselektivität in Channelrhodopsinen. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Aufnahmen in HEK293-Zellen mit direktem Auslesen der biophysikalischen Kanalaktivität.

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Wir danken Maila Reh, Tharsana Tharmalingam und vor allem Altina Klein für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 bis PH) und dem Exzellenzcluster Vereinigungskonzepte in der Katalyse, UniCat, BIG-NSE (JV) und E4 (PH) unterstützt.

<ol><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+sensory+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Algal sensory photoreceptors.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle.</a> Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+noninvasive+activation+and+inhibition+of+neural+and+network+activity+by+vertebrate+rhodopsin+and+green+algae+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).</li>
<li>Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+selectivity+and+competition+in+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ion selectivity and competition in channelrhodopsins.</a> Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).</li>
<li>Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476</a> (2012).</li>
<li>Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Channelrhodopsin+with+a+Red-Shifted+Spectrum+and+Rapid+Kinetics+from+Mesostigma+viride%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride.</a> MBio. 2 (3), 1-9 (2011).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+highly+efficient+blue-shifted+channelrhodopsin+from+the+marine+alga+Platymonas+subcordiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis.</a> J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).</li>
<li>Hou, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+Chlamydomonas+Channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins.</a> Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).</li>
<li>Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation+of+Channelrhodopsin+into+a+Light-Activated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel.</a> Science. 344 (6182), 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomonas+sulcata+ACR1%3A+A+Fast+Anion+Channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).</li>
<li>Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Natural+Green+Light+Absorbing+Chloride+Conducting+Channelrhodopsin+from+Proteomonas+sulcata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata.</a> J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+patch+clamp%3A+A+method+for+resolving+currents+through+individual+open+channels+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol.+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Amtmann, A., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+procedure+for+the+correction+of+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments+on+endo-+and+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes.</a> J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).</li>
<li>Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch01.pdf">Using microelectrodes.</a> Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Pusch, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+diffusional+exchange+between+small+cells+and+a+measuring+patch+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).</li>
<li>Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266</a> (2011).</li>
<li>Prigge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color-tuned+channelrhodopsins+for+multiwavelength+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics.</a> J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).</li>
<li>Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3325117/">Rectification of the channelrhodopsin early conductance.</a> Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).</li>
<li>Beppu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+countering+of+glial+acidosis+suppresses+glial+glutamate+release+and+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage.</a> Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).</li>
<li>Wietek, J., Prigge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+Channelrhodopsins%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancing Channelrhodopsins: An Overview.</a> Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).</li>
<li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+approaches+addressing+extracellular+modulation+of+neural+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability.</a> Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red-shifted+optogenetic+excitation%3A+a+tool+for+fast+neural+control+derived+from+Volvox+carteri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri.</a> Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).</li>
<li>Sugiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocurrent+attenuation+by+a+single+polar-to-nonpolar+point+mutation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).</li>
<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v14/n4/full/nn.2776.html">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+differentiating+photocurrent+properties+of+two+channelrhodopsins+from+chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas.</a> J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).</li>
<li>Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eNpHR%3A+a+Natronomonas+halorhodopsin+enhanced+for+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).</li>
<li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Bestimmung von Umkehrpotentialen bei definierten ionischen und elektrischen Bedingungen liefert Informationen über die nach der Lichtaktivierung von ChRs transportierten Ionenspezies. Wenn nur eine Ionenspezies in einem komplexen physiologischen Medium variiert wird und die erhaltenen Umkehrpotentialverschiebungen nach dem theoretischen Nernstpotential sind, ist diese Ionensorte die einzige transportierte. Für ChRs sind jedoch Umkehrpotentialverschiebungen in der Regel weniger ausgeprägt...

