Name: Atommikroskopie Untersuchungen zur DNA-Läsionserkennung bei der Nucleotide Excision Repair (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Anwendung der Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung von DNA-Läsionserkennung durch Reparaturproteine im Nukleotid-Excisions-Reparatur-System. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung molekularer Interaktionen.

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PUC19N, CPD-haltige Oligonukleotide und p44 wurden freundlicherweise von Samuel Wilson, Korbinian Heil und Thomas Carell und Gudrun Michels bzw. Caroline Kisker bereitgestellt. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 und TE-671/4 an IT unterstützt.

<ol><li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machines+of+DNA+repair%3A+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li>
<li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li>
<li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li>
<li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li>
<li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li>
<li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li>
<li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li>
<li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li>
<li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625(2015).</li>
<li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).</li>
<li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+UvrB%2C+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li>
<li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+TFIIH%2C+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA%2C+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li>
<li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li>
<li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li>
<li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules%3A+MutS-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li>
<li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product%2C+UvrB%2A+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UvrB+domain+4%2C+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li>
<li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li>
<li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li>
<li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

AFM statistische Analysen von Bindungspositionen von Proteinen auf langen DNA-Fragmenten, die spezifische Zielstellen enthalten, können interessante Details über die speziellen Strategien des Proteins zeigen, um diese Stellen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 zu erkennen. Um die daraus resultierenden Positionsverteilungen zu interpretieren, müssen die Positionen der Targets ...

