Name: Zebrafisch In Situ Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Zebrafisch-Rückenmarkneuronen in situ für elektrophysiologische Aufzeichnungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung spinaler sensorischer und motorischer Neuronen bei Danio rerio.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (F32 NS059120 zu RLM und R01NS25217 und P30NS048154 zu ABR) unterstützt.

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die elektrische und morphologische Charakterisierung von sensorischen und motorischen Neuronen von Zebrabärbling Embryonen nach minimaler Zerlegung des Rückenmarks. Neurone bleibt für mindestens 1 h gesund, die Frist auf diesen Aufnahmen auferlegt. Neurone wurden unter Verwendung der Standard Gesamtzellkonfiguration aufgezeichnet, sowie von nukleierten Patches; Das letztere Verfahren minimiert Raum-clamp - Probleme , die eine detaillierte Untersuchung der biophysikalischen lon...

<html> George Streisinger Pionier bei der Verwendung von Danio rerio, das gemeinhin als Zebrabärbling bekannt, als Modellsystem für die genetische Analyse von Wirbel Entwicklung 10. Das Modell bietet mehrere Vorteile, einschließlich: (1) relativ einfach und kostengünstig Tierhaltung; (2) externe Befruchtung, die einen leichten Zugang zu Embryonen von den frühesten Entwicklungsstadien; und (3) ein transparentes Embryo ermöglicht direkte und wiederholte Beobachtungen von Zellen, Geweben und Organen, wie sie bilden. In den folgenden Jahrzehnten stiegen einige Fortschritte weiter die Leistung des Zebrabärbling-Modells. Insbesondere Vorwärts genetischen Screens und Sequenzierung des gesamten Genoms Bemühungen kritischen Schlüsselrollen bei der Identifizierung von Mutationen und Gene gespielt zu vielen Entwicklungsprozesse 11, 12, 13, 14,„&gt; 15, 16. Gateway - Klonierungsverfahren die Routineanwendung von transgenen erlaubt haben Ansätze 17, 18. Die jüngsten Fortschritte in der Genombearbeitung, beispielhaft dargestellt durch Transkriptionsaktivator-like (TALENS) und gruppierten regelmäßig voneinander beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -Cas9 Nukleasen, ermöglicht die gezielte Einführung von Mutationen sowie Knock-out und knock-in Ansätzen 19, 20, 21, 22. Combined, diese Methoden Zebrabärbling machen ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der genetischen Mechanismen , bestimmte Verhaltensweisen und mehrere menschliche Krankheiten zugrunde liegen 23, 24, 25, 26, 27. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung vonpsychische Regulierung und die Rolle der elektrischen Aktivität in neuronalen Entwicklung. Der Schwerpunkt liegt auf dem Rückenmark, für die das Modell Zebrabärbling mehr Vorteile bietet. Erstens ist es relativ einfach, Zebrabärbling an embryonalen und Larvenstadien zuzugreifen; Daher kann eine Rückenmarksfunktion während der Entwicklungsstadien untersuchen , die weniger Neuronen und einfachere Schaltungsanordnung 28, 29 haben. Darüber hinaus hat die Zebrabärbling Rückenmark eine vielfältige Gruppe von Neuronen, ähnlich wie bei anderen Wirbeltieren, als Faktoren , 30, 31, 32, 33, 34, 35 und durch charakteristische Unterscheidungsmuster der Transkription nachgewiesen. Die meisten Studien in Zebrabärbling, das die Mechanismen aufzudecken darauf abzielen, die die Funktion von Rückenmarksschaltungen zugrunde liegen, vor allemdiejenigen , die Fortbewegung, sind verständlicherweise konzentrieren sich auf Larvenstadien 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 unterstützen. Allerdings sind viele der Neuronen, die das Rücken Lokomotive Netzwerken