Name: Massenspektrometrie und luminogenes-basierte Ansätze zur Charakterisierung von Phase I Metabolic Competency von In Vitro Zellkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Lernen Sie die Bestimmung der Cytochrom-P450-Aktivität in kultivierten Zellen mittels Massenspektrometrie und luminogener Sonden. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Bewertungen der Phase-I-Metabolisierung für Arzneimittelentwicklung und Toxikologie.

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Die Autoren danken Epithelix Sarl und Biopredic International für die Bereitstellung der Mikroaufnahmen der Atemwegszellen und Leberzellen und Neil Smith für die Abbildung, die das experimentelle Verfahren veranschaulicht.

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AB und EM waren Angestellte von British American Tobacco zum Zeitpunkt dieses Manuskript geschrieben wurde. Die Arbeit in diesem Manuskript beschrieben wurde von British American Tobacco finanziert und Publikationsgebühren für diese Video-Artikel wurden von British American Tobacco bezahlt.

Viele standardisierten toxikologischen Testsysteme verwenden Engineered Bakterien, Zelllinien oder Embryonalzellen Derzeit , die nicht repräsentativ für den normalen menschlichen Stoffwechsel 1 sind. Dies kann zu einem ungenauen Vorhersage der potentiellen toxischen Aktivität eines chemischen oder Medizin führen. Innovative in - vitro - Modelle, wie etwa 3D - Zellkulturen und Organ auf einem Chip, werden in einem Versuch entwickelt , um die normale Morphologie und die metabolische Aktivität von menschlichen Geweben 21, 22, 23 besser zu replizieren. Metabolic Kompetenz ist ein Kriterium, das verwendet werden kann, zu entziffern, welche Modelle am besten geeignet sind für die toxikologische Bewertung und Drogen Biotransformation Studien. Das Protokoll wir in diesem Papier skizziert haben, ist entworfen, um die Aktivität von CYP-Enzyme unter Verwendung von lebenden Zellen zu messen. Es ist flexibel und kann für verschiedene Zellsysteme in 2D- oder 3D-cultur verwendet werdenes bietet die Möglichkeit, entweder eine luminogener Sonden- oder einen Massenspektrometrie-basierten Ansatz zu verwenden. Beiden Verfahren sind empfindlich genug, um Nanogramm-Mengen von Materialien zu erkennen und nur eine kleine Anzahl von Zellen in einem Multi-Well-Format gezüchtet erfordern. Sie können auch auf spheroid oder Zellen in komplexen Matrices gewachsen angewendet werden. Die Auswahl des Sondensubstrat ist natürlich ein wichtiges Element des Protokolls. Die Spezifität des Assays beruht auf der selektiven Sonde des CYP Enzym und einer weiteren Schicht aus Sicherung sein kann durch die Verwendung eines selektiven Inhibitors CYP erhalten werden. Die Substrate und Inhibitoren in diesem Dokument aufgeführt sind nur einige Beispiele, aber andere können in der Literatur gefunden werden. Es ist wichtig, mehrere Inkubationszeiten zu berücksichtigen, wenn mit einem neuen Zelltyp als negatives CYP Aktivität Ergebnis arbeiten könnte durch das Enzym auf einem niedrigen Niveau exprimiert werden. Die Zugabe eines Zelltypen, der als positive Kontrolle verwendet werden kann, wird empfohlen, dass ein, um sicherzustellen,negatives Ergebnis ein technisches Problem nicht verknüpft und mit jeder Fehlersuche zu helfen. Primäre Leberzellen metabolisch kompetent sind und können als Kontrolle verwendet werden, beispielsweise primären Hepatocyten in Suspension ist sehr einfach zu verwenden, aber ihre Lebensfähigkeit ist zeitlich begrenzt. Leberzelllinien sind mögliche Alternativen , die relativ einfach sind , wie in diesem Protokoll zu verwenden, aber einige sind besser als andere in Bezug auf die metabolische Aktivität 6, 21. Da der Test nicht zerstörend ist, es sei denn , Gesamtprotein quantitativ bestimmt wird, ist es möglich , die CYP - Aktivität im Laufe der Zeit in Langzeitstudien 20 zu folgen. Dies ist ein wichtiger Punkt, da einige Zellen variable CYP Aktivität im Laufe der Zeit in der Kultur haben. Ein negatives Ergebnis könnte mit dem Mangel an Konfluenz, Fortschritten bei der Differenzierung oder Dedifferenzierung in vitro in Verbindung gebracht werden. In diesem Fall ist der Ansatz, halb quantitative, da die Daten nicht von der Gesamtmenge an Protein in jeder Zellkultur normiert sind. Es ist nicht immer möglich oder empfohlen, das Gewebe nach der Messung der CYP Aktivität als Exposition gegenüber Sonden, Inhibitoren oder Induktoren zur Wiederverwendung kann eine toxische Wirkung auf dem Gewebe hat, wie der Fall für TCDD ist. Zellfraktionen wie Mikros könnte auch die CYP Aktivität eines gegebenen Zelltyp zu charakterisieren, verwendet werden. Mikrosomenzubereitungen erfordern jedoch eine Menge von Zellmaterial, die Zugabe von ausreichenden Cofaktoren und Puffer, um sicherzustellen, dass die Enzyme aktiv bleiben. lebende Zellen unter Verwendung entfällt den schwierigen Mikrosvorbereitungsschritt und ausarbeitet, welche Puffer und Cofaktoren am besten funktionieren. Als allgemeine Empfehlung ist es eine bewährte Methode, das Expressionsprofil von CYP in Zellkulturen weiter zu charakterisieren, um sicherzustellen, dass sie die enzymatische Aktivität entspricht. Diese zusätzliche Ebene der Überprüfung wird empfohlen, da die Stoffwechselsonden sind nicht ENTIauf eine einzelne CYP verlassen spezifischen und erhöhte Sicherheit gibt, dass die gemessene metabolische Aktivität durch das entsprechende Enzym-Expression angepasst ist. Da CYPs Membranproteine sind , sind sie relativ schwer für Western - Blots herzustellen, deshalb quantitative RT-PCR der bevorzugte Ansatz wurde 20 diese Enzyme profilieren. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll, ein Verfahren zum Test CYP-Enzymaktivität beschreibt, die nur eine Familie von Stoffwechselenzymen dar, wenn auch ein wichtiger. Die Flexibilität eines Massenspektrometrie-Ansatz ermöglicht die Entwicklung von Erfassungsmethoden für andere metabolische Transformationen von Sondensubstraten. diejenigen haben werden jedoch einen nach dem anderen entwickelt und es gibt derzeit weniger bekannte spezifische Sonden und selektive Inhibitoren für andere metabolische Enzymfamilien. Diese Lücke sollte für eine umfassende Beurteilung der metabolischen Kompetenz der in - vitro - Zell Syste zu ermöglichen , werden angesprochenFrau.

