Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Chloridselektivität neuer lichtgesteuerter Ionenkanäle zu bestimmen. Diese Methode kann Schlüsselfragen in der Biophysik von Kanalrhodopsinen beantworten, wie z.B. Photostromamplituden, Kinetik und Ionenselektivität. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die direkte Auslesung der biophysikalischen Kanalaktivität, die schnell und einfach zu replizieren ist.

Regel werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da jeder Schritt des experimentellen Verfahrens von der Präparation der HEK-Zellen bis zur Aufzeichnung der Photoströme optimiert werden muss. Die Aussaat und Transektion der HEK-Zellen wird von Altina Klein vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, werden die festen Bestandteile für 100 Milliliter der intrazellulären und 500 Milliliter der extrazellulären gepufferten Lösungen in getrennten Bechern gewogen.

Und dann die jeweilige Menge der vorbereiteten Stammlösungen hinzufügen. Fügen Sie anschließend Reinstwasser hinzu und stellen Sie den pH-Wert vorsichtig mit Säuren und Basen ein. Dann stellen Sie die Osmolarität mit Glukose auf 290 Milliosmole bzw. 320 Milliosmole für die intrazelluläre bzw. extrazelluläre Lösung ein.

Bei diesem Verfahren legen Sie bis zu drei lysinbeschichtete Glasdeckgläser nebeneinander in eine 35-Millimeter-Petrischale. Dann säen Sie 1,5 mal 10 bis zur fünften HEK-Zellen in zwei Milliliter Standard-DMEM, ergänzt mit 10% FBS und einem mikromolaren Retinol in jeder Schale. Um die Zellen für jede Schale zu transfizieren, bereiten Sie eine Lösung aus zwei Mikrogramm Plasmid-DNA in 250 Mikrolitern DMEM ohne FBS und sechs Mikrolitern Transfektionsreagenz vor.

Nach 15 Minuten Inkubation geben Sie die Lösung vorsichtig in die Zellen. Ziehen Sie vor der Messung einige Patch-Pipetten mit niedrigem Widerstand mit einem Mikropipettenabzieher und polieren Sie sie. Bewahren Sie die Pipetten für den Tag der Messung in einem staubfreien Behälter auf.

Schalten Sie 30 Minuten vor den Aufnahmen alle Setup-Komponenten ein, um sie auf die Arbeitstemperatur aufzuheizen. Stellen Sie sicher, dass die Puffer Raumtemperatur haben. Versiegeln Sie zunächst die Messkammer mit Silikon, um ein Auslaufen des externen Puffers zu verhindern.

Legen Sie dann ein Deckglas in die Kammer und schließen Sie es. Füllen Sie die Kammer vorsichtig mit extrazellulärem Puffer, um zu verhindern, dass sich die Zellen ablösen. Bewahren Sie die Petrischale mit anderen Deckgläsern in einem Inkubator für die nächsten Experimente auf.

Platzieren Sie dann die Messkammer unter dem Mikroskop mit dem 40X-Objektiv zur Zellvisualisierung. Setzen Sie anschließend eine Schneckenbrücke über die Badelektrode und platzieren Sie diese zusammen mit dem Füllstandssensor und dem Perfusionsauslass des Badhandlers in der Kammer. Tauschen Sie die extrazelluläre Lösung zweimal gegen einen Milliliter frische externe Lösung aus, um das restliche Kulturmedium und die abgelösten Zellen zu entfernen.

Bringen Sie die Zellen in den Fokus und suchen Sie nach einer transfizierten Zelle, die von anderen Zellen isoliert werden muss. Verwenden Sie dann ein Triple-Band-Filterset und orangefarbenes Licht, um mCherry anzuregen und zu visualisieren. Füllen Sie anschließend eine der gezogenen Pipetten mit der intrazellulären Lösung.

Und entfernen Sie die Luftblasen, indem Sie die Pipette mehrmals drehen. Montieren Sie anschließend die Pipette auf den Pipettenhalter und üben Sie einen positiven Druck aus, um ein Verstopfen der Spitze zu verhindern. Positionieren Sie die Spitze der Patch-Pipette unter dem Mikroskop und navigieren Sie sie mit dem Mikromanipulator nahe an die Zelle.