initiieren ihre Differenzierung in frühen Embryonalstadium, ~ 9-10 h nach der Befruchtung (hpf) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 bilden. Im Hinblick darauf, das Verständnis, wie die morphologischen und elektrischen Eigenschaften von spinalen Neuronen entstehen und Wechsel zwischen den embryonalen und Larvenstadien ist wichtig für eine Marktpreisefürll Verständnis der lokomotorischen Schaltungsbildung und -funktion. Die Dissektion hier beschriebenen Methoden erlauben Patch-Clamp-Aufnahmen von spinalen Neuronen und haben an embryonalen Stadien (~ 17-48 HPF) und Larvenstadien (~ 3-7 Tage nach der Befruchtung [dpf]) erfolgreich angewandt worden. Dieser Ansatz begrenzt die Menge der Dissektion erforderlich, um Zugang zu den Neuronen von Interesse bereitzustellen. Das Protokoll unterscheidet mich von der Mehrzahl der anderen veröffentlichten Verfahren für in Tierarzt dieses Naht Leim aus Zebrabärbling spinalen Neuronen Aufzeichnung verwendet wird, sondern als ein feiner Wolframstift, den Embryo oder Larve auf die Aufzeichnungskammer zu befestigen. Die Verfügbarkeit von zwei unterschiedlichen Ansätzen (dh Naht Klebstoff gegenüber dem Wolframstift) für die Zebrabärblingembryonen oder Larven für elektrophysiologische Analyse Montage bietet Forscher mit alternativen Optionen ihre spezifischen experimentellen Ziele zu erreichen. Als erstes Verfahren für den Zugriff auf und die Aufnahme von einem Pop<html> ulation von primären sensorischen Neuronen, Rohon Beard-Zellen, beschrieben. Die Zellkörper dieser Neuronen liegen im dorsalen Rückenmark. Rohon-Beard - Zellen existieren in zahlreichen Wirbeltierarten unterscheiden früh in der Entwicklung, und liegen unter der embryonalen Touch - Reaktion 6, 44, 47, 48. Zweitens Verfahren für den Zugriff auf und die Aufnahme von spinalen motorischen Neuronen sind detailliert. Zebrafisch-spinale motorische Neuronen entstehen während zwei Wellen des Neurogenese. Die früheren geborenen primären motorischen Neuronen entstehen am Ende der Gastrulation (~ 9-16 HPF), mit nur 3-4 primären motorischen Neuronen , die pro hemisegment 45, 46, 49. Im Gegensatz dazu ist die später geborene Bevölkerung von sekundären motorischen Neuronen zahlreicher und stellt sich während eines längeren Zeitraums, beginnend bei ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. Secondary Motoneuron Genese Mitte trunk Segmente meistens von 51 HPF 50. Secondary motorischen Neuronen sind als abgeschlossen ist das Gegenstück von Motoneuronen in amniotes 46 sein. Interessanterweise supraspinalen Neuronen über Dopamin, regulieren Lokomotion in der Larve und sekundären Motoneuron Genese im Embryo und junge 50 Larve, 51. primäre und sekundäre Motorneuronen umfassen , die jeweils mehrere verschiedene Subtypen. jeder primäre Motoneuron - Subtyps projiziert einen peripheren Axonen , die eine charakteristische Muskelgruppe innerviert, in einer stereotypen führt, axonalen Trajektorie identifiziert. im Allgemeinen sekundäre Motorneuronen die axonale Wege zuvor eingesetzten primären motorischen Neuronen folgen. Somit wird mit Bezug auf die axonale Trajektorien, primäre und sekundäre Motorneuronen sind ähnlich, mit der Ausnahme, dass axonale Dicke und Größe a somatawieder größer für die primären Motorneuronen 45. Drittens Methoden für die Aufzeichnung von einigen Arten von Inter diskutiert. In diesen Fällen ist jedoch eine begrenzte Menge an Entfernung anderer Rückenmarkszellen erforderlich ist, und damit das Rückenmark ist weniger intakt als bei Aufnahmen von Rohon Beard-Zellen oder motorischen Neuronen.