Xenobiotischen Stoffwechsel ist der Prozess , durch die Chemikalien körperfremd durch die Zugabe von hydrophilen Gruppen modifiziert sind und Konjugate ihre Ausscheidung 1 zu erleichtern. Typischerweise ist der Metabolismus von Xenobiotika ein zweistufiges Verfahren mit der Phase I mit der Zugabe von einem oder mehreren Hydroxylgruppen 1, 2 hauptsächlich aus einer Oxidations bestehen. In Phase II werden die Hydroxylgruppen verwendet , wie für ein hydrophiles Konjugat wie Glucuronid Akzeptoren oder eine Sulfateinheit 1, 2. Wenn eine Akzeptor-Gruppe auf den Molekülen bereits vorhanden ist, kann die Konjugation Schritt unabhängig von Stoffwechsel Phase I geschehen. Jede Reaktion wird durch eine spezifische Gruppe von Enzymen durchgeführt, beispielsweise CYPs (Cytochrom P450), die die Hydroxylierung (Abbildung 1) und Dealkylierung von chemischen Substrate 3 katalysieren. Conjugation wird durch Sulfotransferasen katalysiert, UDP-Glucuronosyltransferasen (Abbildung 1), Glutathion-S-Transferasen und N-Acetyltransferasen 4. Jedes Gewebe und Organ wird ein spezifisches metabolisches Enzym Expressionsprofil aufweisen, mit der Leber die meisten dieser Proteine ​​exprimieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Abbildung 1: Beispiel für Phase I und Phase II Metabolismus für Cumarin. CYP2A6 / CYP2A13 die 7-Hydroxylierung von Cumarin katalysieren. 7-Hydroxycumarin wird von Phase-II-Enzyme zu einer UGTs Glucuronidteil konjugiert mit UGT1A6 und UGT1A9 der höchsten Aktivität zeigen. den Metabolismus von Xenobiotika zu verstehen, ist bei der Beurteilung der Arzneimittelsicherheit und Risikobewertung von Chemikalien aus zwei Gründen entscheidend: die Reaktionskinetik wird bestimmen, wie lange ein Medikament oder Chemikalie im Körper in einer aktiven oder inaktiven Form b bleibenefore Ausscheidung; und die Ausgangsverbindung kann durch metabolische Enzyme zu einer reaktiveren, instabiler und toxischen Spezies modifiziert werden. Solche Reaktionen auch als „Bioaktivierung“ bekannt sind , vor allem von der Phase I CYP - Enzym angetrieben , sondern auch von selteneren Fällen von Phase II Konjugation 5. Auf dieser Grundlage ist die Fähigkeit eines in - vitro - Modell , um genau das Risiko mit einem Medikament oder einer Chemikalie ist stark abhängig von der Stoffwechsel Kompetenz des Zellsystems assoziiert vorherzusagen. Zelllinien , die von erkranktem Gewebe oder aus der Transformation von normalen Zellen verlieren oft Teil , wenn nicht alle des metabolischen Enzymprofil repräsentativ für ihre Ursprungsgewebe 6. Die Aufrechterhaltung des normalen Stoffwechselenzymprofiles erscheint besser in primären Zellkulturen (zumindest in kurzen Zeitkulturen) und wird weiter verbessert , wenn das Gewebe in einer Matrix kultiviert wird , so dass sie ihre 3D - Struktur 1 zu halten. Daher ist die charrakterisierung der metabolischen Kompetenz eines in vitro - Zellsystem ist eine wichtige Vorstufe für die Entscheidung in Bezug auf das Führungszellenmodell geeignet ist , chemische Sicherheitsbewertungen durchzuführen. In diesem Papier präsentieren wir ein Protokoll , um die Aktivität und Expression von Phase - I - CYP - Enzymen in vitro mit Beispielen ihrer Anwendung mit einer hepatischen Zelllinie 7 und 3D primären Lungenzellkulturen 8 zu profilieren. CYP spezifische Substrate, deren Stoffwechselprodukte und Inhibitor-Kontrollen werden zusammen mit Masse spectrometry- und luminogene basierten Quantifizierungsmethoden beschrieben. Da einige CYPs induzierbaren sind und andere sind konstitutive, Beispiele werden auch für diese beiden Szenarien gegeben werden.