Atomkraftmikroskopie (AFM) ist eine leistungsfähige Technik für die Analyse der Protein-DNA-Wechselwirkungen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Es erfordert nur geringe Mengen an Probenmaterial, um heterogene Proben direkt mit einer Auflösung auf Einzelmolekülebene zu visualisieren. Heterogenität kann aus verschiedenen konformationellen oder oligomeren Zuständen eines Proteins resultieren. Insbesondere können im Rahmen von Protein-DNA-Proben Proteinkomplexe unterschiedliche Stöchiometrien und / oder Konformationen aufweisen, die durch DNA-Bindung im Allgemeinen induziert werden oder an eine spezifische Zielstelle innerhalb der DNA binden. Heterogene Proben können auch zwei (oder mehrere) verschiedene Arten von Proteinen und verschiedene Proteinkomplexe enthaltenFormen ( zB bestehend aus nur einer Art von Protein gegenüber heteromeren Komplexen) können unterschiedlich mit DNA interagieren. Die hier diskutierten Studien nutzten die AFM-Bildgebung in der Luft auf statischen, getrockneten Proben von DNA-Reparaturproteinen, die an lange (~ 900 Basenpaare, bp) DNA-Fragmente gebunden sind, die eine Läsion enthalten, die ein Ziel dieser Proteine ​​darstellt. Die hohe molekulare Auflösung von AFM ermöglicht die Unterscheidung zwischen verschiedenen Arten von Proteinkomplexen und die Bestimmung der Bindungspositionen der Proteine ​​an den DNA-Fragmenten. Wichtig ist, dass die Läsionen in gut definierten Positionen in die DNA-Substrate eingebracht werden. Da die Position der Läsionsstelle in der DNA bekannt ist, liefern die Verteilungen von Proteinen, die an DNA gebunden sind, einen Einblick in (verschiedene) Läsionserkennungseigenschaften der (verschiedenen) Proteinkomplexe, zB wie gut sie eine bestimmte Art von Läsion erkennen (verglichen Zu nicht beschädigter DNA) 2 , 3 , <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 4 , 5 , 6 . Ihre Positionen auf der DNA erlauben auch die Unterscheidung zwischen Proteinkomplexen, die spezifisch an den Läsionen und Komplexen gebunden sind, die unspezifisch anderswo an der DNA gebunden sind. Eine getrennte Charakterisierung dieser verschiedenen komplexen Typen (Komplexe, die spezifisch an der Läsion gegenüber unspezifischen Komplexen gebunden sind) können potentielle Konformationsänderungen in den Komplexen zeigen, die bei der Zielortidentifizierung induziert werden. Die DNA-Reparaturproteine, die hier konzentriert sind, sind Helicasen, die für die Läsionserkennung in der Nucleotide Exzision Reparatur (NER) Weg verantwortlich sind. In Bakterien wird NER durch die Proteine ​​UvrA, UvrB und UvrC erreicht. UvrA ist verantwortlich für die initiale Läsionserfassung in einem UvaA 2 / UvrB 2 DNA-Scan-Komplex. Nach der Läsionsüberprüfung durch UvrB wandelt sich dieser Komplex in monomeres UvrB um, das an der Läsionsstelle gebunden ist, und dieser spezifische Komplex kann dann das p rekrutierenRokaryotische NER Endonuklease UvrC. UvrC verbreitet eine kurze (12-13 nt) Strecke einzelsträngiger DNA (ssDNA), die die Läsion enthält. Die fehlende Dehnung wird dann durch DNA-Polymerase nachgefüllt. Schließlich versiegelt die DNA-Ligase die neu synthetisierte Dehnung mit der ursprünglichen DNA 9 , 10 . Bei Eukaryonten sind die meisten Proteine ​​der NER-Kaskade Teil des großen, multimeren Transkriptionsfaktors II H (TFIIH) -Komplexes. Nach der ersten Läsionserfassung über den trimeren CEN2-XPC-HR23B-Komplex wird TFIIH an die DNA-Zielstelle rekrutiert. Wenn XPD innerhalb des Komplexes die Anwesenheit einer NER-Zielläsion verifiziert, werden die eukaryotischen NER-Endonukleasen XPG und XPF rekrutiert, um eine kurze (24-32 nt) Strecke von ssDNA, die die Läsion 9 , 10 enthält , zu exzimieren. Hier wurden insbesondere die Helicasen UvrB und XPD aus prokaryotischem und eukaryotischem NER untersucht. Diese Helicases erfordern eine ungepaarte Region in derDNA (eine DNA-Blase), um auf einen der beiden DNA-Einzelstränge zu fädeln und anschließend entlang diesem durch ATP-Hydrolyse angefeuerten Strang zu translozieren. Zusätzlich zu den DNA-Läsionen wurde daher eine DNA-Blase in die Substrate eingeführt, die als Ladestelle für die Proteine ​​fungieren. Das Verfahren zur Herstellung von spezifischen Läsions-DNA-Substraten wurde zuvor beschrieben 11 . Es erfordert ein kreisförmiges DNA-Konstrukt (Plasmid) mit zwei eng beabstandeten Restriktionsstellen für eine Nickase. Im Rahmen dieser Studie wurde das Plasmid pUC19N (2729 bp) verwendet (erstellt von S. Wilsons Laboratorium, NIEHS). Dieses Plasmid enthält drei eng beabstandete Restriktionsstellen für die Nickel Nt.BstNBI, die eine 48 Nukleotid (nt) Streckung bilden. Nach der Inkubation mit der Nickel kann die Strecke der ssDNA zwischen diesen Stellen entfernt und durch ein Oligonukleotid ersetzt werden, das ein beliebiges Zielmerkmal enthält. Nach jedem Schritt wird die vollständige enzymatische Verdauung über Agarosegel getestetElektrophorese Die vernetzte zirkuläre DNA kann aufgrund ihrer geringeren elektrophoretischen Beweglichkeit gegenüber dem ursprünglichen supercoiled Plasmid unterschieden werden. Das Anhängen der DNA und das Ersetzen der entfernten Dehnung durch das spezifische Substrat-Oligonukleotid können durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym ausgewertet werden, das das Substrat ausschließlich innerhalb des Bereichs zwischen den Nicks aufnimmt. Die Linearisierung des zirkulären Plasmids durch das Enzym wird daher für die gapped DNA unterdrückt und nach der Insertion des spezifischen Oligonukleotids wiederhergestellt. Schließlich erlauben zwei Endonuklease-Restriktionsstellen (idealerweise Einzelschneider) die Erzeugung eines linearen DNA-Substrats mit der gewünschten Länge und mit der spezifischen Zielstelle an einer definierten Position sowie einer DNA-Blase in einem Abstand von der Läsion entweder in 5 &#39;Oder 