Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine effiziente und leicht interpretierbare Methode zum Nachweis der subzellulären Lokalisation und Internalisierung von exprimierten GPCR-Fusionsproteinen in Säugetierzellen bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der subzellulären Proteinlokalisierung zu beantworten, wie z. B. die Internalisierung und das Recycling von Rezeptoren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach und effizient verwendet werden kann.

Diese Methode kann also Einblicke in die Überwachung und Lokalisierung von GPCRs geben. Und es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. zytoplasmatische und nukleare Proteine. Nach der Gewinnung und Passage von HEK293-Zellen gemäß dem Textprotokoll, wenn die Zellen nahe an den Zusammenfluss herangewachsen sind, verwerfen Sie das äquilibrierte Wachstumsmedium, fügen Sie zwei Milliliter PBS hinzu und schwenken Sie die Schale, um die Zellen zu waschen.

Verwerfen Sie das PBS und fügen Sie einen Milliliter Trypsin-EDTA hinzu. Um die Zellen vollständig zu verdauen, schwenken Sie die Schale vorsichtig und saugen Sie die Lösung ab. Stellen Sie das Gericht dann für drei Minuten in diesen 37 Grad Celsius warmen C02-Inkubator.

Während die Zellen inkubieren, bereiten Sie eine Platte mit sechs Vertiefungen vor, indem Sie zwei Milliliter äquilibriertes Wachstumsmedium in jede Vertiefung geben. Dann, wenn sich die Zellen vom Boden der Schale abgehoben haben, geben Sie einen Milliliter äquilibriertes Wachstumsmedium in die Schale. Mischen Sie durch Pipettieren und geben Sie sofort 0,1 Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung der vorbereiteten Sechs-Well-Platte.

Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig in die Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass die Zellen zu 85-95 % zusammenfließen. Geben Sie dann in zwei sterile Mikrozentrifugenröhrchen drei Mikrogramm Plasmid-DNA und 100 Mikroliter reduziertes Serummedium in ein Röhrchen.

In der Zwischenzeit fügen Sie neun Mikroliter Reagenz ein und 100 Mikroliter reduziertes Serummedium in ein anderes Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie die verdünnte Plasmidmischung mit dem verdünnten Reagenz.

Mischen Sie dann die Lösung vorsichtig und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Medium der Zellen und fügen Sie 1,5 Milliliter frisches DMEM ohne FBS hinzu. Geben Sie dann tropfenweise 215 Mikroliter DNA-Transfektionsreagenzmischung in jede Vertiefung und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Platte schwenken.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für vier bis acht Stunden. Ersetzen Sie dann das Medium durch frisches DMEM mit 10 % FBS. Inkubieren Sie die Zellen weitere 24 bis 48 Stunden, bevor Sie Experimente durchführen.

Die Transfektionseffizienz kann in verschiedenen Zelllinien stark variieren. Daher kann die Optimierung der Sitz- und Stababscheidung in Abhängigkeit vom verwendeten Zelltyp erforderlich sein. Entfernen Sie das Wachstumsmedium von der Sechs-Well-Kulturplatte.

Verwenden Sie dann einen Milliliter PBS, um die Zellmonoschicht zu waschen. Fügen Sie 0,5 Milliliter Trypsin EDTA hinzu, schwenken Sie die Schale und saugen Sie die Lösung ab. Inkubieren Sie dann die Kulturplatte drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Führen Sie während der Inkubation sterile Deckgläser mit einem Durchmesser von 15 Millimetern in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte ein. Resuspendieren Sie die Zellen in einem kleinen Volumen frischen, vollständigen Wachstumsmediums und übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen mit Deckgläsern auf die 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen dann 16 bis 24 Stunden lang.

Nach 16 bis 24 Stunden Inkubation, wenn die Zellen nahe dem Zusammenfluss gewachsen sind, fügen Sie fünf Mikromolaren des Membransonden-Dill in jede Vertiefung hinzu und legen Sie die Zellen für 30 Minuten zurück in den Inkubator. Entfernen Sie das äquilibrierte Wachstumsmedium und verwenden Sie kaltes PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Geben Sie dann einen Milliliter 4%PFA in jede Vertiefung und rühren Sie die Zellen 15 Minuten lang, um die Zellen zu fixieren.

