Name: Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Erfahren Sie das WinCF-System zur Simulation der Lungenumgebung für Mikrobiologie-Forschung bei Mukoviszidose. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften in verstopften Bronchiolen.

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Die Autoren möchten die Vertex Pharmaceuticals und den Cystic Fibrosis Research Innovation Award für die Finanzierung von R. Quinn und der NIH / NIAID zur Finanzierung von 1 U01 AI124316-01, einem systembiologischen Ansatz zur Behandlung von Multi-Arzneimittelresistente Pathogenen, anerkennen. Wir danken auch der Abteilung für Mechanische und Luft- und Raumfahrttechnik bei UCSD&#39;s Undergraduate Maschinenbau Senior Design Design für die Erleichterung der Zusammenarbeit mit den technischen Aspekten dieser Arbeit.

1. Herstellung von Aktien für die Artificial Sputum Medien <ol><li> Erstellen Sie eine 5% Mucin Lösung. Hinzufügen 1,0 g entwässertes Schweinemagen zu 20 ml entionisiertem Wasser Mucin. Autoclave die resultierende Lösung. HINWEIS: Die Mucin-Sterilisation wird seine inhärente Struktur zerstören; andere Verfahren, die die Muzin in ihrer trockenen Form umfassen UV-Bestrahlung und Sterilisation zu sterilisieren. Diese Verfahren sind nicht für das WinCF System jedoch ausgiebig genutzt. </li><li> In 2,2 g KCl auf 50 ml entsalztem Wasser und lassen für die Auflösung. Hinzufügen von 5,0 g NaCl zu 50 ml entionisiertem Wasser und ermöglichen für die Auflösung. Autoclave diese beiden Lösungen. </li><li> Je 100 mg Lachssperma-DNA zu 10 ml sterilem deionisiertem Wasser. Erhitzen Sie diese Lösung auf etwa 85 ° C in einem Wasserbad für einige Stunden Auflösung zu gewährleisten. </li><li> Hinzufügen 5,0 mg Ferritin bis 5,0 ml sterilem deionisiertem Wasser. </li></ol> 2. Herstellung des künstlichen Sputum Medium <ol><li> KombinierenDie folgenden Komponenten: 16 ml Mucin-Stammlösung, 2,0 ml KCl-Stammlösung, 2,0 ml NaCl-Stammlösung, 200 μl Eigelb-Emulsion, 5,6 ml DNA-Stammlösung, 120 μl Ferritin-Stammlösung, 5,78 ml essentiell Aminosäurelösung, 5,78 ml nicht essentielle Aminosäurelösung und 2,44 ml steriles Wasser. <ol><li> Wenn kleine Mengen von Sediment erscheinen, schütteln Sie sanft zu mischen. </li><li> Pipettieren Sie 5,0 ml Medium in acht sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die chemischen Bedingungen jedes Röhrchens können wie gewünscht manipuliert werden. Zum Beispiel können Pufferlösungen und pH-Indikatoren zu jedem Röhrchen hinzugefügt werden, um das mikrobielle Verhalten bei verschiedenen pH-Werten zu vergleichen. Eine Demonstration hiervon zeigt sich im repräsentativen Ergebnisbereich mit 8 verschiedenen pH-Werten von 5,0 bis 8,5 in 0,5 pH-Schritten. </li></ol></li><li> Sobald die chemischen Bedingungen der Medien erfolgreich manipuliert sind, frieren Sie für spätere Verwendung. Die Medien bleiben stabilZen bei -20 ° C für mehrere Monate. Vortex beim Auftauen. </li></ol> 3. Vorbereitung eines Kontrolllaufs der Kapillarrohre <ol><li> In einem sterilen Biohood füllen Sie acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 250 μl Medium. </li><li> Erwerben Sie acht weitere sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei jedes Röhrchen einem in Schritt 3.1 genannten Mikrozentrifugenröhrchen entspricht. <ol><li> Sterilisieren Sie ein Papiertuch mit 70% iger Ethanol-Lösung und trocknen lassen. Sobald es getrocknet ist, reißen Sie das Handtuch in Stücke von etwa vier Quadrat-Zoll und zerbröckeln jedes Stück in der Unterseite eines 15-ml-Zentrifugenröhrchens. Für zusätzliche Röhrchen, Spray und trockene zusätzliche Papiertücher nach Bedarf. </li><li> Mit einem Klumpen Papier an der Unterseite jedes Zentrifugenröhrchens, dämpfen Sie jeden Papierklumpen mit ca. 1,0 ml sterilem Wasser, um eine feuchte Umgebung zu erzeugen. </li></ol></li><li> Erhalten Sie drei Glas-Kapillarröhrchen