<table><tbody><tr><td><stark>Reagenz & Zellen</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; m Spritzenfilter</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-Phenylpentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-Hydroxybupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-Hydroxychlorzoxazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-Ethoxycumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-Hydroxycumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-Methoxypsoralen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Naphthoflavon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCA Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-Glucuronidase/Arylsulfatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>Chlorzoxason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen</td><td>Cell Systems</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Cumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>Disulfiram</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>Fluvoxamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (Glutamin-Ergänzung)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG Stoffwechsel-Ergänzung</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG auftauen Medienergänzung</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir Atemwegszellen</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir Atemwegszellen Erhaltungsmedien</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &mu; m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro; m 2,1 x 50 mm</td><td>Waters</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS Software</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Analyst 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

massenspektrometrie und luminogenes-basierte ansätze zur charakterisierung von phase i metabolic competency von<em&gt; in vitro</em&gt; zellkulturen

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Xenobiotika metabolisierenden Enzyme spielen eine Schlüsselfunktion bei der Biotransformation von Arzneimitteln und Giften durch funktionelle Gruppen hinzufügen, die Löslichkeit zu erhöhen und die Ausscheidung erleichtern. In einigen Fällen führen diese strukturellen Änderungen an der Bildung neuer toxische Produkte. Um Tierversuche zu verringern, kann unter Verwendung von chemischem Risiko metabolisch kompetente Zellen beurteilt werden. Die Expression von Stoffwechselenzymen, ist jedoch nicht über längere Zeit stabil in viele in vitro primären Kultursystemen und ist oft teilweise oder nicht vorhanden in Zelllinien. Daher soll die Studie von Arzneimitteln, Additiven und Umweltschadstoffe Stoffwechsel in vitro idealerweise in Zellsystemen durchgeführt werden , in denen die Stoffwechselaktivität gekennzeichnet ist. Wir erklären hier einen Ansatz mit der Aktivität einer Klasse von Stoffwechselenzymen zu messen (Human Phase I) in 2D-Zelllinien und Primär 3D-Kulturen unter Verwendung von chemischen Sonden und deren Stoffwechselprodukte quantifizierbare von UPLC-Massenspektrometrie undLuminometrie. Das Verfahren kann die Stoffwechselaktivität in Zelllinien und primären Zellen, die aus einer Vielzahl von Geweben zu testen abgeleitet implementiert werden.

