Name: In - vitro - Bildgebung und Quantifizierung des Drug Targeting Efficiency von fluoreszierend markierten GnRH - Analoga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Bildgebung und Quantifizierung von GnRH-Analoga in menschlichen Krebszellkulturen mittels Konfokalmikroskopie und Durchflusszytometrie. Diese Methode unterstützt die Entwicklung gezielter Krebstherapien.

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Das Projekt wurde vom Nationalen Forschungsfonds OTKA (K 104045) unterstützt.

1. Herstellung von Zellkulturen und Reagenzien <ol><li> Pflegen Sie die Zellkulturen in dem vom Hersteller empfohlenen Medium, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und Antibiotika (genannt komplettes Medium). Halten der Zellkulturkolben in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C. Folgen Sie der Proliferation und Konfluenz der Zellen durch inverses Mikroskop (mit 10X Phasenkontrastobjektiv). </li><li> Wenn Zellen ausreichende Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Kultur mit 2-3 ml, sterile phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und 0,5 mL, sterile 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zur Zellkultur und Inkubation bei 37 ° C, bis die Zellen lösen (ca. 10 min). </li><li> Die Zellen in 3-4 ml sterile Komplettmedium Trypsin zu stoppen und sie in ein steriles Zentrifugenröhrchen übertragen. Zentrifugieren der Zellen bei 150 g für 4 min bei Raumtemperatur (RT). Überstand vorsichtig verwerfen und die Aussetzung der pEllet in 2-3 ml sterile Komplettmedium. </li><li> Nehmen Sie 100 ul der Zellsuspension und mischen sich mit 100 ul 0,4% (m / V) Trypanblaulösung, die toten Zellen zu färben. Last 10 ul dieser Mischung in einem Hämozytometer und bestimmen die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch inverses Mikroskop. </li><li> Verdünne die erforderliche Menge an Zellsuspension hergestellt in Schritt 1,3 bis 10 ml mit sterilem Komplettmedium, enthaltend 4 x 10 4 Zellen / mL. </li><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Vertiefung (10 4 Zellen / Vertiefung) in sieben Vertiefungen der ersten Glasboden 8-well Objektträger. Verwenden Sie diese Folie in der GnRH-Aufnahme-Methode. </li><li> In 250 ul der Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Vertiefung (10 4 Zellen / Vertiefung) in fünf Vertiefungen der zweiten 8-Well - Objektträger. Diese Folie wird in der GnRH-IR Expressionsverfahren verwendet werden. </li><li> 1 ml Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Mulde (4 x 10 4 Zellen / Vertiefung) in sieben wells einer 12-Well-Platte. Diese Platte wird in der GnRH Quantifizierungsverfahren eingesetzt werden. </li><li> Lassen Sie die Zellen auf den beiden Objektträger und der Platte haften. Inkubieren sie in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 48 h. </li><li> Nach der Inkubation überprüfen Sie die Zellen durch inverses Mikroskop (10fach Phasenkontrastobjektiv verwendet wird). Wenn die Zellen gesund und befestigt sind, mit den folgenden Schritten fort. </li><li> Herstellung von 10 mM GnRH-FITC - Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) von jedem der drei Konjugate 18. (Verwenden Sie diese Verdünnung Konzentrationen: 16,43 ug / ul [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 ug / ul [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II und 16.47 ug / ul [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Bewahren sie diese Stammlösungen in einem dunklen Ort bei RT und innerhalb von ein paar Wochen. </li><li> Verdünnen Sie 1,7 ul jeder der drei 10 mM GnRH-FITC-Stammlösungen in 1,7 ml Vollmedium. Schütteln Sie diese Lösungen. (These sind die 10 uM GnRH-FITC Medien zu behandeln.) verdünnt 150 &amp; mgr; l jeder der drei 10 uM GnRH-FITC Behandlungsmedium in 1,35 ml vollständigem Medium. Schütteln diese Lösungen als auch (dies sind die 1 uM GnRH-FITC Behandlungsmedium). HINWEIS: Alle GnRH-FITC Behandlungsmedium enthalten, sollten vor Licht und innerhalb von wenigen Stunden geschützt werden. </li><li> Vorwärmen