Waschen Sie bei PBS die fixierten Zellen zweimal, geben Sie dann 200 bis 300 Mikroliter DAPI in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser von der Platte und leiten Sie den überschüssigen Puffer ab. Drehen Sie die Deckgläser auf Objektträger, die mit einem Tropfen Eindeckmedium beladen sind.

Entfernen Sie dann das überschüssige Einbettmedium von den Schienen. Entfernen Sie mit Zellen, die nahe an der Konfluenz gewachsen sind, das äquilibrierte Wachstumsmedium und fügen Sie frisches erwärmtes DMEM hinzu. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang.

Behandeln Sie die Zellen 30 Minuten lang mit unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen. Und behandeln Sie die Zellen mit 10 bis minus sechs molaren Liganden für die verschiedenen Zeiten, die hier gezeigt werden. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBS, geben Sie dann einen Milliliter 4%iges PFA in PBS in jede Vertiefung, bevor Sie die Zellen 15 Minuten lang sanft bewegen.

Nachdem Sie die Zellen zweimal in PBS gewaschen haben, entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser aus den Vertiefungen der Platte und montieren Sie sie, wie gerade zuvor in diesem Video gezeigt. Um die konfokale Mikroskopie durchzuführen, schalten Sie die Hardware des konfokalen Mikroskops ein, einschließlich der Stromversorgung der Quecksilberlampe, des PC-Mikroskops, des Scanners und des Lasers. Starten Sie die Software, überprüfen Sie die Konfiguration und wählen Sie den Laser aus.

Schalten Sie die verschiedenen Einheiten des konfokalen Mikroskopiesystems gemäß den Anweisungen ein. Legen Sie einen vorbereiteten Objektträger auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie die Probe mit dem Tischregler über der Objektivlinse. Für eine Öl-Immersionslinse geben Sie einen Tropfen Zedernöl auf das Deckglas und richten Sie das Objektträger mit einem Deckglas in Richtung der Linse aus.

Suchen Sie unter Fluoreszenz die gewünschten Zellen, wechseln Sie dann in den Scan-Modus und wählen Sie die Laserleistung und den Spektralbereich des Emissionsfluorophors. Nehmen Sie qualitativ hochwertige Bilder auf, indem Sie die Laserintensität und andere Parameter einstellen. Diese Abbildung veranschaulicht die Expression von pEGFP-N1 in HEK293-Zellen.

Das GFP-Signal wurde im Zytoplasma und im Zellkern nachgewiesen. Die subzelluläre Lokalisation von Gonadotropin-Releasing-Hormon-Rezeptoren aus S-Japonica oder SjGnRHR in HEK293-Zellen ist hier dargestellt. EGFP-Rezeptoren sind grün und die Dil-Färbung, die die Zellmembran hervorhebt, ist rot.

Man sieht die Rezeptoren, die an der Plasmamembran lokalisiert sind. Um die Internalisierung von SjGnRHRs sichtbar zu machen, wurden die Zellen mit Gonadotropin-Releasing-Hormon in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Wie hier zu sehen ist, verlief die Internalisierung der Rezeptoren dosisabhängig, und der Rezeptor wurde mit dem 10 bis minus sechs molaren Liganden vollständig von der Zelloberfläche internalisiert.

Bei Behandlung mit einem molaren Liganden von 10 bis minus sechs molaren Liganden über verschiedene Zeiträume waren internalisierte SjGnRHRs 10 Minuten nach der Agonistensimulation nachweisbar, und eine extreme Internalisierung trat nach 60 Minuten auf. Wie in HEK293-Zellen gezeigt, war das fluoreszierende SjGnRHR EGFP-Fusionsprotein in beiden Experimenten hauptsächlich an der Plasmamembran lokalisiert und wurde dramatisch und schnell in die Zellen internalisiert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen unter den richtigen Bedingungen ohne Bakterien-, Pilz- und Mykoplasmenkontamination zu halten.

Nach diesem Verfahren können Methoden wie Zellkontrolle und Immobilisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die zweite im Durchgang V der Proteinrezeptoren zu beantworten. Nach jeder Entwicklung ebnete die Technologie den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie und Biochemie, um die Lokalisierung und Internalisierung von Transmembranrezeptoren in verschiedenen Zelllinien zu erforschen.