Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, miRNAs in der Peritonealmembran der Ratte erfolgreich zu reinigen und nachzuweisen. Um diesen Eingriff zu beginnen, nach Inhalationsanästhesie mit 4% Isofluran. Sprühen Sie die Bauchhaut der Ratte mit 70%igem Ethanol ein und montieren Sie sie auf die Korkplatte auf den Rücken.

Machen Sie als nächstes mit einer Schere und Zange einen Längsschnitt in die Bauchhaut, die Muskeln und die Peritonealmembran des Tieres. Nehmen Sie die Peritonealmembran mit der Pinzette auf und machen Sie horizontale Schnitte an ihrem oberen Teil entlang des untersten Rippenknochens unter dem Zwerchfell. Und auf der Unterseite im seitlichen Bereich mit der chirurgischen Schere.

Nehmen Sie anschließend mit der chirurgischen Schere seitliche Längsschnitte vor, um die Peritonealmembran vom Körper zu entfernen. Waschen Sie es dann mit PPS in einer Petrischale. Schneiden Sie 20 Milligramm der Peritonealmembranprobe aus und schneiden Sie sie ab.

Geben Sie bei diesem Verfahren eine 20 Milligramm schwere Peritonealmembranprobe in einen Glashomogenisator. Und fügen Sie 700 Mikroliter Lysereagenz auf Phenol-Guanidin-Basis hinzu. Homogenisieren Sie danach die Peritonealmembranprobe auf Eis, indem Sie langsam einen Stößel auf die Probe drücken und drehen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrere Dutzend Mal, bis sich die Peritonealmembranprobe vollständig in dem auf Phenol-Guanidin basierenden Lysereagenz aufgelöst hat. Zur weiteren Homogenisierung überführen Sie das homogenisierte Lysat in ein Biopolymer-Zerkleinerungssystem in der Spin-Säule der Mikrozentrifuge in einem zwei Milliliter fassenden Sammelröhrchen. Dann zentrifugieren Sie es bei 14.000 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.

Übertragen Sie anschließend das homogenisierte Lysat in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 140 Mikroliter Chloroform zum homogenisierten Lysat und verschließen Sie das Röhrchen fest. Anschließend das Röhrchen 15 Sekunden lang durch Inversion mischen.

Inkubieren Sie die Probe anschließend zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie es anschließend bei 12.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 300 Mikroliter des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, ohne den Fällstoff zu stören.

Und fügen Sie 450 Mikroliter 100% Ethanol hinzu. Mischen Sie dann die Probe, indem Sie sie fünf Sekunden lang vortexen. Pipettieren Sie anschließend bis zu 700 Mikroliter der Probe in eine Spin-Säule auf Silikonmembranbasis, die in ein zwei Milliliter fassendes Sammelröhrchen gegeben wird, und schließen Sie die Kappe.

Dann zentrifugieren Sie es 15 Sekunden lang bei 15.000 mal G. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Durchfluss im Auffangröhrchen. Geben Sie dann 700 Mikroliter Waschpuffer 1 in die auf Silikonmembranen basierende Spin-Säule, um die Probe streng zu waschen und die Kappe zu schließen.

Zentrifugieren Sie es 15 Sekunden lang bei 15.000 mal G. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Durchfluss im Auffangröhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter Waschpuffer 2 in die Spin-Säule auf Basis der Kieselsäuremembran, um alle Spuren von Salz zu entfernen, und schließen Sie die Kappe.

Dann zentrifugieren Sie es 15 Sekunden lang bei 15.000 mal G. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Durchfluss und das Auffangröhrchen und wiederholen Sie diesen Vorgang erneut. Als nächstes zentrifugieren Sie die auf Kieselsäuremembranen basierende Spin-Säule erneut bei 15.000 Mal G für eine Minute.

Entsorgen Sie nach der Zentrifugation das Sammelröhrchen und den Durchfluss. Setzen Sie die Spin-Säule auf Basis von Kieselsäuremembranen in ein neues Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Sammelröhrchen ein. Füllen Sie dann 25 Mikroliter RNase freies Wasser auf die Säule und schließen Sie die Kappe.

Lassen Sie die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei 15.000 mal G. Übertragen Sie anschließend die 25-Mikroliter-Alouette mit der Gesamt-RNA in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie es vor der Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.

Bereiten Sie bei diesem Verfahren eine Mastermix-Lösung vor, die zwei Mikroliter einer 10-fachen Nukleinsäuremischung, zwei Mikroliter einer reversen Transkriptase-Mischung und vier Mikroliter einer 5-fachen Hispec-Puffer enthält, also insgesamt 8 Mikroliter pro Röhrchen. Geben Sie dann 8 Mikroliter der Mastermix-Lösung in jedes Röhrchen. Messen Sie die Menge der Gesamt-RNAs mit einem Spektralphotometer.

Geben Sie anschließend ein Mikrogramm der isolierten Gesamt-RNAs, die aus der Peritonealmembranprobe gereinigt wurden, in jedes Röhrchen. Geben Sie anschließend RNase-freies Wasser in jedes Röhrchen, um es auf insgesamt 20 Mikroliter zu bringen. Dann durch Pipettieren gründlich mischen und 15 Sekunden zentrifugieren.

Anschließend wird die Probe 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Dann inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Übertragen Sie die neu erzeugte cDNA in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie es 10-mal mit RNase-freiem Wasser.

Bereiten Sie bei diesem Verfahren einen Mastermix her, der 12 Komma fünf Mikroliter 2x PCR-Mastermix, zwei Komma fünf Mikroliter von fünf Mikromolaren jedes in nukleasefreiem Wasser gelösten miRNA-Primers und einen Komma zwei fünf Mikroliter 10x Universalprimer für jede Vertiefung enthält. Geben Sie 22 Komma fünf Mikroliter dieses Mastermixes in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Geben Sie dann zwei Komma fünf Mikroliter Template-cDNA in jede Vertiefung.

Versiegeln Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einem Stück Folie. Zentrifugieren Sie es dann 30 Sekunden lang bei 1.000 mal G. Um das PCR-Zyklusprogramm auszuführen, setzen Sie die Platte in das Echtzeit-PCR-Gerät ein.

Definieren Sie in der Echtzeit-PCR-Software die experimentellen Eigenschaften. Weisen Sie als Nächstes den Proben Namen zu und zielen Sie in jedem Well auf miRNAs ab. Geben Sie dann in der Echtzeit-PCR-Software ein Reaktionsvolumen von 20 Mikrolitern und die folgenden PCR-Zyklusbedingungen gemäß den Anweisungen ein.

Vorinkubation bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten. Und dann 40 Zyklen der Denaturierung bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden und Knien bei 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und Ausdehnung bei 70 Grad Celsius für 30 Sekunden. Basierend auf miRNA-Microarray-Screening wurde festgestellt, dass die Spiegel von sechs miRNAs in der Peritonealmembran von Peritonealfibrose-Ratten signifikant erhöht waren, verglichen mit denen bei Scheinratten und Kontrollratten, die QRTCPR verwendeten, gemäß dem in diesem Manuskript vorgestellten Protokoll.