3&#39; Richtung. Die Erkennung der Läsionen durch die NER-Helicasen kann mittels AFM-Bildgebung untersucht werden . Stabile DNA-Translokation der Helicasen bei tEr Läsionsstelle ist als Peak in der Proteinpositionsverteilung auf der DNA sichtbar und zeigt eine Läsionserkennung an. Da die DNA-Translokation dieser Helicinen weiterhin mit einer 5&#39;-bis-3&#39;-Polarität gerichtet ist, zeigt die Abhängigkeit der Läsionserkennung an der Position der Ladestelle (DNA-Blase stromaufwärts oder stromabwärts der Läsion) auch an, ob die Läsion bevorzugt erkannt wird Auf dem translozierten oder auf dem entgegengesetzten, nicht translozierten ssDNA-Strang 5 , 9 . In den folgenden Abschnitten werden die angewandten Methoden eingeführt und wichtige Erkenntnisse aus diesen Experimenten werden kurz diskutiert. Wichtig ist, dass analog zur beispielhaften Arbeit zur hier beschriebenen DNA-Reparatur die AFM-Bildgebung auf die Untersuchung verschiedener DNA-interagierender Systeme wie der DNA-Replikation oder der Transkription 8 , 12 , 13 , 14 angewendet werden kann </Sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>Molecular Force Probe (MFP) 3D</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>Rasterkraftmikroskop (AFM)</td></tr><tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>N/A</td><td>Computer</td></tr><tr><td>ThermoMixer und 1,5 mL Block</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Heizblock für die DNA-Aufbereitung</td></tr><tr><td>Rotilabo Block-Heater H 250 & Blöcke für 0,5 mL Röhrchen</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Y264.1 & Y267.1</td><td>Heizblock für Protein-DNA-Inkubationen</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1704467</td><td>Elektrophoresekammer mit Gelgießer und Netzteil</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1645050</td><td>Elektrophorese-Netzteil</td></tr><tr><td>Centifuge 5415 D mit Rotor</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td><td>Tischzentrifuge</td></tr><tr><td>Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15</td><td>Ultralum</td><td>900-1322-02</td><td>UV-Bestrahlungstisch</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N/A</td><td>UV-Spektralphotometer</td></tr><tr><td>TKAX-CAD mit 0,2 &mu; m Kapselfilter</td><td>Unity Lab Services</td><td>N/A</td><td>Wasserentionisations- und Filtereinheit</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP Software auf Igor Pro</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>AFM Software</td></tr><tr><td>ImageJ (Open Source Java Bildverarbeitung)</td><td>NIH Image</td><td>N/A</td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>Excel (Microsoft Office)</td><td>Microsoft Corporation</td><td>N/A</td><td>Datenanalysesoftware</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab Corporation</td><td>N/A</td><td>Software für statistische Datenanalyse und Grafik</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMCL-AC240TS</td><td>Olympus</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>AFM Ausleger</td></tr><tr><td>Klasse V-5 Muskovit</td><td>SPI Liefert</td><td>1805</td><td>Glimmerblätter</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL 50k Ultracell</td><td>Millipore Ireland Ltd.</td><td>UFC505096</td><td>Zentrifugenfilter</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extrakt II&nbsp;</td><td>&nbsp; Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>Agarose-Gel-Extraktionskit</td></tr><tr><td>Rotilabo Zellulosepapier Typ 111A</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AP59.1</td><td>AFM Deposition Blotting</td></tr><tr><td>Papier Anatop 25 (0,02 &mu; m)</td><td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td><td>Spritzenvorsatzfilter</td></tr><tr><td>SSpI, BspQI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0132, R0712</td><td>Restriktionsenzyme für die DNA-Substratvorbereitung</td></tr><tr><td>XhoI, BglII</td><td></td><td>R0146, R0144</td><td>Restriktionsenzyme für die DNA-Präparation kontrolliert</td></tr><tr><td>Nicking-Restriktionsenzym Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0607</td><td>Nickase</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0202S</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>Tris, HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855, 9105</td><td>Pufferchemikalien</td></tr><tr><td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetat</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957, HN03, HN02, P026</td><td>Salzchemikalien</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>Salzchemikalien</td></tr><tr><td>DTT, TCEP, EDTA</td><td></td><td>6908, HN95, 8040</td><td>Chemikalien/ Reagenzien</td></tr><tr><td>Agarose, Essigsäure, HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2267, 3738, K025</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K054</td><td>Nukleotide</td></tr><tr><td>Oligonukleotid #1 in Tabelle 1</td><td>Biomere</td><td>kundenspezifische</td><td>komplementäre DNA-Oligonukleotide Oligonukleotide</td></tr><tr><td>#2, #3 und #6 in Tabelle 1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>kundenspezifisches</td><td>Fluorescein enthaltend Oligonukleotide</td></tr><tr><td>Oligonukleotide #4&nbsp; und #5 in Tabelle 1</td><td>privat (erhältlich z.B. bei TriLink oder GlenResearch)</td><td></td><td>CPD mit Oligonukleotiden</td></tr><tr><td>SafeSeal Reaktionsröhrchen 0,5 mL und 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.704 und 72.706</td><td>Inkubationsröhrchen</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA-Leiter</td></tr><tr><td>6x Konzentrat Gel Loading Farbstoff lila</td><td>Neu England Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>DNA-Ladefarbstoff</td></tr><tr><td>Midori Grün&nbsp;</td><td>Nippon Genetics Europe GmbH</td><td>999MG28055</td><td>DNA-Färbung</td></tr></tbody></table>