Channelrhodopsine (ChR) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, die im Augenfleck von beweglichen Grünalgen vorkommen und als primäre Photosensoren für Phototaxis und phobische Reaktionen dienen 1 . Seit ihrer ersten Beschreibung im Jahr 2002 haben die ChRs den Weg für das entstehende Feld der Optogenetik geebnet und können in einer Vielzahl von erregbaren Zellen angewendet werden, z. B. in Skelettmuskeln, im Herzen oder im Gehirn 3 , 4 , 5 . Die Expression von ChRs in Zielzellen führt zu einer lichtsteuerbaren Ionenpermeabilität der jeweiligen Zelle. In einem neuronalen Kontext ermöglicht dies die Aktivierung 6 , 7 , 8 oder die Hemmung 9 , 10 des Aktionspotentials (AP), die - abhängig vom geführten Ion - mit dem räumlichen und zeitlichen abfeuertPräzision des Lichts, die hervorhebt, wie die Ionenselektivität einer ChR-Variante ihre optogenetische Anwendung bestimmt. Die ersten entdeckten ChRs von Chlamydomonas reinhardtii und Volvox carteri sind für Protonen durchlässig, aber auch für monovalente Kationen wie Natrium, Kalium und in geringerem Maße zu zweiwertigen Kationen wie Calcium und Magnesium 11 , 12 , 13 . Heute sind mehr als 70 natürliche kationenleitende Kanalrhodopsine (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 und mehrere konstruierte Varianten 18 , 19 , 20 mit unterschiedlichen Eigenschaften wie Photostromgröße, spektrale Empfindlichkeit, Kinetik und Kationenselektivität stehen zur Verfügung. Während in der Neurowissenschaften, CCRs aRe verwendet, um Zellen zu aktivieren und APs auszulösen, waren lichtgetriebene mikrobielle Pumpen die einzigen verfügbaren Antagonisten für die Stummschaltung von Neuronen seit Jahren. Im Jahr 2014 zeigten zwei Gruppen gleichzeitig, dass CCRs durch Veränderung der Polarität entlang der putativen Ionen leitenden Pore über molekulare Technik 9 , 21 in anion-leitende Kanalrhodopsine (ACRs) umgewandelt werden können . Anschließend wurden natürliche ACRs in mehreren Kryptophytenalgen 22 , 23 , 24 identifiziert. Am wichtigsten ist, dass die Lichtaktivierung von ACRs Chloridströme in erwachsenen Neuronen vermittelt, was eine Hemmung der neuronalen Aktivität bei viel geringeren Lichtintensitäten ermöglicht als mikrobielle Pumpen, die nur einzelne Ladungen pro absorbiertem Photon transportieren. Die ChR-Aktivität kann direkt durch elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen von lichtinduzierten Strömen in HEK293-Zellen adressiert werden. Die Patch-ClampTechnik wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und weiter verbessert von Hamill et al. , Wodurch die Aufzeichnung der Entität von Strömen aus einer kleinen Zelle (Ganzzellenmodus) mit hoher Stromauflösung und direkter Steuerung der Membranspannung 26 ermöglicht wird. In der Zellkultur angewendet, bietet diese Technik eine genaue Kontrolle sowohl der ionischen als auch der elektrischen Aufzeichnungsbedingungen und ermöglicht die Untersuchung der Ionenselektivität zusammen mit dem relativen Beitrag der Ionen zum Gesamtstrom. Hier veranschaulichen wir die Untersuchung der Ionenselektivität für das anion-leitende Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 über die Aufzeichnung von Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen extrazellulären Chlorid-Konzentrationen, um eine hohe Chlorid-Leitfähigkeit zu beweisen.

