Name: Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie die Detektion von GPCR-Internalisierung in Säugetierzellen durch konfokale Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung subzellulärer Lokalisation und liefert Einblicke in Rezeptordynamik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren dieses Artikels möchten Prof. Jiayan Xie für die technische Unterstützung und die Nutzung der Ausrüstung danken. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (41406137).

1. Zellpräparation <ol><li> Zellgewinnung <ol><li> Übertragen der kryokonservierten menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen (HEK293) aus einem Flüssigstickstofftank zu einem 37 ° C Wasserbad und schütteln kontinuierlich für 1 bis 2 min. </li><li> 10 ml äquilibriertem Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung) zu einer 10-cm Zellkulturschale. fügen Sie vorsichtig die aufgetauten Zellen auf das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium. </li><li> Inkubieren die Zellen in einem 37 ° C mit Wassermantel CO 2 -Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft und 5% CO 2 für 2 - 4 Stunden. </li><li> Nach 2 bis 4 Stunden, überprüfen Sie, dass die Zellen gebunden sind. Ersetzen Sie das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium und Kultur für eine weitere 24 bis 48 h. HINWEIS: Um das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium zu ändern, ist nützlich, weil es Dimethylsulfoxid entfernt (DMSO) und schützt vor Zellschäden. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; Zellpassage <ol><li> Nach 24 bis 48 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz gewachsen sind, verwerfen, das Wachstumsmedium equilibriert und die Zellen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Schwenken Sie die sanft Gericht. </li><li> Verwerfen Sie den PBS und füge 1 ml Trypsin-EDTA (Kochsalzlösung, 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA). Um die Zellen vollständig zu verdauen, wirbeln die Schale vorsichtig und absaugen die Trypsin-EDTA-Lösung. Setzen Sie die Schale in dem 37 ° C mit Wassermantel CO 2 -Inkubator für 3 min. HINWEIS: In dieser Zeit bereitet drei neue 10-cm-Zellkulturschalen und 10 ml Medium zu jedem ins Gleichgewicht gebracht Wachstums hinzuzufügen. </li><li> Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, festzustellen, ob die Zellen vom Boden der Schale angehoben haben. In 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium in die Schale. Mischen durch Pipettieren und Pipettieren sofort 0,6 ml der Zellsuspension zu jeder der neuen Gerichte. Vorsichtig mischen durch Pipettieren und lassen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren. </li></ol></li&gt; </ol> 2. Zell Seeding <ol><li> Nach 24 bis 48 h, wenn die passagierten Zellen nahe Konfluenz gewachsen sind, verwerfen, das Wachstumsmedium equilibriert und die Zellen mit 2 ml PBS waschen. Schwenken Sie die sanft Gericht. </li><li> Verwerfen Sie den PBS und füge 1 ml Trypsin-EDTA. Um die Zellen vollständig zu verdauen, wirbeln die Schale vorsichtig und absaugen den Trypsin-EDTA. Setzen Sie die Schale in dem 37 ° C mit Wassermantel CO 2 -Inkubator für 3 min. HINWEIS: In dieser Zeit bereitet eine 6-Well-Platte durch Zugabe von 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium in jeder Vertiefung. </li><li> 1 ml Wachstumsmedium equilibriert in die Schale, wenn, unter mikroskopischer Beobachtung, um die Zellen von der Schale Boden abgehoben zu haben. Mischte durch Pipettieren und Pipettieren sofort 0,1 ml der Zellsuspension (das Volumen wird so eingestellt, entsprechend die Zellwachstumsdichte) zu jeder Vertiefung der hergestellten Platte mit 6 Vertiefungen (cell-less 6-Well-Platte mit 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium). Vorsichtig mischen durch Pipettieren und lassen die Zellenbei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren. </li></ol> 3. Zelltransfektion <ol><li> Transfektionsverfahren 1, mit Liposomformulierungen HINWEIS: Bitte beachten Sie die Tabelle der Materialien für Transfektionsreagenz 1. <ol><li> Am folgenden Tag, stellen Sie sicher, dass die Zellen 85 sein sollte - 95% konfluent. </li><li> Hinzufügen 3 ug Plasmid-DNA (500 ng / ul) und 100 ul reduzierten Serummedien in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten 9 &amp; mgr; l Reagenz 1 und 100 &amp; mgr; l der reduzierten Serummedium in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Kombinieren des verdünnten Gemisches mit Plasmid verdünnt Reagenz 1 (Gesamtvolumen = 215 ul). Vorsichtig mischen und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Aspirat Medium aus Zellen kultiviert Platte, und 1,5 ml frisches DMEM ohne FBS hinzuzufügen. </li><li> In 215 &amp; mgr; l DNA-transfection Reagenzmischung zu jeder Vertiefung tropft und vorsichtig mischen, indem die Platte wirbelnden. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 - 8 h. Ersetzen mit frischem DMEM mit 10% FBS. </li><li> Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für weitere 24 bis 48 h , bevor irgendwelche Versuche ausgeführt wird . </li></ol></li><li> Transfektionsverfahren 2, mit Liposomformulierungen HINWEIS: Bitte beachten Sie die Tabelle der Materialien für Transfektionsreagenz 2. <ol><li> Fügen Sie 2 ug Plasmid-DNA (500 ng / &amp; mgr; l), 4 &amp; mgr; l Reagenz 2 und 100 &amp; mgr; l reduzierten Serummedium in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Vorsichtig mischen und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie das Transfektionsgemisch zu den Zellen in tropfenweise. </li><li> Nach der Transfektion inkubieren Zellen für 24 bis 48 h bei 37 ° C und 5% CO 2, bevor irgendwelche Versuche ausgeführt wird . </li></ol></li></ol> 4. Zellkultur auf Deckgläser <ol><li> Rebewegen, um das Wachstumsmedium aus der Kultur 6-Well-Platte. </li><li> Waschen Sie die Zellmonoschicht mit 1 ml PBS ohne Calcium und Magnesium. </li><li> In 0,5 ml Trypsin-EDTA. Schwenken Sie die Schale vorsichtig und absaugen Trypsin-EDTA. Inkubieren der Kulturplatte für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Die tatsächliche Inkubationszeit variiert mit der Zelllinie verwendet. HINWEIS: In dieser Zeit bereitet eine neue 12-Well-Platte und 15 mm Durchmesser hinzuzufügen sterile Abdeckung zu jeder Vertiefung rutscht. Deckplättchen beschichtet mit Lysin, Laminin oder Kollagen kann Zellanheftung für HEK293-Zellen verbessern, die sich leicht lösen. </li><li> Wenn Zellen abgelöst sind, 1 ml vorgewärmtem vollständige Wachstumsmedium in jeder Vertiefung. Mischen durch Pipettieren und sofort übertragen, um die erforderliche Anzahl von Zellen in die 12-Well-Platte mit Deckgläsern. In frisches vollständiges Wachstumsmedium zu jeder Vertiefung das Gesamtvolumen auf 1 ml einzustellen </li><li> Inkubieren der Zellen für 16 bis 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2. HINWEIS: Nach 30 -60 min, haben die Mehrzahl der Zellen in den sterilen Deckgläschen geklebt. </li></ol> 5. konfokale Mikroskopie Nachweis <ol><li> zelluläre Lokalisation <ol><li> Nach 16 - 24 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz auf dem sterilen Deckgläschen in 12-Well-Platte gewachsen sind, fügen die Membransonde DiI, in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 5 &amp; mgr; M ergibt. Lassen Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren. </li><li> Nach 30 min Entfernen des Wachstumsmediums ins Gleichgewicht gebracht und die Zellen zweimal in kaltem PBS waschen (2 - 8 ° C). </li><li> Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Sanft für 15 min rühren. Achtung: Paraformaldehyd ist mäßig giftig durch Hautkontakt oder Einatmen und als wahrscheinlich krebserzeugend beim Menschen bezeichnet. Chemikalien Abzugshauben, belüftete Balance-Gehäuse oder anderen Schutzmaßnahmen werden während des Wiegens und die Handhabung von Paraformaldehyd verwendet werden. &lt;/ Li&gt; <li> Waschen der fixierten Zellen zweimal in PBS. Hinzufügen 200-300 uL DAPI (4&#39; , 6-Diamidino-2-phenylindol) Lösung (0,5 ug / ml) in jede Vertiefung und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Entferne vorsichtig die Deckgläser aus der Platte und der Docht aus überschüssigem PBS. Invertieren auf Mikroskop-Objektträger, beladen mit einem Tropfen Eindeckmediums (50% v / v Glycerin / Wasser). Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium aus den Folien. </li></ol></li><li> Cellular Internalisierung <ol><li> Nach 16 - 24 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz auf dem sterilen Deckgläschen in 12-Well-Platte gewachsen sind, das äquilibrierte Wachstumsmedium entfernen und frische hinzufügen, erwärmt DMEM-Medium (37 ° C). Inkubieren der Zellen für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Behandeln , um die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen (0, 10 -12, 10 -9 und 10 -6 M) von Liganden für 30 min und behandelt sie mit 10 -6 M Ligand für verschiedene Zeiten (0,10, 30 und 60 min). </li><li> Wasche die Zellen zweimal in kaltem PBS (2 - 8 ° C). Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Sanft für 15 min rühren. </li><li> Wasche die Zellen zweimal in PBS. Entferne vorsichtig die Deckgläser aus der Platte und der Docht die überschüssige PBS ab. Invertieren auf Mikroskop-Objektträger, beladen mit einem Tropfen Eindeckmediums (50% v / v Glycerin / Wasser). Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium aus den Folien. </li></ol></li><li> Die konfokale Mikroskopie <ol><li> Schalten Sie die Hardware der konfokalen Mikroskop, einschließlich der Quecksilberlampenleistung, PC Mikroskop, Scanner und Laser. Login für das Betriebssystemkonto, um die Software starten, überprüfen Sie die Konfiguration und wählt Laser. Schalten Sie die verschiedenen Einheiten der konfokalen Mikroskopie-System in der Reihenfolge entsprechend den Anweisungen. </li><li> Legen Sie die vorbereiteten Folien auf dem Mikroskoptisch. Platzieren Sie die Probe über die Objektivlinse unter Verwendung der Stufensteuerung. Einen Tropfen Zedernöl aufzu Deckglas, wenn die Linse Ölkapselung ausgewählt ist. Legen Sie die Deckgläser auf Objektträger der Linse gegenüber. </li><li> Finden Sie die Zellen von Interesse unter der Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Schalten Sie Modus zu scannen. Wählen Sie die Laserleistung und den spektralen Emissionsbereich des Fluorophors. Erfassen Sie die hohe Qualität konfokale Bilder von Tuning Laserintensität und andere Parameter. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+molecular+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and molecular sorting.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).</li>
<li>Hausott, B., Klimaschewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+turnover+and+receptor+trafficking+in+regenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons.</a> Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).</li>
<li>Kallal, L., Benovic, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+fluorescent+proteins+to+study+G-protein-coupled+receptor+localization+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking.</a> Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).</li>
<li>Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+the+Aequorea+victoria+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.</a> Gene. 111, 229-233 (1992).</li>
<li>Spector, D. L., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+Expressing+GFP+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins.</a> CSH protocols. 2006, (2006).</li>
<li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).</li>
<li>von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+vectors+for+the+expression+of+green+fluorescent+protein+fusion+proteins+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants.</a> Gene. 221, 35-43 (1998).</li>
<li>Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+green+fluorescent+protein+for+visualization+of+cell-specific+gene+expression+and+subcellular+protein+localization+during+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).</li>
<li>Kain, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+of+gene+expression+and+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization.</a> BioTechniques. 19, 650-655 (1995).</li>
<li>Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+ligand-mediated+internalization+of+G+protein-coupled+receptor+as+a+novel+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach.</a> Life Sci. 80, 17-23 (2006).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-Activated+Bombyx+Corazonin+Receptor+Is+Internalized+via+an+Arrestin-Dependent+and+Clathrin-Independent+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway.</a> Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).</li>
<li>Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+G+protein-coupled+receptor+kinases+and+arrestins+during+receptor+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization.</a> Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).</li>
<li>Ferguson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+beta-arrestin+in+mediating+agonist-promoted+G+protein-coupled+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization.</a> Science. 271, 363-366 (1996).</li>
<li>Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+receptors%3A+structure+and+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways.</a> Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).</li>
<li>Yan, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Expression+Profile+of+the+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%2C+dually+couples+to+the+G%28q%29+and+G%28s%29+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li>
<li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+Characterization%2C+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine effiziente und einfach zu interpretierende Methode, um die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von exprimierten GPCR-Fusionsprotein in HEK293-Zellen zu erkennen. Die Technik kann leicht für viele verschiedene Gene und Zelltypen angepasst werden, wie für die zelluläre Lokalisation und Internalisierung des Rezeptors corazonin von Bombyx mori in HEK293 und BmN Zellen 16. Die erfolgreiche Anwendung dieser l...

