In - vitro - Bildgebung und Quantifizierung des Drug Targeting Efficiency von fluoreszierend markierten GnRH - Analoga

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirksamkeit von GnRH-basierten Wirkstoffverabreichungssystemen in menschlichen Krebszellkulturen zu untersuchen und vorherzusagen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der gezielten Krebstherapie zu beantworten, z. B. wie effizient Zellen verschiedener menschlicher Krebsarten GnRH-zielgerichtete Krebsmedikamente einnehmen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie neue fluoreszenzmarkierte GnRH-Analoga verwendet, die den gleichzeitigen Einsatz von konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie ermöglichen.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Krebstherapie, da GnRH-Rezeptoren auf mehreren Krebszelltypen stark exprimiert werden, was ein selektives Targeting auf sie ermöglicht. Bianka Gurbi, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Entfernen Sie zunächst das kultivierte Medium aus jeder der sieben Vertiefungen eines ausgesäten mikroskopischen Objektträgers.

Geben Sie dann 250 Mikroliter des vorgewärmten vollständigen Mediums in die negative Kontrollvertiefung und 250 Mikroliter des vorgewärmten GnRH-fit-Saatgutbehandlungsmediums in jede der verbleibenden sechs Vertiefungen. Inkubieren Sie den Objektträger in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid für fünf Stunden. Nach fünfstündiger Inkubation aspirieren Sie das Medium aus jeder Vertiefung und waschen die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS.

Sie anschließend 250 Mikroliter Fixierlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie den Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Sobald die Zellen fixiert sind, entsorgen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS. Geben Sie 250 Mikroliter einer in PBS hergestellten Fünf-Mikromolar-Fluoreszenzsondenlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie den Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen nach dem Entfernen der Fluoreszenzsondenlösung vorsichtig zweimal vorsichtig mit 250 Mikrolitern PBS. Geben Sie zum Schluss drei bis vier Tropfen Eindeckmittel in jede Vertiefung. Bewahren Sie den Objektträger dunkel bei Raumtemperatur auf, bis er unter einem Mikroskop abgebildet wird.

Entfernen Sie das kultivierte Medium aus jeder der fünf Vertiefungen eines ausgesäten mikroskopischen Objektträgers. Anschließend geben Sie 250 Mikroliter des vorgewärmten Komplettmediums in die Negativkontrollvertiefung und in die zweite Vertiefung mit den unbehandelten Zellen. Behandeln Sie die Zellen in den drei verbleibenden Vertiefungen mit dem vorgewärmten Behandlungsmedium, das 10 mikromolare GnRH FITC enthält.

Inkubieren Sie den Objektträger in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid für eine Stunde. Entfernen Sie anschließend das Medium nur von den behandelten Zellen und waschen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern des vorgewärmten Komplettmediums. Entfernen Sie anschließend das Waschmittel.

Geben Sie dann 250 Mikroliter des vorgewärmten Komplettmediums in jede der drei Vertiefungen. Inkubieren Sie den Objektträger in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid für eine Stunde. Entsorgen Sie nach der Inkubation das Medium aus allen fünf Vertiefungen und waschen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS.

Entfernen Sie dann das PBS und fixieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern Fixierlösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Sie anschließend die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS. Geben Sie 250 Mikroliter Blockierlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Die Blockierungslösung wird aus jeder Vertiefung mit Ausnahme der Negativkontrolle abgesaugt. Nachdem Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS gewaschen haben, geben Sie 250 Mikroliter primäre Antikörperlösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort.

Entfernen Sie Lösungen aus jeder der fünf Vertiefungen und waschen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS. Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie 250 Mikroliter Sekundärantikörperlösung hinzu. Inkubieren Sie den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Aspirieren Sie die Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS. Entfernen Sie das Wasch-PBS und geben Sie dann 250 Mikroliter PBS mit fünf mikromolaren Fluoreszenzsonden in jede Vertiefung. Inkubieren Sie den Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie die Fluoreszenzsondenlösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 250 Mikrolitern PBS. Geben Sie zum Schluss drei bis vier Tropfen Eindeckmittel in jede Vertiefung. Bewahren Sie den Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur auf, bis er unter einem Mikroskop abgebildet wird.