für jedes in Schritt 3.1 hergestellte Mikrozentrifugenröhrchen und einen Block aus Kapillarrohr-Kitt SealaNt </li><li> Für jedes Mikrozentrifugenröhrchen füllen Sie drei Kapillarrohre mit Medien bis etwa 5 mm von der blauen Markierung in der Nähe der Oberseite des Röhrchens ab. <ol><li> Füllen Sie, indem Sie ein Ende des Rohres im Mikrozentrifugenröhrchen halten und in Richtung der horizontalen Ausrichtung kippen, so dass Kapillarwirkung das Medium in das Röhrchen führen kann (siehe Abbildung 1 ). </li><li> Stoppen Sie die Füllung, indem Sie sanft einen Handschuh über das offene Ende des Rohres legen und dann das andere Ende des Rohres abdichten, indem Sie es in den Dichtungsblock drücken. </li></ol></li><li></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> Abbildung 1: Beispiel pH-Gradient, Füllen Kapillarrohr mit künstlichem Sputum Medium. Das Medium wird durch Einsetzen eines Endes des Röhrchens in die Flüssigkeit und Kippen hinzugefügt, um die Kapillarwirkung zu erleichtern. Die mittlere Färbung in diesem Beispiel ist aufgrund der pH-Indikator hinzugefügt, um Dämon zu helfenNach der Inkubation potenzielle Säureänderungen durchführen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="5"><li> Legen Sie jeden Satz von drei Kapillarröhrchen in 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit Papiertüchern gefüllt sind, die vollständig mit sterilem Wasser angefeuchtet wurden, Kitt-versiegelte Seite nach unten. Kappe die Tube und Etikett. Diese drei Kapillarröhren dienen zur Replikation jeder Kontrollbedingung. </li><li> Wenn alle 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit den dafür vorgesehenen Kapillarrohren gefüllt sind, legen Sie die Röhrchen in einen Halterahmen. Stellen Sie das Gestell so auf, dass die Röhrchen horizontal inkubiert werden (um Gasblasen zu fangen) (siehe Abbildung 2 ). Inkubieren Sie die Kapillarröhrchen innerhalb der Zentrifugenröhrchen (mit den befeuchteten Papierklumpen) bei 37 ° C für 48 h. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beispiel pH - Gradient, Kapillarröhrchen Bereit Inkubation. Sobald drei Kapillarröhrchen gefüllt wurden und versiegelt, werden sie in einem Zentrifugenröhrchen mit einem feuchten Papiertuch an der Unterseite angebracht. Dieses Rohr wird dann verschlossen und in ein Gestell gelegt. Das Rack muss während der Inkubation orientiert seitwärts, wie hier dargestellt, so dass die Gasproduktion beobachtet werden kann, sobald die Inkubation abgeschlossen ist. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 4. Imaging der Kontroll Kapillarröhrchen nach Inkubation <ol><li> Entfernen Sie die Ständer von Zentrifugenröhrchen aus dem Inkubator, um sicherzustellen, die Rohre horizontal zu halten. gleiten sorgfältig die Kapillarröhren aus den Zentrifugenröhrchen, wobei jeder Satz aus drei getrennt von anderen Sätzen zu halten. </li><li> Ordne die Kapillarröhren nebeneinander auf einem Leuchtkasten, alle aufgereiht, so dass der Inhalt der Röhren sind visUnd beleuchtet Lassen Sie eine Lücke alle drei Röhren, um verschiedene chemische Bedingungen zu trennen. </li><li> Mit den Rohren ausgerichtet und lightbox eingeschaltet, foto von oben oben. (Siehe Abbildung 3 ) </li></ol><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiel pH-Gradient, Kontrolllauf, Vorinkubation, kein Sputum hinzugefügt. Künstliches Sputum-Medium nach der Zugabe zu Kapillarröhrchen in Sätzen von drei, Erhöhung des pH-Werts von links nach rechts. Die Kombination der Indikatoren, die dem Medium hinzugefügt wurden, führt zu mehr sauren Röhrchen, die mehr gelb erscheinen, während weniger saure Röhrchen lila werden. Die Rohre sind horizontal angeordnet und werden von unten beleuchtet, von oben fotografiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> EntsorgenKontrollmaterialien in biologischen Abfällen. </li></ol> 5. Inokulation des WinCF Kapillarröhrchen mit