Starten Sie in der Datenerfassungssoftware den Membrantest im Badmodus und legen Sie einen Spannungsschritt an. Prüfen Sie, ob der Pipettenwiderstand im gewünschten Bereich von 1,3 bis 3,0 Megaohm liegt. Stellen Sie dann die Offset-Ströme auf Null und stellen Sie das Pipettenpotenzial ein, indem Sie den Pipetten-Offset-Knopf am Verstärker drehen.

Um ein Pflaster in der Ganzzellkonfiguration zu etablieren, nähern Sie sich der Zelle langsam mit der Patch-Pipette von oben und lassen Sie den Überdruck ab, kurz bevor Sie die Zelle berühren. Manchmal bildet sich die Cell-Attached-Konfiguration danach von selbst. Nachdem Sie sich der Zelle genähert haben, wechseln Sie den Membrantest vom Badmodus in den Patch-Modus.

Kompensieren Sie die Pipettenkapazität, indem Sie den Knopf zur Kompensation der Pipettenkapazität drehen, um eine flache Reaktion des Testimpulses zu erhalten. Schalten Sie den Membrantest in den Zellmodus. Brechen Sie dann das Pflaster, ohne die Versiegelung zu zerstören, indem Sie kurze Impulse mit Unterdruck oder Unterdruck mit zunehmender Stärke anwenden, um eine Bestätigung der gesamten Zelle zu erhalten.

Starten Sie die Kompensation des Serienwiderstands, indem Sie die beiden Ganzzellenparameter, die Zellkapazität und den Serienwiderstand, einstellen. Schalten Sie im Bedienfeld für die Serienwiderstandskompensation die Vorhersage und Korrektur bis zu 90 % ein, schalten Sie dann den Ganzzellenkompensationsschalter ein und passen Sie die Ganzzellenparameter iterativ an, um eine ideal flache Testdichtungsreaktion zu erhalten. Warten Sie nach dem Einrichten der Ganzzellkonfiguration mindestens zwei Minuten, bevor Sie aufzeichnen, um sicherzustellen, dass die intrazelluläre Lösung durch die Patch-Pipette ausreichend ausgetauscht wird.

Erfassen Sie lichtinduzierte Ströme bei unterschiedlichen Haltepotentialen. Tauschen Sie anschließend den extrazellulären Puffer mindestens fünfmal gegen niedriges Chlorid in der Kammer aus, ohne das Pflaster zu zerstören, und zeichnen Sie eine weitere Stromspannungsbeziehung bei der neuen Chloridkonzentration auf. Diese Abbildung zeigt, dass PsACR1 während der Beleuchtung mit grünem Licht einen schnellen transienten Strom aufweist, der schnell auf ein stationäres Stromniveau abfällt.

Nach dem Ausschalten des Lichts klingen die Photoströme innerhalb von Millisekunden auf Null ab. Durch die Reduzierung der extrazellulären Chloridkonzentration werden nach außen gerichtete Photoströme vollständig aufgehoben. Der Austausch der extrazellulären Chloridkonzentration bewirkt eine Verschiebung des Umkehrpotentials, die sich aus einem Stromspannungsdiagramm ableiten lässt.

Die Auswertung der Umkehrpotentiale aus mehreren Messungen quantifiziert die dramatische Umkehrpotentialverschiebung, die durch die Variation der externen Chloridkonzentration verursacht wird. Auffällig ist, dass die gemessenen Umkehrpotentiale direkt mit den berechneten Nernst-Potentialen für Chlorid übereinstimmen, was die hohe Chloridselektivität von PsACR1 bestätigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie elektrophysiologische Aufzeichnungen von lichtinduzierten Photoströmen an HEK-Zellen durchgeführt werden, die Channelrhodopsin exprimieren.

Einmal gemeistert, kann das gesamte Verfahren in vier Tagen durchgeführt werden, während die Aufzeichnung der Photoströme mehrere Stunden dauert. Ergänzend zu diesem Verfahren können ortsgerichtete Mutagenese und spektroskopische Methoden durchgeführt werden, um strukturelle Merkmale und zelluläre Mechanismen von Channelrhodopsinen weiter aufzuklären. Die Charakterisierung und das molekulare Engineering von Kanalrhodopsin ebneten den Weg für Forscher in den Neurowissenschaften, die Erregbarkeit ausgewählter Neuronen durch Licht zu manipulieren.