<table><tbody><tr><td>Vakuumfilter/Vorratsflasche, 0,22 mm Pore</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter 0,2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat, Salz&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha;-Bugarotoxin</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 Hydrazinsalz</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-10438</td><td>Fluoreszenzfarbstoff</td></tr><tr><td>Spin-X Zentrifugenröhrenfilter</td><td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silikon Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>Silikon-Elastomer-Petrischalen</td></tr><tr><td></td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>Innen- und Außendurchmesser von 0,78 und 1,0 mm (dünnwandige Glaskapillaren)</td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>Innen- und Außendurchmesser von 1,13 und 1,55 mm (dickwandige Glaskapillaren)</td></tr><tr><td>Miniatur-Stabverschraubung aus Polypropylen mit Widerhaken&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Klebstoff&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>&nbsp; Modell P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Kopftisch</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Mikromanipulator&nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN und WALL 1/32 IN (flexible Laborschläuche)</td></tr><tr><td>Elektrodenhalter</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal Dreiwege-Absperrhähne&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0,80W Achroplan Objektiv</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software zur Datenerfassung und -analyse&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex und Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modell P-97</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Dissektions- und Aufzeichnungslösungen (in mM)</td></tr><tr><td>Alle Lösungen, mit Ausnahme der intrazellulären, sind ~2-3 Monate haltbar, wenn sie filtriert (0,22 mm Filterbecher) und bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Die intrazelluläre Lösung wird filtriert (0,2 mm Spritzenfilter) und gefroren (-20 &Grad; C) in kleinen Aliquoten, die am Tag der Anwendung einzeln aufgetaut werden.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sezieren/Klingeln" s Lösung</td><td></td><td></td><td>145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (mit NaOH)</td></tr><tr><td>Pipette (intrazelluläre) Aufnahmelösung</td><td></td><td></td><td>135 KCl, 10 EGTA-Säure, 10 HEPES; pH 7,4 (mit KOH).</td></tr><tr><td>Bad (extrazellulär) zur Aufzeichnung von Lösung/Spannungs- und Stromzange</td><td></td><td></td><td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7,4 (mit NaOH).</td></tr><tr><td>Alexa-594 Hydrazinsalz-Stammlösung.&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie einen 13,2 mM Stamm in ddH2O, aliquot (~100 &micro; l) und bei -20 °C lagern. Zur Verwendung wird die 132-fache Lösung mit Pipettenlösung auf eine Endkonzentration von 100 mM verdünnt. Nach der Verdünnung die Alexa-594 mit Pipettenlösung filtrieren&nbsp; mit einem Zentrifugenrohrfilter.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Immobilisierungsmittel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4%iges Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz (Tricain)</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie eine 0,4%ige Stammlösung in 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Tricain/100 mL 0,2 M Tris</td></tr><tr><td colspan="4">Den pH-Wert mit NaOH auf 7 einstellen und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td colspan="4">Zur Verwendung die Stammlösung ~25-fach im Embryomedium verdünnen</td></tr><tr><td>250 mM &alpha;-Bungarotoxin</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie einen 250 mM Stamm in ddH2O (1 mg/500 mL) vor, bereiten Sie 100 & Mikro vor; L aliquots und sotre bei -20 °C.</td></tr><tr><td colspan="4">Zur Verwendung 2.500-fach mit extrazellulärer Lösung auf eine Endkonzentration von 100 nM verdünnen.</td></tr><tr><td>1 mM Tetrodotoxin</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie eine 1 mM Brühe in ddH2O (1 mg/3 mL) vor, bereiten Sie 100 & micro; L aliquots und sotre bei -20 °C.</td></tr><tr><td colspan="4">Zur Verwendung 2.000-fach mit extrazellulärer Lösung auf eine Endkonzentration von 500 nM verdünnen.</td></tr></tbody></table>