einem Sputumprobe <ol><li> In einem sterilen biohood füllt acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit 225 &amp; mgr; l Medium pro Person. </li><li> Homogenisieren der Sputumprobe durch Herausziehen und Auswerfen des Sputums wiederholt mit einer 3 ml-Spritze (eine Plastikspritze ohne Nadel). Tun Sie dies, bis der Auswurf der glatten Konsistenz ist. </li><li> Zugabe von 25 &amp; mgr; l Sputum homogenisierte zu jedem Reaktionsgefäß (1/10 Verdünnung in ASM media), hergestellt in Schritt 5.1. Dann vortexen die Röhrchen für 30 s ausreichend zu mischen. </li><li> Fügen Sie die Medien Kapillaren nach dem gleichen Verfahren wie 3.2 bis 3.5 Schritte. </li></ol> 6. Imaging von Probe Kapillarröhrchen nach Inkubation <ol><li> Nach der Inkubationszeit von 48 h, entfernen und Bild der Kapillarröhrchen nach dem gleichen Verfahren wie die Schritte 4.1 bis 4.3. </li><li> Wenn Luftblasen in den Rohren vorhanden sind, machensicher, dass die zeigen aufgenommenen Fotografien deutlich die Abgrenzung zwischen den Blasen und Medien in den Rohren. Wenn Biofilm vorhanden ist, stellen Sie sicher, dass die Fotos eindeutig seine Präsenz als auch darstellen kann. </li></ol> 7. Entfernen von Medien für Downstream-Anwendungen <ol><li> Zur Erleichterung des Downstream-Analyse, entfernt die Medien aus den Kapillarröhrchen nach der Bebilderung. Mögliche Anwendungen umfassen die Kultivierung und DNA / RNA-Sequenzierung und metabolomic Profilierung. Achtung: Die Glaskapillarröhren gefüllt mit Krankheitserregern sind ein bedeutender Biohazard, so müssen diese Schritte sehr sorgfältig mit der speziellen Ausrüstung durchgeführt werden. Wenn Kapillaren brechen, entsorgen Behälter richtigen Biohazard sharps. </li><li> Verwenden blunt ended Nadeln von 25 Gauge und 0,5 Zoll in der Länge, die Medien zu entfernen. Legen Sie die blunt ended Nadel in das verstopfte Ende der Röhre um die Dichtung zu brechen. </li><li> Nachdem die Dichtung zu brechen, drehen das Kapillarrohr den Kopf und die Medien aus dem oberen Teil heraustropfen. ichWenn die Medien nicht leicht abtropfen, verwenden Sie eine Pipette mit einer 200 μl Spitze und vertreiben Sie das Medium aus dem Schlauch heraus, indem Sie den Pipettenkolben nach unten drücken, wenn er in das Ende des Kapillarrohres eingeführt wird. Das ausgestoßene Röhrchenmedium in einem geeigneten Behälter (1,5 mL Zentrifugenröhrchen) sammeln. HINWEIS: Für die transkriptomische oder andere RNA-Analyse können die Medien direkt in RNA-stabilisierende Puffer ausgewiesen werden. </li></ol> 8. Das WinCF FLUD System HINWEIS: Das WinCF Fluid Loading Utility Device (FLUD) System ist eine optionale Suite von komplementären Geräten zur Optimierung des Durchsatzes des WinCF Systems. Das WinCF FLUD System besteht in erster Linie aus 3D bedruckbaren Materialien. 3D gedruckte Fertigung ermöglicht einen schnellen und einfachen Austausch von Materialien, um minimale Ausfallzeiten für Forscher sowie minimale Fertigungsanforderungen zu gewährleisten. Entwürfe, Stl-Dateien, 3D-Druckanweisungen und das WinCF FLUD-Handbuch finden Sie im Online-SupplemeNt <ol><li> Medien für die Kapillarrohrbeladung vorbereiten <ol><li> In einem sterilen Biohood füllen Sie acht sterile 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit je 900 μl Medium. </li><li> Homogenisieren Sie alle Sputumproben, indem Sie das Sputum wiederholt mit einer 3-ml-Spritze (einer Plastikspritze ohne Nadel) abziehen und ausstoßen. Tun Sie dies, bis das Sputum ist von glatter Konsistenz. </li><li> 100 μl homogenisiertes Sputum zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen (1/10 Verdünnung in Medium), hergestellt in Schritt 8.1.1, zugeben. Dann die Röhrchen für 30 s vortexen, um ausreichend zu mischen. </li><li> Schlitz die gefüllten und offenen Mikrozentrifugenröhrchen in den Rotatorrohrhalter, der so ausgerichtet ist, dass die Rohre vertikal