atommikroskopie untersuchungen zur dna-läsionserkennung bei der nucleotide excision repair

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

AFM-Bildgebung ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen. Diese Einzelmolekülmethode ermöglicht die gleichzeitige Auflösung verschiedener Moleküle und molekularer Anordnungen in einer heterogenen Probe. Im speziellen Kontext von DNA-interagierenden Proteinsystemen können so verschiedene Proteinkomplexformen und ihre entsprechenden Bindungspositionen an Zielstellen, die DNA-Fragmente enthalten, unterschieden werden. Hier wird eine Anwendung der AFM zur Untersuchung der Erkennung von DNA-Läsionen in den prokaryotischen und eukaryotischen Nukleotid-Exzisions-DNA-Reparatursystemen (NER) vorgestellt. Die Verfahren der DNA- und Proteinprobenvorbereitung werden beschrieben und experimentelle sowie analytische Details der Experimente zur Verfügung gestellt. Die Daten erlauben wichtige Rückschlüsse auf die Strategien, mit denen die Verifizierung der Zielstelle durch die NER-Proteine erreicht werden kann. Interessanterweise deuten sie auf unterschiedliche Ansätze der Läsionserkennung und -identifikation für das eukaryotische NER-System hin, abhängig von der Art der Läsion. Darüber hinaus führen unterschiedliche strukturelle Eigenschaften der beiden verschiedenen Helikasen, die an prokaryotischer und eukaryotischer NER beteiligt sind, zu den unterschiedlichen Strategien, die für diese beiden Systeme beobachtet wurden. Wichtig ist, dass diese experimentellen und analytischen Ansätze nicht nur auf die Untersuchung der DNA-Reparatur angewendet werden können, sondern auch sehr ähnlich auf andere DNA-interagierende Proteinsysteme, wie z. B. solche, die an Replikations- oder Transkriptionsprozessen beteiligt sind.

Unterscheidung zwischen verschiedenen komplexen Typen auf der Basis von Protein komplexen Volumina Die Helicaseaktivität der prokaryotischen NER-Helicase UvrB wird durch DNA-Bindung 22 , 23 stimuliert. UvrB benötigt eine ungepaarte Region in der DNA (eine DNA-Blase), um korrekt auf einen der beiden einzelnen ssDNA-Stränge zu laden. In vivo wird diese DNA-Struktur...

Hier wird die Untersuchung verschiedener Ansätze zur Erkennung von DNA-Läsionen mittels Einzelmolekül-AFM-Bildgebung am Beispiel des Nukleotid-Exzisions-Reparatursystems demonstriert. Es werden die Abläufe der DNA- und Proteinprobenvorbereitung sowie experimentelle sowie analytische Details für die AFM-Experimente beschrieben.