zebrafisch<em&gt; in situ</em&gt; spinal cord vorbereitung für elektrophysiologische aufzeichnungen von spinal sensory and motor neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafisch, zunächst als Entwicklungsmodell eingeführt hat an Popularität gewinnt in vielen anderen Bereichen. Die Leichtigkeit der Aufzucht einer großen Anzahl von sich rasch entwickelnden Organismen, mit der embryonalen optische Klarheit kombiniert, diente als Ausgangs zwingenden Attribute dieses Modells. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Erfolg dieses Modells weiter durch seine Ansprechbarkeit auf groß angelegte Mutagenese-Bildschirme und durch die Leichtigkeit der Transgene angetrieben worden. In jüngster Zeit haben Gen-Editing Ansätze, um die Leistung des Modells erweitert. Für Studien der neurologischen Entwicklung der Larve Zebrafischembryo und liefern ein Modell, an dem mehrere Methoden angewendet werden können. Hier konzentrieren wir uns auf Methoden, die die Studie einer wesentlichen Eigenschaft von Neuronen, elektrische Erregbarkeit ermöglichen. Unsere Vorbereitung für die elektrophysiologische Untersuchung von Zebrabärbling spinalen Neuronen beinhaltet die Verwendung von Tierarzt Naht Kleber, um die Vorbereitung auf eine Aufzeichnungskammer zu sichern. Alternative Methoden zur Aufzeichnungvon Zebrabärbling - Embryonen und Larven betreffen die Befestigung des Präparates an die Kammer eine feine Wolframstift 1, 2, 3, 4, 5 verwendet wird . Ein Wolframstift wird am häufigsten verwendet , um die Zubereitung in einer seitlichen Orientierung zu montieren, obwohl sie verwendet wurde Larve dorsale Seite nach oben 4 zu montieren. Der Naht Leim verwendet worden Embryonen und Larven in beiden Orientierungen zu montieren. Unter Verwendung des Klebers kann eine minimale Dissektion durchgeführt werden, die den Zugang zu spinalen Neuronen ohne die Verwendung einer enzymatischen Behandlung, um dadurch eventuelle Schäden zu vermeiden. Doch für die Larven, ist es notwendig, eine kurze Enzymbehandlung anzuwenden, um das Muskelgewebe rund um das Rückenmark zu entfernen. Die hier beschriebenen Methoden sind verwendet worden, die intrinsischen elektrischen Eigenschaften von Motorneuronen, Inter und sensorischen Neuronen an mehreren developmenta zu studierenl Stufen 6, 7, 8, 9.

Wir haben erfolgreich von Rohon Beard-Neuronen in 17 hpf Embryonen bis 7 dpf Larven (5A und 5B) aufgezeichnet. Wenn Rohon Beard-Zellen aufgenommen wurden, wurde die Zubereitung montiert dorsal-Seite nach oben. Eine solche Montage ermöglicht die eindeutige Identifizierung von Rohon-Beard auf ihrer oberflächlichen dorsalen Positionen und große Größen soma Zellen basieren. Die Identifizierung wird durch das stereotypisch hyperpolarisiertem Ruhemembranpotent...

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Das übergeordnete Ziel dieser Vorbereitung besteht darin, die elektrophysiologische Untersuchung von Zebrafisch-Rückenmarkneuronen in situ in embryonaler und larvaler Phase zu ermöglichen. Die elektrophysiologischen Analysen ergänzen die leistungsstarken genetischen und bildgebenden Ansätze, die mit dem Zebrafisch-Modell ebenfalls möglich sind. Obwohl die Methode ursprünglich zur Untersuchung von Rohon-Beard-Neuronen entwickelt wurde, haben wir den Ansatz im Laufe der Zeit leicht angepasst und können nun verschiedene Typen von Rückenmarkneuronen