Atommikroskopie Untersuchungen zur DNA-Läsionserkennung bei der Nucleotide Excision Repair

Das übergeordnete Ziel dieses Rasterkraftmikroskopie-Experiments ist es, Wechselwirkungen von DNA-Reparaturproteinen mit Schadensstellen in der DNA aufzuklären und zwischen verschiedenen DNA-Interaktionen verschiedener Proteinkomplexe zu unterscheiden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, z. B. wie ein bestimmtes DNA-Reparatursystem die Erkennung seiner Zielläsionen in der DNA erreicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die verschiedenen Arten von Komplexen, die an der Erkennung von DNA-Läsionen beteiligt sind, direkt sehen und analysieren können.

Vorführen des Verfahrens wird Nicolas Wirth, der diesen Ansatz während seiner Bachelorarbeit angewandt hat. Bereiten Sie zunächst ein geeignetes DNA-Substrat vor, indem Sie eine einzelsträngige DNA-Lücke in einem Plasmid erzeugen. Füllen Sie die Lücke mit modifizierten, einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden auf und linearisieren Sie schließlich die Plasma-DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen.

Für diese Experimente sind die doppelsträngigen DNA-Substrate etwa 1.000 Basenpaare lang und enthalten eine DNA-Läsion sowie eine ungepaarte Region, die als DNA-Blase bezeichnet wird, um das Protein auf die DNA zu laden. Bereiten Sie als Nächstes eine Protein-DNA-Probe für die AFM-Analyse vor, indem Sie zunächst 10x Reaktionspuffer und Wasser in ein Mikroreaktionsröhrchen pipettieren. Fügen Sie dann die DNA und die Proteine hinzu, die untersucht werden.

Zum Beispiel werden hier 100 Nanomolare der DNA-Probe und je ein Mikromolar oder jedes der eukaryotischen Nukleotid-Exzisions-Reparaturproteine XPD und p44 verwendet. Inkubieren Sie die Reaktion dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wärmeblock. Nach der Inkubation schleudern Sie die Probe kurz herunter.

Bereiten Sie als Nächstes ein Glimmersubstrat vor, auf das Sie die Probe legen können. Schneide mit einem Skalpell ein ein mal einen Zentimeter großes Stück Glimmer aus einem größeren Streifen. Entfernen Sie dann mit einem Stück Klebeband die oberen Schichten des Glimmers, um eine saubere, flache, anatomisch glatte Substratoberfläche freizulegen.

Die Protein-DNA-Probe wird in AFM-Abscheidungspuffer um das Fünfzig- bis Hundertfache erweitert und sofort 20 Mikroliter der verdünnten Probe auf die Glimmeroberfläche abgegeben. Der Verdünnungsfaktor hängt von der Probenkonzentration ab. Spülen Sie die Probe unmittelbar nach dem Ablegen auf der Glimmeroberfläche drei- bis viermal mit einigen Millilitern gefiltertem, entionisiertem Wasser ab und tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab.

Verwenden Sie einen sanften Stickstoffstrahl, um die Probe zu föhnen. Zum Schluss fixieren Sie die Probe mit Klebeband an den Rändern auf einem Objektträger. Legen Sie die Probe in die Mitte des AFM-Tisches und befestigen Sie den Objektträger mit Magnetpads auf dem Tisch.

Setzen Sie dann die AFM-Spitze in den Spitzenhalter ein. Befestigen Sie die Spitze in der Halterung unter einer Klemme, indem Sie die Schraube fingerfest anziehen. Sobald er befestigt ist, führen Sie den Spitzenhalter in den AFM-Messkopf ein.

Verwenden Sie die Positionierschrauben, um die Probe in eine zentrale Position zu bringen. Platzieren Sie den AFM-Messkopf auf der Probe und stellen Sie sicher, dass der Kopf stabil steht und sich mit den Beinen innerhalb der Tischvertiefungen befindet. Richten Sie anschließend den AFM-Laser auf der Rückseite des Cantilevers aus, um eine optimale Signalstärke zu erzielen.

Beobachten Sie das Reflexionssignal im AFM-Videofenster, um den Laser grob zu positionieren. Drehen Sie bei diesem AFM-Modell die Räder an der rechten und hinteren Seite des AFM-Messkopfes, um die X- und Y-Positionen des AFM-Lasers einzustellen und ihn mittig auf das Ende des Auslegers zu richten. Optimieren Sie dann das Summensignal des Detektors, indem Sie die Laserposition mit den beiden Rädern fein abstimmen.

Richten Sie die AFM-Laserreflexion auf die Detektormitte, indem Sie das unterschiedliche Signal von den oberen und unteren Dioden des Detektorarrays auf Null setzen. Drehen Sie für diesen Schritt die Schraube an der linken Seite des Messkopfes für dieses AFM-Modell. Bestimmen Sie als Nächstes die Cantilever-Residenzfrequenz, indem Sie in der Software in das Master-Panel-Tune-Fenster gehen.

Wählen Sie eine Amplitude, die einem Ein-Volt-Eingang für den Piezo entspricht, der die Cantilever-Schwingung antreibt, und stellen Sie dann die Schwingungsfrequenz auf minus 5 % ein, etwas niedriger als die Aufenthaltsfrequenz. Führen Sie nun eine automatische Frequenzabstimmung durch und stellen Sie die Phase der Schwingung auf Null. Lassen Sie das System etwa eine Stunde lang das thermische Gleichgewicht erreichen, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen, um eine Drift zu vermeiden.