Beispiele für Stoffwechselaktivität , gemessen für zwei Paare von CYPs (CYP1A1 / 1B1 und CYP2A6 / 2A13) in den Atemweg Zellkulturen aus drei verschiedenen Spendern (Atemweg M360, M370, M417) und die Leberzelllinie (Hep - Linie) sind in Abbildung 6 20. CYP - Aktivität gemessen durch Luminometrie 6A zeigt die relative Lumineszenz von der CYP1A1 erzeugt / 1B1 O-Dealkylierung Aktivität von Luc-CEE (Luciferin 6&#39;-Chlorethylether) in Atemwegszellen (3 Spender) und Leberzellen mit und ohne TCDD Induktion. CYP1A1 / 1B1 sind stark induzierbare Enzyme und sind in der Regel nicht zu einem konstitutiven Niveau in den meisten Geweben exprimiert wird. Wie in 6A zu sehen ist, kein luminogene Signal erkannt wird , wenn die Zellen nicht induziert. Wenn beiden Zelltypen sind mit TCDD vorinkubiert, einem starken CYP1A1 / 1B1 Induktor, eine Markeed luminogene Signal verglichen wird detektiert die Steuerung (6A). Dies zeigt an, daß die Luc-CEE-Sonde wird zur Freisetzung der Luciferins Einheit führender metabolisiert worden, die anschließend quantifizieren. Insgesamt ist die Aktivität von der TCDD Leberzelllinie behandelt ist geringer als bei den Atemwegszellen, auch nach Gesamtprotein Normalisierung. Dies ist nicht ungewöhnlich, da Zelllinien sind in der Regel weniger als metabolisch aktiver als Primärzellen. Die Zugabe von α-Naphtoflavon hat eine klare hemmende Wirkung auf CYP1A1 / 1B1-Aktivität in allen Zelltypen, die weiter die CYP-Abhängigkeit von Luc-CEE Stoffwechsel bestätigt. Die Quantifizierung von CYP450 Metaboliten UPLC-MS 6B veranschaulicht die Quantifizierung der CYP2A6 / 2A13 Aktivität in Atemwegszellen aus 3 Donoren (Airway M343, M345, M347) und Leberzellen (Hep Linie) nach Inkubation mit Cumarin in Gegenwart und Abwesenheit des INHIBITOR 8-Methoxypsoralen. Die Daten werden für Gesamtprotein normalisiert. In der 0 min Cumarin Inkubation Kontrolle, keine 7-Hydroxycumarin detektiert wird (6B). CYP2A6 / 2A13 werden konstitutiv in bestimmten Geweben exprimiert wird und somit nach 16 h Inkubation mit Cumarin Bildung von 7-Hydroxycumarin wird in den verschiedenen getesteten Zelltypen, auch ohne Induktion nachgewiesen. Wenn 8-Methoxypsoralen ist ein CYP2A Inhibitor zugegeben (6B), wird die Bildung von 7-Hydroxycumarin erheblich reduziert. Es sollte der CYP-Inhibitor in der Gegenwart angemerkt werden, es normal ist, noch eine gewisse Restaktivität zu erfassen, wie die Hemmung selten vollständig ist, und da andere CYPs könnte auch das Substrat erkennen können, aber es weit weniger effizient zu verarbeiten. Es kann auch beobachtet werden, dass die aufgezeichnete metabolische Aktivität unterschiedlich zwischen Spender sein kann, wenn unter Verwendung von Primärzellen, wie es für CYP2A6 in Atemwegszellen sichtbar ist(6B). Dies wird voraussichtlich als CYP Aktivität haftet jeden Genotyp des Spenders und Polymorphismen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Abbildung 6: Aktivitätstest Ergebnis für CYP1A1 / 1B1 Aktivität (A) und CYP2A6 / 2A13 Aktivität (B) in der Leberzelllinie und in drei Airway Zellspendern (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE Dealkylierung Aktivität wird mit und ohne Induktion von CYP1A1 / 1B1 von TCDD gezeigt. α-Naphthoflavon wurde als CYP1A1 / 1B1 Inhibitor verwendet. Aktivität ist als relative Lumineszenz-Einheiten (RLU) normalisiert, indem die Inkubationszeit in Minuten (min) und Gesamtprotein (mg) ausgedrückt. (B) CYP2A6 / 2A13 nicht Induktion benötigen , da sie konstitutiv exprimiert werden. Cumarin 7-Hydroxylierung Aktivität in pmol / min / mg Proteine ​​wird zu verschiedenen Zeitpunkten mit und ohne den Inhibitor 8-methoxypsor gezeigtenalen. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert von drei unabhängigen Messungen mit Standardabweichungen vom Mittelwert dargestellt. Diese Zahl wurde von Baxter 20 modifiziert. Supplemental Tabelle 1: UPLC und Massenspektrometer - Einstellungen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Metabolic Kompetenz von in vitro - Systemen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Biotransformation und Disposition von Drogen und Giften. In diesem Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Referenzstoffwechselsonden Phase I in Zellkulturen des Stoffwechsel zu bewerten.