Zellen Frachthandel Maschinen besitzen extrazelluläre Materialien-wie Liganden, Mikroorganismen, Nährstoffe zu transportieren und Transmembranproteine-in die Zelle für Information, Energie und andere Zwecke 1, 2. Es ist von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Homöostase, Gewebefunktion, und die allgemeine Überleben der Zelle. Die zellbasierte Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen ist eine leistungsfähige Methode die Lokalisierung und Internalisierung von Transmembran - Rezeptoren, wie G - Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zu untersuchen, in Signalweg 3. Die Expression von Fusionsproteinen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert aus Qualle Aequorea victoria, direkte Fluoreszenznachweistechniken kombiniert werden , hat breite Akzeptanz in Protein-Targeting Research 4, 5, 6 gewonnen. GFP-basierte DETECTIauf den Vorteil der Echtzeit - Abbildung von lebenden Zellen ermöglicht , während Fixations Artefakte vermieden 7. Eine Reihe von vielseitigen Klonierungsvektoren wurde in verschiedenen Zellen 8, 9 , die Expression von Proteinfusionen auf GFP zu erleichtern konstruiert. Der pEGFP-N1-Vektor ist ein weit verbreiteter und kommerzialisierte Plasmidvektor ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) kodieren, die für hellere Fluoreszenz und höhere Expression in Säugerzellen von Wildtyp-GFP optimiert wurde. Um das Fluoreszenzsignal von EGFP zu beobachten in Säugerzellen exprimiert, sollte die Fluoreszenzmikroskopie mit einer Anregung bei 488 nm und der Emission bei 507 nm, vorzugsweise mit konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden. Überwachung der subzellulären Lokalisation und Ligand-vermittelte Internalisierung der Rezeptoren ist eine übliche Technik , die die Signaltransduktion und Funktion von GPCRs 10 zu untersuchen , </sbis&gt; 11. In den meisten Fällen führt zu Internalisierung Desensibilisierung der GPCRs (die Dämpfung der Reizantwort , trotz der Anwesenheit von Agonisten) 12, 13. Die internalisierten Rezeptoren können in die Lysosomen aufgenommen werden und abgebaut werden, oder sie können wieder an die Zelloberfläche zurückgeführt werden, abhängig von der Art der Rezeptoren und die in den Experimenten verwendeten Zelllinien. Die Gonadotropin-Releasing - Hormon - Rezeptoren (GnRHRs) gehören zu der GPCR - Familie und haben eine typische GPCR - Proteinstruktur, mit einer extrazellulären aminoterminalen, ein intrazelluläres -COOH - Terminal, und sieben Transmembran (TM) -Domäne 14. Die Transfektion des rekombinanten Plasmids Sj GnRHR-EGFP (mit den GnRHR - Genen aus Sepiella japonica) und der konfokalen Mikroskopie Nachweis von EGFP-markierten Sj GnRHR (in HEK293 - Zellen exprimiert) wurden berichtet früsly und GFP - Fluoreszenz wurde 15 als Reporter für Transmembranprotein Lokalisierungs Assays etabliert. Nun wird die Internalisierung von Sj GnRHR, aktiviert durch S. japonica Gonadotropin-Releasing - Hormon (GnRH Sj) wurde in zeit- und dosisabhängigen Art und Weise durch konfokale Mikroskopie demonstriert.