untersuchen.Den Ablauf wird Dr. Rosa Moreno, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin, demonstrieren, mit der ich bereits seit vielen Jahren die Freude an einer Zusammenarbeit habe. Um mit dem Verfahren zu beginnen, entfernen Sie die schwarze Birne aus einem Glasrohr und ersetzen Sie sie durch einen weißen Gummiazadapter aus einem anderen Glasrohr. Schneiden Sie anschließend ein Stück flexibles Schlauchmaterial auf eine Länge von etwa 38 Zentimetern zu. Dann befestigen Sie den flexiblen Schlauch mithilfe eines kleinen, geraden Polypropylen-Verbindungsstücks. Zum Vorbereiten des Silikonelastomers geben Sie die Basis und das Härtemittel in ein kunststoffenes kegelförmiges Reagenzglas im Verhältnis vier zu eins. Anschließend mischen Sie die Elastomer-Basis und das Härtemittel gründlich. Geben Sie die Mischung auf zwei 100-Millimeter-Petri-Schalen, etwa einen Millimeter tief in einer Petri-Schale und etwa 2,5 Millimeter tief in der anderen. Lassen Sie das Silikonelastomer durch Luftexposition vier bis fünf Tage lang aushärten. Falls das ausgehärtete Elastomer früher benötigt wird, inkubieren Sie es bei 60 Grad Celsius.Anschließend ausschneiden ein Rechteck von 3,8 Zentimetern mal 6,3 Zentimetern aus dem einen Millimeter dicken gehärteten Elastomer, das als Boden der Kammer dient. Aus dem 2,5 Millimeter dicken gehärteten Silikon ein Rechteck von 3,8 Zentimetern mal 6,3 Zentimetern schneiden. Danach aus diesem ein inneres Rechteck von 2,5 Zentimetern mal fünf Zentimetern ausschneiden, um einen Rahmen für die Oberseite der Kammer zu erzeugen.Um die Präparationskammer herzustellen, platzieren Sie das dünne Silikonrechteck direkt auf dem Objektträger und achten Sie darauf, alle Luftblasen zwischen Silikon und Glas zu entfernen. Anschließend setzen Sie den Silikonrahmen auf die dünne untere Silikonschicht. In diesem Verfahren geben Sie ein Embryo in eine Präparationskammer, die zwei bis drei Milliliter Ringer-Lösung enthält.Immobilisieren Sie das Embryo, indem Sie 100 Mikroliter einer 0,4 %igen Tricain-Lösung in die Kammer geben. Ziehen Sie anschließend einige Injektions-Mikropipetten mit langen, dünnen Spitzen aus der Dünnwandglasröhre mit einem Mikropipettenzieher. Befestigen Sie eine gezogene Glas-Mikropipette am Glasboden des Klebstoffdosiersystems.Verwenden Sie unter dem Stereomikroskop eine Pinzette, um die Spitze der Glas-Mikropipette zu brechen, sodass eine Öffnung mit einem Durchmesser von etwa 75 Mikrometern entsteht. Füllen Sie nun die Glas-Mikropipette mit drei bis fünf Mikrolitern Klebstoff, indem Sie über das Mundstück Saugkraft aufbringen. Führen Sie die mit Klebstoff gefüllte Spitze in die Präparationskammer.Bringen Sie dann die Spitze der mit Klebstoff beladenen Mikropipette nahe an den Kopf des Embryos heran, wobei Sie über das Mundstück einen leichten positiven Druck an der Mikropipette aufrechterhalten. Sobald sich die Spitze nahe am Kopf des Embryos befindet, erhöhen Sie den positiven Druck ausreichend, um einen kleinen Tropfen Klebstoff auf den Boden der Kammer auszustoßen. Bewegen Sie den Embryo mit einer Präpariernadel in Richtung des Klebstofftropfens, sodass der Kopf mit dem Klebstoff in Kontakt kommt.Richten Sie das Embryo mit der dorsalen Seite nach oben aus und drücken Sie leicht auf den Kopf, um einen guten Halt auf dem Klebstoff zu gewährleisten. Während der Klebstoff langsam aushärtet, verwenden Sie die Präpariernadel, um das Embryo so neu zu positionieren, dass es ventral nach unten und dorsal nach oben liegt. Tauchen Sie die Präpariernadel in den Klebstofftropfen und ziehen Sie einige Fäden des Klebstoffs über den Kopf des Embryos, um dessen Position zusätzlich zu sichern.Wenn der Kopf sicher an dem Silikon befestigt ist und der Kleber erstarrt ist, opfern Sie das Embryo durch Durchtrennung auf Höhe des Hinterhirns mit einer weiteren Glas-Mikropipette. Verwenden Sie