Massenspektrometrie und luminogenes-basierte Ansätze zur Charakterisierung von Phase I Metabolic Competency von<em&gt; In Vitro</em&gt; Zellkulturen

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität von Cytochrom-P450-Enzymen, oder CYPs, in Kulturzellen zu bestimmen. CYPs sind Schlüsselenzyme, die an dem Stoffwechsel von Arzneimitteln und Toxinen beteiligt sind, und ihre Expression wird in vitro oft nicht aufrechterhalten. Die normale Expression von CYP-Enzymen geht häufig verloren, wenn Zellen in vitro kultiviert werden.Daher sind viele In-vitro-Modelle möglicherweise in ihrer Aussagekraft für das Verständnis des Metabolismus von Arzneimitteln und Toxinen eingeschränkt. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in ihrer Einfachheit bei der Bewertung der CYP-Aktivität in kultivierten Zellen. Unter Verwendung von Probensubstraten und Inhibitoren werden verschiedene Quantifizierungsplattformen vorgestellt, einschließlich der Massenspektrometrie.Beginnen Sie damit, kryogene Gefäße mit Zellen gemäß der schriftlichen Anleitung zu beschaffen. Die vorliegende Anleitung verwendet eine hepatische Zelllinie als Beispiel. Unter sterilen Bedingungen öffnen Sie das kryogene Gefäß vorsichtig, um überschüssigen Druck abzulassen, und pipettieren Sie anschließend den Inhalt des kryogenen Gefäßes in ein 10-Milliliter-Röhrchen, das neun Milliliter vorgewärmtes Williams’E-Medium bei 37 Grad Celsius enthält.Zentrifugieren Sie die Lösung 10 Minuten bei 400 × g und Raumtemperatur. Nach dem Entsorgen des Überstandes resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter eigenem Auftaumedium, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt und mit Glutamin ergänzt wurde. Nach der Bestimmung der lebensfähigen Zellen gemäß der im Text beschriebenen Protokollanleitung säen Sie die Zellen in eine 24-Loch-Platte mit Kollagen-Beschichtung mit einer Dichte von 60.000 lebensfähigen Zellen pro Loch und einem Endvolumen von 0,5 Milliliter Auftaumedium aus.Nach einigen Tagen in Kultur bilden die Zellen eine subkonfluente trabekuläre Struktur. Die optimale Stoffwechselaktivität wird typischerweise zwischen Tag sieben und zehn beobachtet und ist am niedrigsten am Tag vier. Um differenzierte Atemwegsepithelkulturen vorzubereiten, verwenden Sie kommerziell erhältliches, vollständig differenziertes primäres Atemwegsepithel, das an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche auf einem Insert gezüchtet wurde.Unter Verwendung steriler Pinzette das Zellinsert vorsichtig aus der Agarose-Matrix lösen und in die neue Platte überführen, die zuvor mit 700 Mikrolitern des proprietären Kulturmediums beladen wurde. Beurteilen Sie die Integrität des Atemwegsgewebes mit Methoden, die im textlichen Protokoll genannt sind, wie beispielsweise dem transepithelialen Widerstand oder der Flimmerhärchen-Schlagfrequenz. Vor dem Experiment zwei Serien von Zellinserts für die Atemwegszellen sowie Gefäße für die hepatischen Zellen mit jeweils mindestens drei Wiederholungen vorbereiten.Verwenden Sie eine Serie für das Hemmungsexperiment und die andere für den metabolischen Probe allein. Bereiten Sie eine dritte Zellserie als Medium-Blindkontrolle vor. Ersetzen Sie am Tag des Experiments das Zellkulturmedium durch 450 µL frisches Medium.Fügen Sie 50 µL Medium, das den 10x CYP-Hemmer enthält, der Reihe von Zellen hinzu, die für das Hemmexperiment vorbereitet wurden, und inkubieren Sie diese 30 Minuten vorab. Ersetzen Sie anschließend das Medium in der Hemmreihe durch 450 µL frisches Medium und geben Sie 50 µL Medium hinzu, das sowohl den 10x CYP-Hemmer als auch das 10x