der sechs GnRH-FITC Behandlungsmedium (hergestellt in Schritt 1.12) und 4 ml vollständigem Medium bis 37 ° C. </li><li> Verdünnte 3 ul 5 mM fluoreszierenden Sondenlösung (nuclear Gegenfärbemittel in der Materialliste angegeben) in 3 ml PBS auf 5 &amp; mgr; M. Diese Lösung sollte vor Licht geschützt werden, ist es bei RT halten und es innerhalb weniger Stunden verbrauchen. </li></ol> 2. konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) <ol><li> GnRH - Aufnahme - Methode <ol><li> Nehmen Sie die erste in Schritt hergestellten Objektträger 1.6 und Pipette aus dem vollständigen Medium aus jedem der sieben gut. In 250 ul vorgewärmte komplett medium in die erste gut. Verwenden Sie diese als negative Kontrolle. Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l des vorgewärmten GnRH-FITC Behandlungsmedien (von 1,13) zu jedem der nächsten sechs Vertiefungen (3 Vertiefungen mit 1 &amp; mgr; M und 3 mit 10 &amp; mgr; M). Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 5 h. </li><li> Pipette aus dem Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. Fügen Sie 250 ul der Fixier-Lösung (10% neutral gepuffertem Formalin) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min. </li><li> Pipette aus der Fixier-Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das 5 uM Fluoreszenzsonde Lösung, hergestellt in Schritt 1.14 in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min. </li><li> Pipette aus der Fluoreszenzsonde Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die zweimal Zellen mit 250 &amp; mgr; l PBS vorsichtig. 3-4 Tropfen Eindeckmedium in jede Vertiefung, endlich. Halten Sie die Folie in Dunkeln bei RT bis zur Bildgebung. </li&gt; </ol></li><li> GnRH-IR - Expressionsverfahren <ol><li> Nehmen Sie die zweite 8-Well-Dia mikroskopisch in Stufe 1.7 und Pipette aus dem vollständigen Medium aus jedem der fünf Brunnen. </li><li> In 250 ul vorgewärmte Komplettmedium in den ersten gut, verwenden Sie diese als negative Kontrolle. In 250 ul vorgewärmte Komplettmedium in die zweite gut zu, und verwenden Sie diese GnRH-IR-Expression vor der GnRH-Behandlung zu untersuchen. </li><li> In 250 ul jeder der drei vorgeheizten 10 uM GnRH-FITC Behandlung von Medien in den nächsten drei Brunnen. Verwenden Sie diese Vertiefungen, die die Zellen mit GnRH-FITC-Konjugate vorzubehandeln, bevor der GnRH-IR-Expression zu untersuchen. Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 1 h. </li><li> Pipette über das Behandlungsmedium aus jeder der drei Vertiefungen, die verwendet wird, GnRH-IR-Expression nach der GnRH-Behandlung zu untersuchen und zu waschen, diese Vertiefungen mit 250 &amp; mgr; l vorgewärmtem komplettem Medium. In 250uL vorerhitzt Komplettmedium in jede der drei Vertiefungen. Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 1 h. </li><li> Pipette über das Medium aus jedem der fünf Vertiefungen und wasche die Zellen mit 250 &amp; mgr; l PBS. Fügen Sie 250 ul der Fixier-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min. </li><li> Pipette aus der Fixier-Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 &amp; mgr; l PBS. In 250 ul PBS, das 5% Rinderserumalbumin (BSA) Blocking-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h. </li><li> Verdünne 10 &amp; mgr; l von GnRH-IR primären Antikörper in 1 ml PBS (1: 100-Verhältnis). Halten Sie es bei RT und verwenden Sie es innerhalb von wenigen Stunden. </li><li> Pipette aus der BSA Blocking-Lösung aus jeder Vertiefung mit Ausnahme der Negativkontrolle (erste gut). Waschen Sie die Zellen mit 250 &amp; mgr; l PBS (mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefung). In 250 ul PBS, die GnRH-IR primäre in Schritt 2.2.7 in eac vorbereitet Antikörperh gut (mit Ausnahme der Negativkontrolle). Inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h in einem dunklen Ort. </li><li> Verdünne 2,5 &amp; mgr; l Alexa 546 markierten sekundären Antikörper in 1,25 ml PBS (1: 500-Verhältnis). HINWEIS: Diese Lösung sollte vor Licht geschützt werden, ist es bei RT halten und