Atommikroskopie Untersuchungen zur DNA-Läsionserkennung bei der Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Das übergeordnete Ziel dieses Rasterkraftmikroskopie-Experiments ist es, Wechselwirkungen von DNA-Reparaturproteinen mit Schadensstellen in der DNA aufzuklären und zwischen verschiedenen DNA-Interaktionen verschiedener Proteinkomplexe zu unterscheiden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, z. B. wie ein bestimmtes DNA-Reparatursystem die Erkennung seiner Zielläsionen in der DNA erreicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die verschiedenen Arten von Komplexen, die an der Erkennung von DNA-Läsionen beteiligt sind, direkt sehen und analysieren können.Vorführen des Verfahrens wird Nicolas Wirth, der diesen Ansatz während seiner Bachelorarbeit angewandt hat. Bereiten Sie zunächst ein geeignetes DNA-Substrat vor, indem Sie eine einzelsträngige DNA-Lücke in einem Plasmid erzeugen. Füllen Sie die Lücke mit modifizierten, einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden auf und linearisieren Sie schließlich die Plasma-DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen.Für diese Experimente sind die doppelsträngigen DNA-Substrate etwa 1.000 Basenpaare lang und enthalten eine DNA-Läsion sowie eine ungepaarte Region, die als DNA-Blase bezeichnet wird, um das Protein auf die DNA zu laden. Bereiten Sie als Nächstes eine Protein-DNA-Probe für die AFM-Analyse vor, indem Sie zunächst 10x Reaktionspuffer und Wasser in ein Mikroreaktionsröhrchen pipettieren. Fügen Sie dann die DNA und die Proteine hinzu, die untersucht werden.Zum Beispiel werden hier 100 Nanomolare der DNA-Probe und je ein Mikromolar oder jedes der eukaryotischen Nukleotid-Exzisions-Reparaturproteine XPD und p44 verwendet. Inkubieren Sie die Reaktion dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wärmeblock. Nach der Inkubation schleudern Sie die Probe kurz herunter.Bereiten Sie als Nächstes ein Glimmersubstrat vor, auf das Sie die Probe legen können. Schneide mit einem Skalpell ein ein mal einen Zentimeter großes Stück Glimmer aus einem größeren Streifen. Entfernen Sie dann mit einem Stück Klebeband die oberen Schichten des Glimmers, um eine saubere, flache, anatomisch glatte Substratoberfläche freizulegen.Die Protein-DNA-Probe wird in AFM-Abscheidungspuffer um das Fünfzig- bis Hundertfache erweitert und sofort 20 Mikroliter der verdünnten Probe auf die Glimmeroberfläche abgegeben. Der Verdünnungsfaktor hängt von der Probenkonzentration ab. Spülen Sie die Probe unmittelbar nach dem Ablegen auf der Glimmeroberfläche drei- bis viermal mit einigen Millilitern gefiltertem, entionisiertem Wasser ab und tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab.Verwenden Sie einen sanften Stickstoffstrahl, um die Probe zu föhnen. Zum Schluss fixieren Sie die Probe mit Klebeband an den Rändern auf einem Objektträger. Legen Sie die Probe in die Mitte des AFM-Tisches und befestigen Sie den Objektträger mit Magnetpads auf dem Tisch.Setzen Sie dann die AFM-Spitze in den Spitzenhalter ein. Befestigen Sie die Spitze in der Halterung unter einer Klemme, indem Sie die Schraube fingerfest anziehen. Sobald er befestigt ist, führen Sie den Spitzenhalter in den AFM-Messkopf ein.Verwenden Sie die Positionierschrauben, um die Probe in eine zentrale Position zu bringen. Platzieren Sie den AFM-Messkopf auf der Probe und stellen Sie sicher, dass der Kopf stabil steht und sich mit den Beinen innerhalb der Tischvertiefungen befindet. Richten Sie anschließend den AFM-Laser auf der Rückseite des Cantilevers aus, um eine optimale Signalstärke zu erzielen.Beobachten Sie das Reflexionssignal im AFM-Videofenster, um den Laser grob zu positionieren. Drehen Sie bei diesem AFM-Modell die Räder an der rechten und hinteren Seite des AFM-Messkopfes, um die X- und Y-Positionen des AFM-Lasers einzustellen und ihn mittig auf das Ende des Auslegers zu richten. Optimieren Sie dann das Summensignal des Detektors, indem Sie die Laserposition mit den beiden Rädern fein abstimmen.Richten Sie die AFM-Laserreflexion auf die Detektormitte, indem Sie das unterschiedliche Signal von den oberen und unteren Dioden des Detektorarrays auf Null setzen. Drehen Sie für diesen Schritt die Schraube an der linken Seite des Messkopfes für dieses AFM-Modell. Bestimmen Sie als Nächstes die Cantilever-Residenzfrequenz, indem Sie in der Software in das Master-Panel-Tune-Fenster gehen.Wählen Sie eine Amplitude, die einem Ein-Volt-Eingang für den Piezo entspricht, der die Cantilever-Schwingung antreibt, und stellen Sie dann die Schwingungsfrequenz auf minus 5 % ein, etwas niedriger als die Aufenthaltsfrequenz. Führen Sie nun eine automatische Frequenzabstimmung durch und stellen Sie die Phase der Schwingung auf Null. Lassen Sie das System etwa eine Stunde lang das thermische Gleichgewicht erreichen, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen, um eine Drift zu vermeiden.Wenn Sie bereit sind, mit der Bildgebung zu