Wenn Sie bereit sind, mit der Bildgebung zu beginnen, stellen Sie im Hauptfenster der Software einen schützenden Sollwert ein und bereiten Sie sich darauf vor, sich der Spitze der Probenoberfläche zu nähern, indem Sie Einrasten auswählen. Senken Sie das Vorderrad des AFM-Kopfes manuell ab, bis die Schutzeinstellung oder der Sollwert erreicht ist. Senken Sie dann das Vorderrad vorsichtig weiter ab, bis das Z-Sensorsignal vollständig nach links ausgefahren ist.

Aktivieren Sie die Schwingschwingungstabelle und schließen Sie das Schallschutzgehäuse. Senken Sie anschließend den Sollwert in der AFM-Software mit dem Hamsterrad, um die AFM-Spitze fein mit der Probe zu verbinden. Um die Bildgebung im Abklopfmodus im abstoßenden Bereich durchzuführen, senken Sie den Sollwert ab, bis das Phasensignal etwas niedriger als die Phase mit freiem Pegel wird.

Beginnen Sie dann mit dem Scannen der Probe. Verwenden Sie die Scangeschwindigkeit von 2,5 Mikrometern pro Sekunde in Bildoberflächen von vier Mikrometern x vier Mikrometern oder acht Mikrometern x acht Mikrometerquadraten mit Pixelauflösungen von 2.048 bzw. 4.096. und drücken Sie die Taste Scan ausführen. Wählen Sie relevante Protein-DNA-Komplexe durch direkte visuelle Inspektion der Bilder in der AFM-Software vor.

Mögliche Komplexe für XPD-Proben sind XPD p44-DNA sowie XPD-DNA und p44-DNA, die aufgrund der unterschiedlichen Molekülmassen von XPD und p44 deutlich unterschiedlich groß sind. Messen Sie das Volumen einzelner Proteinpeaks auf der DNA, indem Sie das Schnittwerkzeug im Analysefenster verwenden, um die Höhe und den Durchmesser der Proteinpeakabschnitte mit den Cursorn des Schnittfensters zu messen. Verwenden Sie diese Werte, um das Volumen der Peaks mit einfachen mathematischen Modellen zu bestimmen, um den komplexen Typ zu überprüfen.

Kalibrieren Sie schließlich Ihr AFM-System mit einer Reihe von Proteinen mit bekannten Molekulargewichten, um diese Volumina in ungefähre Molekulargewichte von Proteinen und Proteinkomplexen zu übersetzen. Um zusätzliche Merkmale, wie z.B. DNA-Fragmentlängen, die Positionen von Proteinkomplexen auf der DNA und ihre Zielortspezifitäten oder DNA-Bandenwinkel, zu bestimmen, siehe das begleitende Textprotokoll. Hier ist ein AFM-Bild mit drei verschiedenen Arten von DNA-gebundenen Komplexen zu sehen, die anhand ihrer unterschiedlichen Größe unterschieden werden können.

Klasse-1-Komplexe sind nur mit dem Helikase-aktivierenden Co-Faktor p44 konsistent, Klasse-2-Komplexe bestehen nur aus dem XPD-Protein und Klasse-3-Komplexe bestehen sowohl aus XPD als auch aus p44, da die Legionserkennung durch XPD die Aktivierung seiner Helikase-Aktivität durch p44 erfordert und nur die Klasse-3-Komplexe eine Läsionserkennung zeigen. Um verschiedene Strategien zur Läsionserkennung zu identifizieren, wurden die Positionen der Proteine auf den DNA-Substraten für die Proteinbeladung an einer DNA-Blase entweder in den fünf Prime- oder in den drei Prime-Richtungen einer rot dargestellten DNA-Läsion für prokaryotische und eukaryotische NER-Helikasen gemessen. In den Positionsverteilungen der Proteine kann die Erkennung von DNA-Läsionen aufgrund einer verstärkten Bindung an der Position der DNA-Läsion als Peak angesehen werden.

Die prokaryotische NER-Helikase UVRB und ihr eukaryotisches Gegenstück XPD zeigen unterschiedliche Strategien der CPD-Läsionserkennung, die auf unterschiedliche DNA-Strangpräferenzen hinweisen. Insbesondere werden CPD-Läsionen auf dem translozierten Strang durch UVRB erkannt, bevorzugt jedoch auf dem gegenüberliegenden, nicht translozierten Strang durch XPD. Einmal gemeistert, kann diese Methode in wenigen Stunden oder Tagen durchgeführt werden, einschließlich Analyse.

Es ist wichtig, mit hochreinen Protein- und DNA-Proben zu arbeiten, um die Merkmale in den AFM-Bildern interpretieren zu können und das DNA-Substrat je nach biologischem System und Fragestellung, die man beantworten möchte, sorgfältig zu gestalten. Darüber hinaus sind Ensemble-Methoden, wie z. B. der Gelelektrophoreseraum, die Verschiebung der Elektromobilität oder DNA-Inzisionsassays, natürlich eine hervorragende Ergänzung zu diesen AFM-Experimenten; und diese Methoden können helfen, zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. zu DNA-Bindungsaffinitäten oder Exzisionsaktivitäten von DNA-Läsionen. Diese Technik ist ein relativ schneller und einfacher Ansatz, um Protein-DNA-Komplexe direkt sichtbar zu machen, und diese Komplexe geben uns ein gutes Bild von den Prozessen, die in einem biologischen System ablaufen.

Dies ist natürlich nicht nur nützlich, um DNA-Reparaturprozesse zu verstehen, sondern kann auch auf andere Protein-DNA-Systeme angewendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine ziemlich gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine Probe Ihres bevorzugten Protein-DNA-Systems vorbereiten, wie Sie sie mit AFM abbilden und wie Sie nützliche Parameter für eine Interpretation Ihrer Daten extrahieren können.