es innerhalb weniger Stunden verbrauchen. </li><li> Pipette aus Lösungen von jedem der fünf Brunnen und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das AF-546 markierten Sekundär in Schritt hergestellten Antikörper 2.2.9 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h in Dunkelheit. </li><li> Pipette aus der Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das 5 uM Fluoreszenzsonde Lösung, hergestellt in Schritt 1.14 in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie für 10 min bei RT. </li><li> Pipette aus der Fluoreszenzsonde Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die zweimal Zellen mit 250 &amp; mgr; l PBS vorsichtig. 3-4 Tropfen Eindeckmittel in jede Vertiefung, danach. Halten Sie die Folie in dunklenbei RT bis zur mikroskopischen Abbildung. </li></ol></li><li> Imaging <ol><li> Bild die Zellen durch invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (mit 63X -Ölimmersionsobjektiv) <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Anregungs- / Emissionswellenlängen. GnRH-Konjugate: 488/514 nm, Alexa 546 markierte Antikörper: 488/546 nm (Verwendung nur für die GnRH-IR-Expression-Methode), DRAQ5 Fluoreszenzsonde: 633/680 nm. </li><li> Stellen Sie die Bildparameter, die negativen Kontrollzellen verwendet wird. Verwenden Sie diese Parameter zu Bild behandelten Zellen (Abbildung 3). Nachjustieren Abbildungsparameter auf jedem Objektträger zu Beginn der Analyse. Feinabstimmung und Export von Bildern mit der Software, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt, wenn nötig. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> GnRH Quantifizierungsmethode <ol><li> Nehmen Sie die Platte in Stufe 1.8 und Pipette aus dem vollständigen Medium von each der sieben Brunnen. 1 ml vorgewärmten Komplettmedium in den ersten gut. Verwenden Sie diese als negative Kontrolle. 1 ml jeder der sechs vorgewärmten Medien (3 Vertiefungen mit 1 &amp; mgr; M und 3 Vertiefungen mit 10 &amp; mgr; M) in den nächsten sechs Vertiefungen behandeln. Inkubieren der Platte in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 5 h. </li><li> Pipettieren Sie das Medium aus jedem Well. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS vorsichtig. Fügen Sie 500 ul von Trypsin-EDTA-Lösung in den einzelnen Wells. Inkubieren der Platte bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen (etwa 10 min). </li><li> 1 ml komplettes Medium in jedem Well Trypsin zu stoppen. Schütteln Sie die Platte. Suspend die Zellen vorsichtig mit einer Pipette, und übertragen Sie die Suspension aus jeder Vertiefung in FACS-Röhrchen. Zentrifugiere die Röhrchen bei 150 xg für 4 min, bei 4 ° C. </li><li> Gießen Sie die Überstände vorsichtig heraus, mit einem Zug. In 500 ul eiskaltem PBS in jedes Röhrchen FACS und die Zellen vorsichtig wieder auszusetzen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis bis zum Endedes Experiments. </li></ol></li><li> Analyse und Berechnung <ol><li> Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Zur Anregung verwenden 488 nm Argon-Laser-Wellenlänge und für die Detektion 530 nm Wellenlänge verwenden. Stellen Sie den Durchflusszytometer Parameter nach oben durch die negativen Kontrollzellen ausgeführt wird. Verwenden Sie diese Parameter zu behandelten Zellen (4A) zu analysieren. Werten Sie die Daten mit der Software des Herstellers bestimmen mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) Werte und berechnen die relativen MFI-Werte. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hierin beschriebenen Experimente selektiv markierten GnRH-Analoga für das Screening adhärenten verwenden Zellkulturen in vitro. Konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie Methoden geeignet sind zum Verfolgen und Quantifizierung der zellulären Aufnahme dieser GnRH-FITC-Konjugate in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise. Diese Experimente haben die folgenden kritischen Schritte: 1) halten eine sterile, gesunde Zellkultur; 2) GnRH Peptide müssen von hoher Qualität sein; 3) angemess...