eine frische Glas-Mikropipette, um die Haut mehrfach oberflächlich an einer Position kaudal zum Hinterhirn einzuschneiden. Durchbohren Sie die Haut oberflächlich, indem Sie die Pipette senkrecht zur rostrokaudalen Achse auf jeder Seite des Rumpfes bei dorsal montierten Präparaten oder auf der freiliegenden Seite des Rumpfes bei lateral montierten Präparaten bewegen.Um eine Hautlasche zu erzeugen, die mit der Pinzette gegriffen werden kann, kratzen Sie mehrmals mit der Mikropipette auf Höhe des ursprünglichen Schnitts und senkrecht zu diesem über die Haut. Heben Sie mit der Pinzette nach und nach die Hautlasche an und ziehen Sie die Haut kaudalwärts. Danach geben Sie einen kleinen Tropfen Klebstoff in die Nähe des Embryoschwanzes ab. Verwenden Sie diesen Kleber, um den Schwanz an der Unterseite der Präparationskammer zu befestigen. Während der Kleber aushärtet, justieren Sie die Position des Rumpfes mit der Präpariernadel, um sicherzustellen, dass der Rumpf dorsal ausgerichtet bleibt und fest an der Kammer befestigt ist. Spülen Sie nach dieser ersten Präparation das Präparat gründlich mit Ringer-Lösung aus, um Tricain und Ablagerungen zu entfernen, und lassen Sie das Präparat anschließend fünf Minuten ruhen.Als Nächstes ersetzen Sie die Dissektionslösung durch eine extrazelluläre Ableitungslösung. Falls erforderlich, geben Sie ein Immobilisierungsmittel zur Präparation hinzu. Danach überführen Sie die Dissektionskammer mit dem befestigten Embryo auf den Objektträger eines aufrechten zusammengesetzten Mikroskops, das mit einem 40×-Wasser-Immersion-Objektiv mit großer Arbeitsdistanz ausgestattet ist.Danach montieren Sie eine leere Bohrung aus dickwandigem Silikatglas-Mikropipettenglas auf den Elektrodenhalter der Kopfstufe. Verbinden Sie das Schlauchstück an einem Ende mit dem Luftauslass des Elektrodenhalters und am anderen Ende mit einem Dreiweghahn. Anschließend setzen Sie ein Mundstück an einem Ende eines weiteren Schlauchstücks auf und verbinden das andere Ende mit dem Dreiweghahn.Anschließend führen Sie die Mikropipettenspitze zum am weitesten dorsal gelegenen Bereich des Rückenmarks und durchstoßen vorsichtig die Hirnhäute. Bewegen Sie die Spitze dann mit schnellen, kurzen seitlichen Bewegungen, um die Hirnhäute zu lösen. Sobald die Mikropipettenspitze die Hirnhäute durchdrungen hat, bewegen Sie sie vorwärts und heben sie an, um die Hirnhäute vom Rückenmark abzuheben.Bewegen Sie die Mikropipette anschließend rostral vorwärts über ein bis zwei Hemi-Segmente, um die Rohon-Bart-Zellen freizulegen. Nach unserer Erfahrung sind Rohon-Bart-Neurone zerbrechlicher als andere spinale Neurone. Um sie gesund zu erhalten, legen wir jeweils ein oder zwei Rohon-Bärte frei.Spannungsclamp-Aufzeichnungen von auswärts gerichteten und einwärts gerichteten Strömen wurden von den Rohon-Beard-Neuronen in Embryonen und Larven eins, zwei und sieben Tage nach der Befruchtung erhalten. Das Haltepotential betrug 80 Millivolt, und die Ströme wurden durch einen depolarisierenden Sprung auf positive 20 Millivolt ausgelöst. Im Stromclamp-Modus löst eine Strominjektion von 0,35 Nanoampere für eine Millisekunde in sowohl Embryonen als auch Larven ein einzelnes Aktionspotential in den Rohon-Beard-Neuronen aus.Ohne elektrische Stimulation zeigen Rohon-Beard-Neuronen kein spontanes Feuern. Das Ruhepotential der Rohon-Beard-Neuronen wird im Verlauf der Entwicklung zunehmend negativer. Sobald diese Methode beherrscht ist, können Embryonen innerhalb von 10 Minuten präpariert und disseziert werden, um die Rohon-Beard-Neuronen freizulegen.Wie im Protokoll erwähnt, ist es wichtig, die Faktoren zu verstehen, die bestimmen, wie schnell der Klebstoff aushärtet. Dieses Video hebt die entscheidenden Schritte zur Ableitung von Signalkurven aus Rückenmarkneuronen bei Zebrafischen hervor.

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