<table><tbody><tr><td>HEK293 Zelllinie&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hyklon mit hohem Glukosegehalt</td><td></td><td>SH30022,01</td><td>L-Glutamin mit hohem Glukosegehalt 4,0 mM</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Genom</td><td>GNM10010</td> Penicillin-Streptomycin-Genom GNM15140 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin und 0,02 %</td><td>EDTA-Genom</td><td></td><td></td>GNM25200</tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Reagenz 1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Transfektionsreagenz</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Reagenz 2</td></tr><tr><td>DAPI Färbelösung</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>Antifade-Eindeckmedium</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co. (SCRC)</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Zellkultur</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma CO2 Inkubator</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II konfokales Laserscanning-Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td>5100001311</tr></tbody></table>

detektion von liganden-aktivierte g-protein gekoppelten rezeptor-internalisierung durch konfokale mikroskopie

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ist ein optisches Bildgebungsverfahren für die kontrastreiche Bildgebung. Es ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Visualisierung von fluoreszierenden Fusionsproteinen, wie z. B. grün fluoreszierendem Protein (GFP), um deren Expression, Lokalisation und Funktion zu bestimmen. Die subzelluläre Lokalisierung von Zielproteinen ist wichtig für die Identifizierung, Charakterisierung und funktionelle Analyse. Die Internalisierung ist einer der vorherrschenden Mechanismen, die die Signalübertragung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) steuern, um die angemessene zelluläre Reaktion auf Reize sicherzustellen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine experimentelle Methode zum Nachweis der subzellulären Lokalisation und Internalisierung von GPCR in HEK293-Zellen mit konfokaler Mikroskopie. Darüber hinaus liefert dieses Experiment einige Details über Zellkultur und Transfektion. Dieses Protokoll ist kompatibel mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Fluoreszenzmarkern und ist anwendbar auf die Visualisierung der subzellulären Lokalisation einer Mehrheit der Proteine sowie der Internalisierung von GPCR. Diese Technik sollte es Forschern ermöglichen, die GPCR-Genexpression in Säugetierzelllinien effizient zu manipulieren und Studien zur subzellulären Lokalisierung und Internalisierung von GPCR zu erleichtern.

Figur 1 zeigt ein Beispiel eines konfokalen Mikroskopsystems. Abbildung 2 zeigt die Expression von pEGFP-N1 in HEK293 - Zellen. Das GFP-Signal wurde im Zytoplasma und Zellkern nachgewiesen werden. Abbildung 3 zeigt die subzelluläre Lokalisation von GnRH von S. japonica in HEK293 - Zellen, im Einklang mit unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen 15. Das Fusionsprotein mit dem EGFP - Tag am C-Terminus vo...

Dieses Protokoll beschreibt Konfokalmikroskopie Nachweis von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Internalisierung in Säugerzellen. Es umfasst die Grundzellkultur, Transfektion und Konfokalmikroskopie Verfahren und stellt ein effizientes und leicht interpretierbares Verfahren, die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von Fusion exprimierten GPCR zu detektieren.

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine effiziente und leicht interpretierbare Methode zur Detektion der subzellulären Lokalisation und Internalisierung exprimierter GPCR-Fusionsproteine in Säugerzellen bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der subzellulären Proteinlokalisierung zu beantworten, beispielsweise zur Rezeptor-Internalisierung und -Rezyklierung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach und effizient angewendet werden kann.Daher kann diese Methode Einblicke in die Überwachung und Lokalisierung von GPCRs bieten. Außerdem ist sie auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise zytoplasmatische und nukleäre Proteine. Nachdem die HEK293-Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll wiederhergestellt und weitergegeben wurden, verwerfen Sie das äquilibrierte Wachstumsmedium, sobald die Zellen nahezu konfluent gewachsen sind, geben zwei Milliliter PBS hinzu und schwenken die Petrischale, um die Zellen zu waschen.Entfernen Sie das PBS und geben Sie ein Milliliter Trypsin-EDTA hinzu. Um die Zellen vollständig aufzulösen, schwenken Sie die Petrischale vorsichtig und aspirieren Sie die Lösung. Anschließend

detection-ligand-activated-g-protein-coupled-receptor-internalization

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Hier beschreiben wir detailliert Live Cell Imaging Verfahren zur Untersuchung Chemotaxis. Wir präsentieren fluoreszenzmikroskopische Methoden zur raum-zeitlichen Dynamik der Signalwege bei der Migration von Zellen zu überwachen. Die Messung der Signal-Ereignisse ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie ein GPCR-Signalisierung Netzwerk Gradienten Erfassung Lockstoffe und steuert direktionale Migration von eukaryotischen Zellen erreicht.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse.

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Bild-Zellen, die das grün fluoreszierende Protein-markierten Angiotensin Typ 1a-Rezeptoren während der Endozytose durch Angiotensin-II-Behandlung eingeleitet werden. Diese Technik beinhaltet die Kennzeichnung Lysosomen mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, und dann Software die Co-Lokalisierung des Rezeptors und Lysosom in drei Dimensionen über die Zeit zu analysieren, verwendet.

Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Lernen Sie die Detektion von GPCR-Internalisierung in Säugetierzellen durch konfokale Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung subzellulärer Lokalisation und liefert Einblicke in Rezeptordynamik.

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Weitere Videos entdecken