<html> Peptid - basierten gezielten Wirkstoffabgabesysteme haben eine schnelle Entwicklung und vielversprechender Bereich in der Krebstherapie in den letzten Jahren zu 1, 2. Menschliche Gonadotropin - Releasing - Hormon - Rezeptor Typ I (GnRH-IR) wird in erster Linie in der Hypophyse befindet , sondern auch in verschiedenen anderen Geweben , die für die Selbstreproduktion 3 verantwortlich sind. GnRH-IR ist auch in einer Reihe von Krebsgewebe, im Zusammenhang oder in keinem Zusammenhang mit dem Fortpflanzungssystem 4, 5 ausgedrückt. Die hohe Expression von GnRH-IR bei verschiedenen malignen Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Geweben bietet die Möglichkeit für eine zielgerichtete Therapie 5, 6. Viele Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Analoga wurden in den letzten Jahrzehnten entwickelt, die als Targeting-Einheiten verwendet werden könnte,f &quot;&gt; 7, 8, 9. Diese Peptide sind in der Lage Antikrebsmittel mit hoher Selektivität in maligne Tumorzellen zu liefern , die überexprimieren GnRH-IR 6. Mehrere GnRH konjugierten anti-Tumor - Arzneimittel mit höherer Selektivität und eine bessere Wirksamkeit als das entsprechende nicht - konjugiertem freie Arzneimittel wurden 7 berichtet, 8, 9. Zurück Publikationen zu GnRH - Peptide und deren Rezeptoren berichtet , dass die GnRH-IR verschiedene Konformationen annehmen kann , die unterschiedliche Selektivität für GnRH - Analoga 10. Die hochvariable GnRH-IR ist komplex und verschiedene Signalwege mit unterschiedlichen Aktivität gegen ihre natürlichen und künstlichen Liganden 11 dotiert. Diese Tatsachen machen Untersuchung von GnRH-basierte Systeme eine Herausforderung. Auf der anderen Seite, die<html> y besitzen vielversprechendes therapeutisches Potential. Mehrere Experimente mit radioaktiv markierten GnRH - Peptide zuvor 12 gemeldet wurden, 13, 14, 15, aber Versuche , bei denen fluoreszenzmarkierte wurden GnRH - Analoga verwendet werden , sind noch begrenzt. Während die radioaktive Markierung eine hohe Empfindlichkeit bietet, hat die Fluoreszenzmarkierung einige andere Vorteile, beispielsweise die einfachere Handhabung und die Möglichkeit, mit unterschiedlichen Fluorophoren Gegenfärbung. Drei gemeinsame GnRH - Analoga , die erfolgreich für die Arzneimittelzufuhr verwendet wurden , sind die [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II und GnRH-III, aber die Wirksamkeit dieser Peptide als Targeting - Einheiten ist , selten 16 verglichen wird , 17. Auf der anderen Seite ergibt sich aus verschiedenen Experimenten, in denen verschiedene Krebszellen und GnRH-Analoga verwendet wurden, ist vielfältig. ntent &quot;&gt; Basierend auf diesen Überlegungen konzentrierten wir uns auf die Tumor - Targeting und Arzneimittelabgabepotential dieser GnRH - Peptiden und dadurch synthetisiert und charakterisiert den [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II und [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III 18 - Peptid - Konjugate dieser Analoga sind mit FITC an der Seitenkette ihrer Lys oder D-Lys (Peptid-FITC Verhältnis 1 selektiv markiert: 1 bei jedem. Konjugat). die Idee war, dass die selektive Fluoreszenzmarkierung neue Informationen über diese Peptide bieten können, und ermöglicht ihre gute Tracking und zuverlässige Quantifizierung. Diese Konjugate haben eine sichere Handhabung und zuverlässige Erkennbarkeit, die es einfacher machen, ihre Tumor-Targeting die Effizienz zu vergleichen, und die Screening von zahlreichen Arten von bösartigen Tumorzellen. Wir hoffen, dass auf dem neuesten Stand Experimente mit diesen Peptid-Konjugate auf die Entwicklung neuer Krebs beitragen könnten, GnRH-Wirkstoff-Konjugate Targeting und dazu beitragen, neue therapeutische Teer zu identifizierenals auch bekommt. Die vorliegende Manuskript zeigt einige gut reproduzierbare und schnelle Experimente mit GnRH-FITC-Konjugate. Die Zelloberflächenexpression von GnRH-R ist eine bestimmend Bedingung hinsichtlich GnRH-Aufnahme, daher gleichzeitig wir die Zelloberflächenniveau GnRH-IR auf den getesteten Zelllinien untersucht. Wir visualisiert die GnRH-IR und GnRH-FITC-Konjugate durch konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM) und quantifiziert die zelluläre Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate unter Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS).