<table><tbody><tr><td>HEK293-Zellen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>Menschliche embryonale Nierenzellen</td></tr><tr><td>Retinal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>all-trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Agarbrücken</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td>Roth 3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrome</td><td>S0615</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-Glucose</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-Methyl-D-glukamin</td></tr><tr><td>Na-Aspartat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6683</td><td>L-Asparaginsäure Natriumsalzmonohydrat</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>Chemocompetent E. coli</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Bouillon Medium</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Agar Platten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Aufreinigungskit</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Biochrom</td><td>A 2213</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Deckglasbeschichtung</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Feuerpolitur</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>TPP</td><td></td><td>Verschiedene Größen</td></tr><tr><td>Reinbank</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>Rührer</td><td>IKA</td><td>RCT klassisch</td><td></td></tr><tr><td>Silberdraht</td><td>Science Products</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>Elektroden, 0,64 mm (Bad); 0,25 mm (Elektrode)</td></tr><tr><td>pH-Meter</td><td>Knick</td><td>765 Kalimetrisches</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Feuerpolier</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Binder</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm intern Durchmesser</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Roth</td><td>P232</td> Thermometer <td>mit 15 mm Durchmesser</td></tr><tr><td></td><td>R&ouml; ssel Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10 Übertragung</td></tr><tr><td>Pipettenhalter</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Kopftisch</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitalisierer</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>DigiData1400</td><td>Digitaler Analogwandler</td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>Set auf 540 nm volle Intensität</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>Shuttertreiber</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>Borsilikatkapillaren mit feuerpolierten Enden OD 1,5 mm ID&nbsp; 0,86 mm</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Badhandler</td><td>Lorenz Messger&auml; tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>Tripleband Filterset</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>Fluoreszenzfilter&nbsp; ECFP/EYFP/mCherry&nbsp;</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>Optometer</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>Messung von Lichtintensitäten</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0</td></tr><tr><td>DIC Mikromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Aufnahmekammer</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>Vermeidet elektrisches Rauschen durch das Mikroskop Eingebautes Netzteil</td></tr><tr><td>Vibrationsisolierter Tisch</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Sonderanfertigung oder jeder handelsübliche passende Tisch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schläuche</td><td>Alle kommerziellen; z. B. Roth</td><td></td><td>Verschiedene Größen und Materialien für die Badhandhabung und die Anwendung von Pipettendruck; Agarbrücken</td></tr><tr><td>Linear Shaker</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigsperrschicht-Potentialrechner</td><td>Molecular Devices oder direkt von Peter H. Barry</td><td></td><td>Das Programm ist in der Clampex-Erfassungssoftware enthalten oder kann von p.barry@unsw.edu.au bezogen werden</td></tr><tr><td>Datenerfassungssoftware</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>Datenauswertungssoftware</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank oder Addgene</td><td>KF992074.1 oder Addgene Plasmid #85465</td><td>Genkodierung für PsACR1</td></tr><tr><td>Amplifier guide</td><td>Molecular Devices</td><td>Der Axon Guide</td><td></td></tr></tbody></table>

ganzzellige patch-clamp-aufnahmen zur elektrophysiologischen bestimmung der ionenselektivität in channelrhodopsinen

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

In den letzten zehn Jahren wurden Channelrhodopsine in der neurowissenschaftlichen Forschung unentbehrlich, wo sie als Werkzeuge zur nicht-invasiven Manipulation elektrischer Prozesse in Zielzellen verwendet werden. In diesem Zusammenhang ist die Ionenselektivität eines Kanalrhodopsins von besonderer Bedeutung. Dieser Artikel beschreibt die Untersuchung der Chloridselektivität für ein kürzlich identifiziertes anion-leitendes Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata über elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen auf HEK293-Zellen. Das experimentelle Verfahren zur Messung von lichtgesteuerten Photoströmen erfordert eine schnell umschaltbare - idealerweise monochromatische - Lichtquelle, die in das Mikroskop eines ansonsten konventionellen Patch-Clamp-Setups eingekoppelt ist. Vorbereitende Verfahren vor dem Experiment werden unter Berücksichtigung von gepufferten Lösungen, Überlegungen über Flüssigkeitsübergangspotentiale, Seeding und Transfektion von Zellen und Ziehen von Patchpipetten skizziert. Die tatsächliche Aufzeichnung der Strom-Spannungs-BeziehungS zur Bestimmung der Umkehrpotentiale für verschiedene Chloridkonzentrationen findet nach der Transfektion 24 h bis 48 h statt. Schließlich werden elektrophysiologische Daten in Bezug auf theoretische Überlegungen zur Chloridleitung analysiert.

