Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die enzymatische Aktivität von Proteinkinasen zu messen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Kinase-Signalfeld zu beantworten, z. B. wie aktiv eine Kinase oder Kinase-Mutante ist, wie spezifit sie ist und ob ihre Aktivität empfindlich auf verschiedene Zellbehandlungen reagiert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sowohl vielseitig als auch quantitativ ist.

Stippec, ein Forscher am Cobb Laboratory, der über umfangreiche Erfahrung mit diesem Assay verfügt, wird das Verfahren vorführen. Zu Beginn geben Sie zwei Mikroliter Antikörper von einem Milligramm pro Milliliter zu 200 Mikrolitern Zelllysaten und inkubieren eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter Schaukeln. Waschen Sie die Protein-A-Sepharose-Kügelchen zwei- bis dreimal durch Zugabe von Lysepuffer und drehen Sie dann 30 Sekunden bis eine Minute lang bei 5000 g bei vier Grad Celsius, entfernen Sie dann den Überstand mit einer Pipette und suspendieren Sie die Kügelchen wieder im Puffer.