<table><tbody><tr><td>EBC-1</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0820</td><td>Plattenepithelkarzinom der menschlichen Lunge</td></tr><tr><td>BxPC-3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td>Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse</td></tr><tr><td>Detroit-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-138</td><td>Pharynxkarzinom beim Menschen</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Kulturmedium für BxPC-3-Zellen</td></tr><tr><td>Eagle's Minimum Essential Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-611F</td><td>Kulturmedium für EBC-1-Zellen und ergänzt mit 0,1 % Natriumpyruvat für Detroit-562-Zellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Euro Klon</td><td>ECS0180L</td><td>Ergänzt das Kulturmedium</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-CL&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VZA-2012</td><td>Ergänzt das Kulturmedium (Antibiotika)</td></tr><tr><td>Standardlinien-Zellkulturflaschen</td><td>VWR</td><td>10062-872</td><td>Bieten eine konsistente, sterile Wachstumsumgebung für Zellen</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Mischung&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>Anhaftende Zellen entfernen</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4</td>%<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Wird zum Zählen von Zellen</td></tr> <tr><td>verwendet[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I</td><td>von uns</td><td>- </td><td>Reinheit &ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II</td><td>aus</td><td></td> <td>uns-Reinheit &ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>[Lys8(FITC)]-GnRH-III</td><td>hergestellt von</td><td></td> <td>uns-Reinheit &ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>Glasboden 8-Well-Objektträger</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Verwendung im CLSM-Experiment</td></tr><tr><td>Corning Costar Zellkulturplatte, 12 Well</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3513-50EA</td><td>Verwendung im FACS-Experiment</td></tr><tr><td>Fixierlösung (10% neutral gepuffertes Formalin)</td><td>Bio-Optica</td><td>01V60P</td><td>Fixieren adhärente Zellen</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td>Verhindern Sie die unspezifische Bindung der Antikörper</td></tr><tr><td>GnRHR-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>19950-1-AP</td><td>Immunzytochemie-Reagenz, binden Sie an die menschlichen Typ-I-GnRH-Rezeptoren</td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 546-Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11035</td><td>Immunzytochemisches Reagenz, binden Sie an den primären Antikörper</td></tr><tr><td>Fluoreszenzsondenlösung (Draq5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62254</td><td>Gegenfärbung von Zellkernen</td></tr><tr><td>Fluoromount Wässriges Eindeckmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td>Verwendung im CLSM-Experiment, Erhaltung der Fluoreszenz</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Elektro-Optika Ltd.&nbsp;</td><td>Alpha XDS-2T</td><td>Überprüfung des Phänotyps und der Konfluenz von Zellkulturen</td></tr><tr><td>Inverses konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM-710</td><td>Verwendung im CLSM-Experiment</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td>Verwendung im FACS-Experiment</td></tr></tbody></table>