beginnen, stellen Sie im Hauptfenster der Software einen schützenden Sollwert ein und bereiten Sie sich darauf vor, sich der Spitze der Probenoberfläche zu nähern, indem Sie Einrasten auswählen. Senken Sie das Vorderrad des AFM-Kopfes manuell ab, bis die Schutzeinstellung oder der Sollwert erreicht ist. Senken Sie dann das Vorderrad vorsichtig weiter ab, bis das Z-Sensorsignal vollständig nach links ausgefahren ist.Aktivieren Sie die Schwingschwingungstabelle und schließen Sie das Schallschutzgehäuse. Senken Sie anschließend den Sollwert in der AFM-Software mit dem Hamsterrad, um die AFM-Spitze fein mit der Probe zu verbinden. Um die Bildgebung im Abklopfmodus im abstoßenden Bereich durchzuführen, senken Sie den Sollwert ab, bis das Phasensignal etwas niedriger als die Phase mit freiem Pegel wird.Beginnen Sie dann mit dem Scannen der Probe. Verwenden Sie die Scangeschwindigkeit von 2,5 Mikrometern pro Sekunde in Bildoberflächen von vier Mikrometern x vier Mikrometern oder acht Mikrometern x acht Mikrometerquadraten mit Pixelauflösungen von 2.048 bzw. 4.096. und drücken Sie die Taste Scan ausführen. Wählen Sie relevante Protein-DNA-Komplexe durch direkte visuelle Inspektion der Bilder in der AFM-Software vor.Mögliche Komplexe für XPD-Proben sind XPD p44-DNA sowie XPD-DNA und p44-DNA, die aufgrund der unterschiedlichen Molekülmassen von XPD und p44 deutlich unterschiedlich groß sind. Messen Sie das Volumen einzelner Proteinpeaks auf der DNA, indem Sie das Schnittwerkzeug im Analysefenster verwenden, um die Höhe und den Durchmesser der Proteinpeakabschnitte mit den Cursorn des Schnittfensters zu messen. Verwenden Sie diese Werte, um das Volumen der Peaks mit einfachen mathematischen Modellen zu bestimmen, um den komplexen Typ zu überprüfen.Kalibrieren Sie schließlich Ihr AFM-System mit einer Reihe von Proteinen mit bekannten Molekulargewichten, um diese Volumina in ungefähre Molekulargewichte von Proteinen und Proteinkomplexen zu übersetzen. Um zusätzliche Merkmale, wie z.B. DNA-Fragmentlängen, die Positionen von Proteinkomplexen auf der DNA und ihre Zielortspezifitäten oder DNA-Bandenwinkel, zu bestimmen, siehe das begleitende Textprotokoll. Hier ist ein AFM-Bild mit drei verschiedenen Arten von DNA-gebundenen Komplexen zu sehen, die anhand ihrer unterschiedlichen Größe unterschieden werden können.Klasse-1-Komplexe sind nur mit dem Helikase-aktivierenden Co-Faktor p44 konsistent, Klasse-2-Komplexe bestehen nur aus dem XPD-Protein und Klasse-3-Komplexe bestehen sowohl aus XPD als auch aus p44, da die Legionserkennung durch XPD die Aktivierung seiner Helikase-Aktivität durch p44 erfordert und nur die Klasse-3-Komplexe eine Läsionserkennung zeigen. Um verschiedene Strategien zur Läsionserkennung zu identifizieren, wurden die Positionen der Proteine auf den DNA-Substraten für die Proteinbeladung an einer DNA-Blase entweder in den fünf Prime- oder in den drei Prime-Richtungen einer rot dargestellten DNA-Läsion für prokaryotische und eukaryotische NER-Helikasen gemessen. In den Positionsverteilungen der Proteine kann die Erkennung von DNA-Läsionen aufgrund einer verstärkten Bindung an der Position der DNA-Läsion als Peak angesehen werden.Die prokaryotische NER-Helikase UVRB und ihr eukaryotisches Gegenstück XPD zeigen unterschiedliche Strategien der CPD-Läsionserkennung, die auf unterschiedliche DNA-Strangpräferenzen hinweisen. Insbesondere werden CPD-Läsionen auf dem translozierten Strang durch UVRB erkannt, bevorzugt jedoch auf dem gegenüberliegenden, nicht translozierten Strang durch XPD. Einmal gemeistert, kann diese Methode in wenigen Stunden oder Tagen durchgeführt werden, einschließlich Analyse.Es ist wichtig, mit hochreinen Protein- und DNA-Proben zu arbeiten, um die Merkmale in den AFM-Bildern interpretieren zu können und das DNA-Substrat je nach biologischem System und Fragestellung, die man beantworten möchte, sorgfältig zu gestalten. Darüber hinaus sind Ensemble-Methoden, wie z. B. der Gelelektrophoreseraum, die Verschiebung der Elektromobilität oder DNA-Inzisionsassays, natürlich eine hervorragende Ergänzung zu diesen AFM-Experimenten; und diese Methoden können helfen, zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. zu DNA-Bindungsaffinitäten oder Exzisionsaktivitäten von DNA-Läsionen. Diese Technik ist ein relativ schneller und einfacher Ansatz, um Protein-DNA-Komplexe direkt sichtbar zu machen, und diese Komplexe geben uns ein gutes Bild von den Prozessen, die in einem biologischen System ablaufen.Dies ist natürlich nicht nur nützlich, um DNA-Reparaturprozesse zu verstehen, sondern kann auch auf andere Protein-DNA-Systeme angewendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine ziemlich gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine Probe Ihres bevorzugten Protein-DNA-Systems vorbereiten, wie Sie sie mit AFM abbilden und wie Sie nützliche Parameter für eine Interpretation Ihrer Daten extrahieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