Bilden Sie die Zellen unter einem inversen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ab. Schalten Sie die 488-Nanometer- und die 633-Nanometer-Laser ein. Überprüfen Sie die Laserverstärkung und die Lochblendengröße.

Stellen Sie die Negativkontrollprobe ab. Optimieren Sie das für den Zellkern beobachtete Signal und passen Sie das Signal von FITC und Alexa 546 so an, dass es nahe Null liegt. Anschließend werden die behandelten Proben mit denselben Parametern abgebildet.

Entsorgen Sie das vollständige Medium aus allen sieben Vertiefungen einer ausgesäten Kulturplatte. Geben Sie dann einen Milliliter des vorgewärmten vollständigen Mediums in die negative Kontrollvertiefung und einen Milliliter des vorgewärmten Behandlungsmediums in die verbleibenden sechs Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid für fünf Stunden.

Nachdem Sie das Medium aus allen Vertiefungen entsorgt haben, waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal vorsichtig mit zwei Millilitern PBS. Entfernen Sie das PBS und geben Sie dann 500 Mikroliter Trypsin-EDTA-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen lösen, was etwa 10 Minuten dauert.

Verwenden Sie einen Milliliter des vollständigen Mediums, neutralisieren Sie das Trypsin in jeder Vertiefung und schütteln Sie die Platte. Anschließend suspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren. Übertragen Sie die Suspensionen in separate FACS-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben bei 150-fachem G bei vier Grad Celsius für vier Minuten.

Dekantieren Sie die Überstände vorsichtig. Geben Sie dann 500 Mikroliter eiskaltes PBS in jedes FACS-Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig. Bewahren Sie die Röhrchen bis zur Analyse durch FACS auf Eis auf.

Hier wird die Analyse der GnRH-Aufnahme in Pharynxkarzinomzellen vorgestellt. Die fünfstündige Behandlung mit einem Mikromolaren des Fluoreszenzkomplexes von GnRH führte zu einer leichten, aber unterscheidbaren Aufnahme, die sich als grün fluoreszierendes Signal manifestierte, das in Pharynx-Krebszellen lokalisiert war. Eine zusätzliche Erhöhung der komplexen Dosierung führte zu einer erhöhten Aufnahme, was eine Dosisabhängigkeit der GnRH-Aufnahme in Pharynxkarzinomzellen zeigt.

Die rezeptorabhängige Aufnahme von GnRH und die zelluläre Verteilung des Liganden in seinem Rezeptor in Lungenkrebszellen wurden durch gleichzeitige Behandlung mit fluoreszierendem GnRH-Komplex und Färbung des GnRH-Rezeptors und der Zellkerne vom Typ 1 analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der GnRH-Rezeptor vom Typ 1 mit der Zellmembran assoziiert ist, während das GnRH-Protein in den Zellen internalisiert wird und in deren Zytoplasma verbleibt. Die GnRH-Aufnahme in Pharynxkarzinomzellen wurde ebenfalls mittels FACS-Analyse untersucht.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Aufnahme von GnRH, die beobachtet wurde, wenn Zellen mit einem Mikromolaren GnRH-Konjugat behandelt wurden, stark erhöht war, wenn die auf die Zellen angewendete Dosis auf 10 Mikromolar erhöht wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die behandelten Proben und Fluoreszenzfarbstoffe vor direktem Licht zu schützen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Zellviabilitäts- oder Apoptose-Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie effizient das GnRH-Zielmedikament das Wachstum einer bestimmten Krebsart hemmen kann. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebstherapie, um die Wirksamkeit von GnRH-basierten Wirkstoffverabreichungssystemen in anhaftenden Krebszellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese fluoreszenzmarkierten GnRH-Konjugate verwenden können, um die Anfälligkeit von Krebszellen für GnRH-zielgerichtete Therapien zu untersuchen.