Sonden-Substrat enthält. Geben Sie 50 µL Medium mit dem 10x Sonden-Substrat zu den anderen Zellen hinzu und fügen Sie dann eine äquivalente Menge des Fahrzeugmittels, das in Medium verdünnt wurde, den leeren Zellkontrollen hinzu.Nach der Inkubation der Zellen für null bis fünf Minuten für den Zeitpunkt eins, null Hintergrundkontrolle, sammeln Sie das Medium in separaten beschrifteten Röhrchen und frieren Sie das Medium für die spätere Verarbeitung ein. Inkubieren Sie anschließend die Zellen für den Zeitpunkt zwei 16 Stunden im Zellinkubator. Am Ende der Inkubationszeit sammeln Sie das Medium mit derselben Methode zur Quantifizierung des Stoffwechselprodukts.Überführen Sie 250 Mikroliter Inkubationsmedium in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und geben Sie die Stammlösung des internen Standards 4-Methylumbelliferon hinzu, um eine Endkonzentration von 100 Nanomolar zu erreichen. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums durch Zugabe von einmolarer HCl, jeweils ein Mikroliter, auf einen Wert zwischen 4,5 und 5,0 ein. Überprüfen Sie den pH-Wert, indem Sie zwei bis 10 Mikroliter Medium auf einen pH-Teststreifen pipettieren, und geben Sie anschließend 150 Einheiten Betaglucuronidase-Arylsulfatase aus Helix pomatia hinzu.Nach einer Inkubation von einer Stunde bei 37 Grad Celsius stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 250 Mikroliter kaltem Methanol. Verdampfen Sie das Lösungsmittel mittels einer Vakuumzentrifuge bei 45 Grad Celsius. Lösen Sie die Proben erneut in 500 Mikroliter einer Lösung aus 30 % Acetonitril in Wasser auf.Um eine massenspektrometrische Quantifizierung durchzuführen, geben Sie 250 Mikroliter jedes seriellen Verdünnungsstandards in ein braunes Glasvial für die Ultra-Leistungs-Flüssigkeitschromatographie, das für die Injektion in den UPLC-MS-Autosampler bestimmt ist. Geben Sie außerdem die Testproben in braune UPLC-Vials und stellen Sie diese in den UPLC-Autosampler. Nachdem alle Vials randomisiert wurden, führen Sie die UPLC-MS-Analyse mit den im Textprotokoll angegebenen Einstellungen durch, abhängig von der spezifischen zu quantifizierenden Sonde.Verwenden Sie das Werkzeug „Quantitate, Build Quantitation Method“ in den Quantifizierungstools des Massenspektrometers, um die Kalibrierungskurve aus den erfassten synthetischen Standards und internen Standards zu erstellen. Verwenden Sie anschließend den Quantifizierungs-Assistenten (Quantitation Wizard), um den Proben-Block und die zu quantifizierenden Proben auszuwählen und die Quantifizierungsmethode auszuführen. Zur Induktion von CYP1A1 und CYP1B1 verwenden Sie das in der Textanleitung angegebene Plattenlayout. Inkubieren Sie die für die Induktion vorgesehenen Zellen mit einer Endkonzentration von 10 Nanomolar TCDD im Medium für einen Zeitraum von 72 Stunden.Nach diesem Zeitraum das Medium entfernen, die Vertiefungen dreimal mit PBS spülen und frisches Medium hinzufügen. Vor der Inkubation der Zellen mit der lumineszenzgebenden Reportersonde die festgelegte Teilmenge der induzierten Zellen 30 Minuten lang mit dem CYP1A1-, CYP1B1-Inhibitor im Medium vorinkubieren. Die lumineszenzgebende Sonde, Luciferin-6'-chloroethyläther, in einer Endkonzentration von 50 µM den nicht induzierten, induzierten sowie den induzierten Zellen mit Inhibitor hinzufügen.Die Probe vier Stunden inkubieren und anschließend 25 Mikroliter Kulturmedium in eine weiße, opake 96-Loch-Platte überführen sowie 25 Mikroliter Luciferin-Detektionsreagenz, das vom Hersteller bereitgestellt wird, hinzufügen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Platte unverzüglich mit einem