Immunfluoreszenz-basierte Visualisierung von DNA-Reparaturprotein-Interaktionen

Elektronenspektroskopische Bildgebung kann Nukleinsäuren und Proteine mit Nanometerauflösung abbilden und unterscheiden. Es kann mit dem miniSOG-System kombiniert werden, das in der Lage ist, markierte Proteine in Transmissionselektronenmikroskopie-Proben spezifisch zu markieren. Den Einsatz dieser Technologien veranschaulichen wir am Beispiel von Doppelstrangbruch-Reparaturschwerpunkten.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur effizienten Identifizierung von S-Phasen-Zellen für nachgelagerte Mikroskopiestudien, wie z. B. die Messung der Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen durch Lasermikrobestrahlung.

Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase

Diese Arbeit stellt eine einfache und visuelle Methode Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform zu erfassen. Mit dem vorgeschlagenen Verfahren wird das gesamte Experiment, einschließlich Tropfenmanipulation und zum Nachweis von Mehr nucleotide polymorphisms, kann in der Nähe von 23 ° C ohne Zuhilfenahme moderner Instrumente durchgeführt werden.

Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

Erfahren Sie die Anwendung der Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung von DNA-Läsionserkennung durch Reparaturproteine im Nukleotid-Excisions-Reparatur-System. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung molekularer Interaktionen.

Atommikroskopie Untersuchungen zur DNA-Läsionserkennung bei der Nucleotide Excision Repair

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