<html> Fig. 2 zeigt repräsentative Ergebnisse, die aus Messungen nach dem beschriebenen Protokoll erhalten wurden. Bei der Beleuchtung mit grünem Licht weist der Ps ACR1 einen schnellen Übergangsstrom auf, der schnell auf einen stationären Strompegel abfällt. Nach dem Ausschalten des Lichtes zerfallen die Photoströme innerhalb von Millisekunden auf Null (Abbildung 2A ). Der Austausch der extrazellulären Chloridkonzentration bewirkt eine Verschieb...

Dieser Artikel beschreibt, wie die Ionenselektivität von Channelrhodopsin mit elektrophysiologischen Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen unter Verwendung von HEK293-Zellen bestimmt wird. Hier wird das experimentelle Verfahren zur Untersuchung der Chloridselektivität eines anionenselektiven Channelrhodopsins demonstriert. Das Verfahren ist jedoch auf andere Channelrhodopsine mit ausgeprägter Selektivität übertragbar.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Chloridselektivität neuer lichtgesteuerter Ionenkanäle zu bestimmen. Diese Methode kann Schlüsselfragen in der Biophysik von Kanalrhodopsinen beantworten, wie z.B. Photostromamplituden, Kinetik und Ionenselektivität. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die direkte Auslesung der biophysikalischen Kanalaktivität, die schnell und einfach zu replizieren ist.In der Regel werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da jeder Schritt des experimentellen Verfahrens von der Präparation der HEK-Zellen bis zur Aufzeichnung der Photoströme optimiert werden muss. Die Aussaat und Transektion der HEK-Zellen wird von Altina Klein vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, werden die festen Bestandteile für 100 Milliliter der intrazellulären und 500 Milliliter der extrazellulären gepufferten Lösungen in getrennten Bechern gewogen.Und dann die jeweilige Menge der vorbereiteten Stammlösungen hinzufügen. Fügen Sie anschließend Reinstwasser hinzu und stellen Sie den pH-Wert vorsichtig mit Säuren und Basen ein. Dann stellen Sie die Osmolarität mit Glukose auf 290 Milliosmole bzw. 320 Milliosmole für die intrazelluläre bzw

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Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

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Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in...

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Das Video zeigt, wie die elektrische Aktivität in den Photorezeptorneuronen des Ommatidiums von Drosophila aufgezeichnet wird, indem eine Ganzzellkonfiguration etabliert wird. Es hebt die Aktivierung transienter Rezeptorpotentialkanäle durch Lichtimpulse hervor, was zu messbaren Quantenbumps führt.

Ganzzell-Spannungsklemmen-Aufzeichnungen von Drosophila-Photorezeptoren

In diesem Video zeigen embryonale Nierenzellkulturen, die lichtabhängige Ionenkanalproteine exprimieren, die mit einem fluoreszierenden Reporter fusioniert sind, die Wirkung von Licht auf die Ionenbewegung. Die Ganzzell-Patch-Klemme wird verwendet, um die Bewegung von Ionen zu überwachen.

Optogenetische Elektrophysiologie Erfassung von Zellen mit lichtabhängigen Ionenkanälen

Wir beschreiben die Herstellung von dünnen Scheiben von retinalen Wasserorganismen Tiger Salamander...

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Der Zweck dieses Videos ist es, Verfahren zur Gewinnung von gesunden, intakten Haarzellen aus den Innenohr Organe ausgewachsener Zebrafisch und dann mit ihnen für Patch-Clamp-Untersuchungen zur Charakterisierung der biophysikalischen Eigenschaften ihrer spannungsabhängigen Kanälen ausgerichtet demonstrieren.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Lernen Sie die Patch-Clamp-Technik zur Bestimmung der Chloridselektivität in Channelrhodopsinen. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Aufnahmen in HEK293-Zellen mit direktem Auslesen der biophysikalischen Kanalaktivität.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

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