Luminometer auslesen. Die relative Lumineszenz, die durch die Dealkylierung von Luciferin-6'-Chloräthylether entsteht und durch CYP1A1, CYP1B1 katalysiert wird, ist hier dargestellt. Das Beispiel zeigt keine Enzymaktivität in Abwesenheit einer TCDD-Induktion. Nach der TCDD-Induktion wird die Aktivität von CYP1A1, CYP1B1 in beiden Zelltypen – hepatisch und respiratorisch – beobachtet. Schließlich verringert oder eliminiert die Zugabe des CYP1A1-, CYP1B1-Inhibitors Alpha-Naphthoflavon die CYP-Aktivität.Um die Aktivität von CYP2A6 und 2A13 in hepatischen und Atemwegszelltypen zu bewerten, wurde die Menge an 7-Hydroxycumarin, die durch Hydroxylierung von Cumarin durch das Enzym entsteht, mittels UPLC-LC-MS gemessen. Bei einer Inkubationszeit von null Minuten mit Cumarin wird nur Hintergrundsignal detektiert. Nach 16 Stunden ist die Hydroxylierung von Cumarin mit der Bildung von 7-Hydroxycumarin in beiden Zelltypen nachweisbar.Schließlich verhindert die Zugabe des CYP2A- und 2A13-Inhibitors die Bildung von 7-Hydroxycumarin. Sobald die Methode beherrscht ist, können die Probeinkubation und die Quantifizierung in den meisten Fällen innerhalb weniger Stunden bis zu einem Tag durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man verschiedene Phase-I-Stoffwechseltests unter Verwendung unterschiedlicher Zelltypen durchführt und die Spezifität des Enzyms bei Bedarf mittels Hemmung und/oder Induktion bestätigt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass verschiedene Zelltypen möglicherweise längere Inkubationszeiten erfordern und es unerlässlich ist, einen Zelltyp einzuschließen, der als positiver Kontrollansatz dienen kann. Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit TCDD äußerst gefährlich sein kann und stets Vorsichtsmaßnahmen wie die vollständige persönliche Schutzausrüstung getroffen werden müssen, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Die Bedeutung dieser Technik liegt in der Nutzung geeigneter in-vitro-Modelle für die präklinische Bewertung neuartiger Arzneimittel sowie für die Risikobewertung von Chemikalien und Inhaltsstoffen, die in Verbraucherprodukten verwendet werden.

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Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Wir beschreiben Schritte, mit denen schnell in Situ Probenahme von einen kleinen Teil einer einzelnen Zelle mit hoher Präzision und minimalen Invasion mit Kapillar-basierten Mikro-Probenahme, chemische Charakterisierung einer Momentaufnahme der metabolischen Aktivität in zu erleichtern Embryonen mit einer speziell angefertigten Einzelzelle Kapillarelektrophorese und Massenspektrometrie-Plattform zu leben.

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Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.

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Die Protokolle beschreiben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methoden, gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Untersuchung von Stoffwechselreaktionen in komplexen lysatbasierten zellfreien Systemen.

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Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

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Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik-Studien: Kombiniertes Waschen, Abschrecken, Trocknen und Lagern von Zellen

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Massenspektrometrie und luminogenes-basierte Ansätze zur Charakterisierung von Phase I Metabolic Competency von In Vitro Zellkulturen (Video) | JoVE Journal

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