in - vitro - bildgebung und quantifizierung des drug targeting efficiency von fluoreszierend markierten gnrh - analoga

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

GnRH-Analoga sind effektive Targeting-Einheiten und in der Lage Anti-Krebs-Mittel, die hoch express GnRH-Rezeptoren selektiv in malignen Tumorzellen zu liefern. Allerdings sind die quantitative Analyse der GnRH-Analoga &quot;zelluläre Aufnahme und die untersuchten Zelltypen in GnRH-basierten Wirkstoffabgabesysteme derzeit begrenzt. Zuvor eingeführt, selektiv markierte fluoreszierende GnRH-I, -II und -III-Derivate bieten große Nachweisbarkeit, und sie haben geeignete chemische Eigenschaften für reproduzierbare und robuste Experimente. Wir fanden auch, dass die entsprechenden up-to-date Methoden mit dieser markierten GnRH-Analoga neue Informationen über die GnRH-basierte Drug-Delivery-Systeme bieten konnte. Dieses Manuskript stellt einige einfache und schnelle Experimente in Bezug auf die zelluläre Aufnahme von [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II und [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III auf der EBC-1 (Lunge), die BxPC-3 (Pankreas) und auf der Detroit-562- (Pharynx) maligne tumor Zellen. Parallel zu diesen GnRH-FITC-Konjugate wurde die Zelloberflächenpegel von GnRH-I-Rezeptoren auch auf diese Zelllinien untersucht vor und nach der Behandlung durch GnRH konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Die zelluläre Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate wurde durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung quantifiziert. In diesen Experimenten geringfügige Unterschiede zwischen den GnRH-Analoga und die wichtigsten Unterschiede zwischen den Zelltypen beobachtet. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Zelllinien sind mit ihrer ausgeprägten Maß an Zelloberflächen-GnRH-I-Rezeptoren korreliert. Die vorgestellten Experimente enthalten praktische Methoden zu visualisieren, zu quantifizieren und die Aufnahmeeffizienz von GnRH-FITC-Konjugate in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise auf verschiedenen adhärenten Zellkulturen vergleichen. Diese Ergebnisse könnten die Drug-Targeting-Effizienz von GnRH-Konjugate auf der gegebenen Zellkultur vorhersagen, und bieten eine gute Grundlage für weitere Experimente bei der Untersuchung von GnRH-basierte Drug-Delivery-Systeme.

Bilder von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) bieten spektakuläre Informationen über die Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate auf der gegebenen Zellkultur in einer Zeit und konzentrationsabhängig. Parallel zu diesen GnRH-FITC-Konjugaten ist die Anwesenheit des GnRH-IR von der Zelloberfläche auch überprüfbare durch die CLSM Experiment. Weiterhin kann durch eine weit rote Färbung DNA Fluoreszenzsonde verwendet wird, ist es möglich, die Kerne von Zellen neben GnRH und GnRH-IR zur Gege...

Selektiv markierte fluoreszierende GnRH-I, -II und -III - Derivate sind zuverlässige Werkzeuge für die Verfolgung und ihre zelluläre Aufnahme zu quantifizieren. Diese Handschrift stellt Experimente zu visualisieren, zu quantifizieren und die Aufnahmeeffizienz dieser GnRH-Konjugate in verschiedenen Zelllinien zu vergleichen.

In - vitro - Bildgebung und Quantifizierung des Drug Targeting Efficiency von fluoreszierend markierten GnRH - Analoga

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirksamkeit von auf GnRH basierenden Arzneimittelabgabesystemen in menschlichen Krebszellkulturen zu untersuchen und vorherzusagen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der gezielten Antikrebstherapie zu beantworten, beispielsweise wie effizient Zellen verschiedener menschlicher Krebsarten GnRH-gezielte Antikrebsarzneimittel aufnehmen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass neuartige fluoreszenzmarkierte GnRH-Analoga verwendet werden, die die gleichzeitige Anwendung von konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie-Analyse ermöglichen.Die Bedeutung dieser Technik reicht in die Krebstherapie hinein, da GnRH-Rezeptoren auf mehreren Krebszelltypen stark exprimiert sind und dadurch eine gezielte Anbindung an diese ermöglichen. Bianka Gurbi, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Beginnen Sie damit, das Kulturmedium von jedem der sieben Vertiefungen einer bebrüteten mikroskopischen Objektträgerplatte zu entfernen.Anschießend 250 µL des vorgewärmten kompletten Mediums in das Negativkontroll-Loch und jeweils 250 µL des vorgewärmten GnRH-fit-Saatgutbehandlungsmediums in die v

in-vitro-imaging-quantification-drug-targeting-efficiency

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf...

