Massenspektrometrie und luminogenes-basierte Ansätze zur Charakterisierung von Phase I Metabolic Competency von In Vitro Zellkulturen

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivität von Cytochrom P450 oder CYPs in kultivierten Zellen zu bestimmen. CYPs sind Schlüsselenzyme, die am Stoffwechsel von Arzneimitteln und Toxinen beteiligt sind, und ihre Expression wird in vitro oft nicht beibehalten. Die normale Expression von CYP-Enzymen geht oft verloren, wenn Zellen in vitro kultiviert werden.

Daher schränken viele In-vitro-Modelle die Relevanz für das Verständnis des Stoffwechsels von Arzneimitteln und Giftstoffen möglicherweise ein. Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit bei der Beurteilung der CYP-Aktivität in kultivierten Zellen. Unter Verwendung von Sondensubstraten und Inhibitoren werden verschiedene Quantifizierungsplattformen vorgestellt, einschließlich der Massenspektrometrie.

Besorgen Sie sich zunächst kryogene Fläschchen mit Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Das bereitgestellte Protokoll verwendet eine hepatische Zelllinie als Beispiel. Öffnen Sie während der Arbeit unter sterilen Bedingungen vorsichtig das Kryofläschchen, um den Überdruck abzulassen, und pipettieren Sie dann den Inhalt des Kryofläschchens in ein 10-Milliliter-Röhrchen, das mit neun Millilitern vorgewärmtem Williams'E-Medium bei 37 Grad Celsius gefüllt ist.

Die Lösung 10 Minuten lang bei 400 mal g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern proprietärem Auftaumedium, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt und mit Glutamin ergänzt wird. Nach dem Zählen der lebensfähigen Zellen, wie in dem Textprotokoll beschrieben, säen Sie die Zellen in eine mit Kollagen beschichtete 24-Well-Platte mit einer Dichte von 60.000 lebensfähigen Zellen pro Vertiefung und einem Endvolumen von 0,5 Millilitern Auftaumedium.

Nach einigen Tagen in Kultur bilden die Zellen eine subkonfluente Trabekelstruktur. Die optimale Stoffwechselaktivität wird typischerweise zwischen dem siebten und zehnten Tag beobachtet und ist am vierten Tag am geringsten. Zur Herstellung der differenzierten Atemwegsepithelkulturen ist kommerziell erhältliches, vollständig differenziertes primäres Atemwegsepithel zu verwenden, das an der Luft-Flüssig-Grenzfläche auf einem Insert gezüchtet wurde.

Lösen Sie den Zelleinsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette von der Agarose-Matrix und übertragen Sie ihn auf die neue Platte, die mit 700 Mikrolitern proprietärem Kulturmedium vorgeladen ist. Beurteilen Sie die Integrität des Atemwegsgewebes mit Methoden, auf die im Textprotokoll verwiesen wird, wie z. B. transepithelialer Widerstand oder Zilienschlagfrequenz. Vor dem Experiment werden zwei Serien von Zellinserts für die Atemwegszellen und Vertiefungen für die Leberzellen mit mindestens drei Replikaten vorbereitet.

Verwenden Sie eine Serie nur für das Hemmexperiment und die andere nur für die Stoffwechselsonde. Bereiten Sie eine dritte Reihe von Zellen als Medienleerzeichen-Steuerelement vor. Ersetzen Sie am Tag des Experiments das Zellkulturmedium durch 450 Mikroliter frisches Medium.

Geben Sie 50 Mikroliter Medium, das den 10x CYP-Inhibitor enthält, zu der für das Inhibitionsexperiment vorbereiteten Zellserie und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Ersetzen Sie als Nächstes das Medium in der Inhibitionsreihe durch 450 Mikroliter frisches Medium und fügen Sie 50 Mikroliter Medium hinzu, das sowohl den 10x CYP-Inhibitor als auch das 10x Sondensubstrat enthält. Geben Sie 50 Mikroliter Medium mit dem 10x-Sondensubstrat zu den anderen Zellen und geben Sie dann eine entsprechende Menge an in Medium verdünntem Vehikel zu den Blindzellensteuerungen.

Nachdem Sie die Zellen null bis fünf Minuten lang für den Zeitpunkt eins, null Hintergrundkontrolle, inkubiert haben, sammeln Sie das Medium in separaten markierten Röhrchen und frieren Sie das Medium für die zukünftige Verarbeitung ein. Inkubieren Sie dann zum Zeitpunkt zwei Zellen für 16 Stunden im Zellinkubator. Am Ende der Inkubationszeit wird das Medium mit der gleichen Methode zur Quantifizierung des Stoffwechselprodukts entnommen.

Übertragen Sie 250 Mikroliter Inkubationsmedium in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und fügen Sie die interne Standard-Stammlösung von 4-Methylumbelliferon hinzu, um eine Endkonzentration von 100 Nanomolar zu erreichen. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums auf 4,5 bis 5,0 ein, indem Sie jeweils einen molaren HCl und jeweils einen Mikroliter hinzufügen. Überprüfen Sie den pH-Wert, indem Sie zwei bis 10 Mikroliter Medium auf einen pH-Streifen pipettieren und dann 150 Einheiten Betaglucuronidase-Arylsulfatase aus Helix pamatia hinzufügen.

Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 250 Mikroliter kaltes Methanol hinzufügen. Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einer Vakuumzentrifuge bei 45 Grad Celsius. Rekonstituieren Sie die Proben mit 500 Mikrolitern einer 30%igen Acetonitril-Wasser-Lösung.

Um eine massenspektrometrische Quantifizierung durchzuführen, geben Sie 250 Mikroliter jedes seriellen Verdünnungsstandards in ein bernsteinfarbenes Ultra-Performance-Flüssigchromatographie-Glasfläschchen zur Injektion in den UPLC-MS-Autosampler. Geben Sie die Testproben ebenfalls in braune UPLC-Fläschchen und legen Sie sie in den UPLC-Autosampler. Nachdem Sie alle Fläschchen randomisiert haben, führen Sie die UPLC-MS mit den im Textprotokoll beschriebenen Einstellungen aus, abhängig von der spezifischen Sonde, die quantifiziert werden soll.

Verwenden Sie das Werkzeug Quantifizieren, Quantifizierungsmethode erstellen in den Massenspektrometer-Quantifizierungswerkzeugen, um die Kalibrierkurve aus dem erfassten synthetischen Standard und dem internen Standard zu generieren, und verwenden Sie dann den Quantifizierungsassistenten, um die Probencharge und die Proben auszuwählen, die quantifiziert werden sollen, und führen Sie die Quantifizierungsmethode aus. Um CYP1A1, CYP1B1 zu induzieren, verwenden Sie das Plattenlayout, das im Textprotokoll zu finden ist. Die für die Induktion vorgesehenen Zellen werden mit einer Endkonzentration von 10 nanomolaren TCDD in Medium für einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert.

Entfernen Sie nach dieser Zeit das Medium, spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS aus und fügen Sie etwas frisches Medium hinzu. Vor der Inkubation der Zellen mit der luminogenen Reportersonde wird die angegebene Untergruppe der induzierten Zellen 30 Minuten lang mit dem CYP1A1, CYP1B1-Inhibitor in Medium vorinkubiert. Das luminogene Propbe, Luciferin-6'-Chlorethylether, wird in einer Endkonzentration von 50 μmolar zu den nicht induzierten, induzierten und induzierten Plus-Inhibitorzellen gegeben.

Vier Stunden inkubieren und dann 25 Mikroliter Nährmedium auf eine weiße, undurchsichtige 96-Well-Platte geben und 25 Mikroliter des vom Hersteller bereitgestellten Luciferin-Nachweisreagenzes hinzufügen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur ist die Platte sofort mit einem Luminometer abzulesen. Die relative Lumineszenz, die durch die Dealkylierung von Luciferin-6'-Chlorethylether erzeugt wird, der durch CYP1A1, CYP1B1 katalysiert wird, wird hier vorgestellt.

Das Beispiel zeigt keine Enzymaktivität ohne TCDD-Induktion. Nach TCDD-Induktion wird die Aktivität von CYP1A1 und CYP1B1 sowohl in den hepatischen als auch in den respiratorischen Zelltypen beobachtet. Schließlich reduziert oder eliminiert die Zugabe des CYP1A1, CYP1B1-Inhibitors alpha-Naphthoflavon die CYP-Aktivität.

Um die Aktivität von CYP2A6, 2A13 in Leber- und Atemwegszelltypen zu bestimmen, wurde die Menge an 7-Hydroxycumarin, die durch Hydroxylierung von Cumarin durch das Enzym produziert wird, mittels UPLC LC-MS gemessen. Bei null Minuten Inkubation mit Cumarin wird nur der Hintergrund nachgewiesen. Nach 16 Stunden wird eine Hydroxylierung von Cumarin mit der Bildung von 7-Hydroxycumarin in den beiden Zelltypen beobachtet.

Schließlich verhindert die Zugabe des CYP2A,2A13-Inhibitors die Bildung von 7-Hydroxycumarin. Einmal gemeistert, können die Sondeninkubations- und Quantifizierungsteile dieser Technik in wenigen Stunden bis in den meisten Fällen bis zu einem Tag durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene Phase-1-Metabolismus-Assays mit verschiedenen Zelltypen durchführen und die Spezifität des Enzyms je nach Bedarf durch Hemmung und/oder Induktion bestätigen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass verschiedene Zelltypen längere Inkubationszeiten erfordern können, und es ist wichtig, einen Zelltyp einzubeziehen, der als Positivkontrolle verwendet werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit TCDD extrem gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. vollständige persönliche Schutzausrüstung. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Verwendung geeigneter In-vitro-Modelle für die präklinische Bewertung neuartiger Arzneimittel und die Risikobewertung von Chemikalien und Inhaltsstoffen, die in Verbraucherprodukten verwendet werden.