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erforderlich sind, um die ex vivo-Validierung von in vivo Nahinfrarot-Fluoreszenz-Xenotransplantat-Bildgebungsexperimenten an Mäusen unter Verwendung von Fluorophor-markierten Nanobodies und konventionellen Antikörpern durchzuführen.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von fluoreszierend markierten Verbindungen in und zwischen den Geweben oder den Behandlungsgruppen. Umgekehrt Histologie quantitative Fluoreszenz, während mehr arbeitsintensiv, ermöglicht die Quantifizierung der absoluten Gewebespiegel von markierten Molekülen.

Die Verwendung von Ex Vivo Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Bild-Zellen, die das grün fluoreszierende Protein-markierten Angiotensin Typ 1a-Rezeptoren während der Endozytose durch Angiotensin-II-Behandlung eingeleitet werden. Diese Technik beinhaltet die Kennzeichnung Lysosomen mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, und dann Software die Co-Lokalisierung des Rezeptors und Lysosom in drei Dimensionen über die Zeit zu analysieren, verwendet.

Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt Konfokalmikroskopie Nachweis von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Internalisierung in Säugerzellen. Es umfasst die Grundzellkultur, Transfektion und Konfokalmikroskopie Verfahren und stellt ein effizientes und leicht interpretierbares Verfahren, die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von Fusion exprimierten GPCR zu detektieren.

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Wir beschreiben ein Protokoll für die präklinische in Vivo Verfolgung von Krebsmetastasen. Es basiert auf einem Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter Kombination von Natrium Iodid Symporter, entdeckt nichtinvasive [18F] Tetrafluoroborate-PET, und ein fluoreszierendes Protein für optimierte ex Vivo Bestätigung. Die Methode ist anwendbar für präklinische in Vivo Zelle tracking über Tumorbiologie.

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Orthotopen intrakraniellen Injektion von Tumorzellen wurde in der Krebsforschung zur Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen Fluoreszenz Molekulare Tomographie der Tumor Xenografts vorsieht, dass Echtzeit-intravitalen Bildgebung und Quantifizierung eines Tumors in präklinischen Glioblastom Modelle Masse.

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Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

GPCR----Arrestin-Wechselwirkungen sind ein aufstrebendes Feld in GPCR-Medikamentenentdeckung. Genaue, präzise und einfach einzurichtende Methoden sind notwendig, um solche Wechselwirkungen in lebenden Systemen zu überwachen. Wir zeigen einen strukturellen Komplementierungstest zur Überwachung der GPCR----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit lebenden Zellen und können auf jede GPCR erweitert werden.

Überwachung von GPCR---Arrestin1/2-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung

Wir beschreiben Protokolle zur Bewertung des Grades der Transduktion durch zelldurchdringende Peptide unter Verwendung von Ex-vivo-Bildgebungssystemen, gefolgt von Paraffineinbettung, Schnitt- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie am Beispiel von Kardial-Targeting-Peptid. In unserem Protokoll kann ein einzelnes Tier verwendet werden, um beide Arten der bildgebenden Bewertung der gleichen Organe zu erwerben, wodurch die Anzahl der Tiere, die für Studien benötigt werden, um die Hälfte wird.

In Vivo Imaging von Transduktionseffizienzen des Kardialen Peptids

Erfahren Sie die Bildgebung und Quantifizierung von GnRH-Analoga in menschlichen Krebszellkulturen mittels Konfokalmikroskopie und Durchflusszytometrie. Diese Methode unterstützt die Entwicklung gezielter Krebstherapien.

In - vitro - Bildgebung und Quantifizierung des Drug Targeting Efficiency von fluoreszierend markierten GnRH - Analoga

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