sind. </li></ol></li><li> Platzierung von Kapillarrohren <ol><li> Drei Kapillarröhrchen für jedes Mikrozentrifugenröhrchen in Schritt 8.1 abholen. </li><li> Schieben Sie drei Röhrchen in die Gummi-Wiege, so dass sie mit den Mikrozentrifugenröhren am anderen Ende des Gerätes ausgerichtet sind.Vergewissern Sie sich, dass die markierten Enden der Rohre von den Mikrozentrifugenröhrchen abgewandt sind. Setzen Sie die drei Löcher auf die Unterseite der Wiege richtig über die drei Bolzen auf dem Wiege stehen. </li><li> Wenn die platzierten Kapillarröhrchen in ihren Führungskanälen auf dem Apparat ruhen, legen Sie den Gummistoß sicher über den Mittelteil, um ein Verschieben zu verhindern. (Siehe Abbildung 4 ) </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> Abbildung 4: Das FLUD-System, das vollständig mit Kapillarrohren beladen ist, die durch den Gummistoß über ihre Mittelsektionen gesichert sind. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> Einlegen von Medien in die Kapillarrohre <ol><li> Verwenden Sie sorgfältig eine Hand, um das Ende des Gerätes zu erfassen, wo die Kapillarrohre liegenaded, und die andere Hand den Rotator Gestell, in dem die Mikrozentrifugenröhrchen geladen zu halten. </li><li> Delikat drehen, um die Mikrozahnstange, so dass die Mikrozentrifugenröhrchen fast horizontal sind und schreiten langsam die Zahnstange in Richtung der Kapillarröhren zu schieben. (Siehe Abbildung 5) </li><li> Wenn die Enden der Kapillarröhren Kontakt mit den Medien in den Mikrozentrifugenröhrchen machen, stellen Sie sicher, dass sofort Kapillarwirkung beginnt die Kapillaren zu füllen. Um Füllrate einstellen und Füllstand, drehen Sie vorsichtig die Vorrichtung als Ganzes. Während dies zu tun, seien Sie vorsichtig nicht Medien aus den Mikrozentrifugenröhrchen zu verschütten. (Siehe Abbildung 6) </li><li> Wenn die Kapillarröhrchen auf gewünschte Pegel gefüllt sind, stellen die Vorrichtung Ebene auf einer Oberfläche und vorsichtig noch schnell das Gestell von Mikrozentrifugenröhrchen von den Enden der Kapillarröhrchen ziehen einzustellen füllt. Die Reaktionsgefäße können nun den ganzen Weg zurück zur vertikalen Position zurückgezogen und geschlossen werden. </li><li> Abdichten des überstehenden Endes der Kapillarröhrchen durch einen Dichtungsblock auf jeden Satz dreifachen Ausführung Pressen, Dichtungs- einen Satz zu einer Zeit, bis alle Sätze abgedichtet sind. Um das Risiko der Kontamination zu reduzieren, drücken , um einen anderen Teil des Dichtungsmittelblockes auf jede dreifachen Ausführung eingestellt ist (siehe Abbildung 7). </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> Abbildung 5: Das FLUD - System mit Mitteln Tubes Eingesetzt in eine horizontalen Ausrichtung, fertig Kontakt mit Kapillarröhrchen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> Abbildung 6: Das FLUD - System mit Kapillarröhrchen mit Medien über Kapillarwirkung Laden. </strOng&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> Abbildung 7: Abdichten gefüllte Kapillarrohre auf dem FLUD-System Ein Triplicate Set zu einem Zeitpunkt mit einem Sealant Block. Dieser Dichtungsblock hatte an den Kanten Kunststoff, der abgeschnitten wurde, um den Kontakt mit benachbarten dreifachen Sätzen während des Versiegelns zu verhindern. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> Inkubation <ol><li> Entfernen Sie den Gummistoß über den Teller-Mittelteil und heben Sie die Gummi-Wiege vom Hauptgerät ab. Das sollten alle Kapillarrohre mitnehmen. Setzen Sie nun die Wiege und die Röhren auf das Imaging-Rack. Dieses raCk hat drei Stubs, die in die Wiege passen, sowie kleine Führungskanäle, um die Rohre einzusetzen. </li><li> Stellen Sie das Imaging-Rack als Ganzes in die klare Kunststoff-Inkubationsbox ein. Kleine Mengen steriler Papiertücher in steriles Wasser einweichen und an den beiden kürzeren Seiten der Schachtel anbringen, um während der Inkubation Feuchtigkeit zu liefern. (Siehe Abbildung 8 ) </li><li> Schließen Sie die Schachtel vollständig und stellen Sie sie in einen 37 ° C Inkubator ein und achten Sie darauf, die Rohre waagerecht zu halten. Inkubieren für 48 h. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> Abbildung 8: Kapillarrohre in der Gummi-Wiege vom FLUD-System auf ein Imaging-Rack übertragen, das in einer klaren Inkubationsbox neben feuchten Papiertüchern angeordnet wurde, um Feuchtigkeit zu liefern. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version von th anzuzeigen</a>Ist Figur. <ol start="5"><li> Bildgebung und Extraktion <ol><li> Entfernen Sie das Imaging-Rack, das die Rohre hält, aus der Inkubationsbox und legen Sie es auf einen Leuchtkasten, der von unten beleuchtet ist. Bei den Röhren, die sich bereits im Imaging-Rack befinden, werden die Triplicate-Sets richtig beabstandet und sofort fertig. </li><li> Fokussieren Sie die Kamera auf die Röhren, so dass alle sichtbar sind im Sichtfeld und Licht aus dem Lichtkasten bietet ausreichend Kontrast und Visualisierung der Farbe in den Röhrenfarbstoffen. Foto von direkt oben. </li><li> Um den Inhalt der Rohre zu extrahieren, entfernen Sie die Kapillarrohre aus der Gummi-Wiege einen Satz von Triplikaten zu einer Zeit. Heben Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Wiege heraus und schieben Sie sie heraus. </li><li> Für jeden Satz von Triplikaten folgen Sie den in den Schritten 7.1 bis 7.3 beschriebenen Extraktionsverfahren. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die mikrobiologische Make-up einer Lunge mit CF enthält eine Vielzahl von Organismen, aber die Bedingungen innerhalb der Lunge haben wahrscheinlich einen signifikanten Einfluss auf welche Arten von Mikroben überleben und gedeihen können 13 , 15 . Spezifische Mechanismen, durch die sich diese Bedingungen ändern und die genauen Wirkungen auf das Lungenmikrobiom sind im Allgemeinen unklar. In dieser experimentellen Methode stellen wir eine Analyse der mikrobiologis...

Die in diesem Manuskript beschriebene Methode heißt das WinCF-System 1 . Das übergeordnete Ziel von WinCF ist es, eine experimentelle Einrichtung zur Verfügung zu stellen, die in der Lage ist, die Umgebung eines mit Schleim gefüllten Lungenbronchiole zu simulieren. Dies ermöglicht ein traktierbares System, um mikrobielle Pathogene von Lungenerkrankungen mit einem Schleim-Hypersekretionsphänotyp einschließlich zystischer Fibrose (CF), chronisch obstruktiver Lungenkrankheit (COPD), Asthma und anderen zu untersuchen. Das Verfahren wurde speziell für die Untersuchung von CF entwickelt, die durch Mutationen gekennzeichnet ist, die dazu führen, dass Lungensekrete dick und schwer zu klären sind, schließlich füllende Bronchiolen und andere kleine Durchgänge mit Schleim 2 . Solche Blockaden in der Lungen hemmen Gasaustausch, weil inhalierte Luft nicht mehr in der Lage ist, viele Alveolen zu erreichen und auch einen Lebensraum für die Bakterienkolonisation 3 , 4 zu schaffen . Die Unfähigkeit, das mikrobielle Wachstum zu verhindernübermäßige Lunge Schleim führt schließlich zu der Entwicklung von komplexen chronischen Infektionen der Atemwege. Diese Gemeinschaften enthalten eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Viren, Pilze und Bakterien , wie Pseudomonas aeruginosa, die alle in Wechselwirkung miteinander , 5, 6, 7, 8. Die Aktivität der CF Lungen microbiome wird angenommen , in Leuchtsignale von Symptomen pulmonale Exazerbationen 1, 9, 10, 11 genannt beteiligt sein. WinCF ermöglicht Studie der mikrobiellen Gemeinschaft Verhalten rund um diese Exazerbationen und jetzt erweitert wird als Basis experimentelles System zu handeln Lunge mikrobielle Ökologie zu studieren. Traditionell wurden Exazerbationen durch direkte Analyse von Proben aus der Lunge entnommen suchen. Viele Störfaktoren machen direkte Analyse der mikrobiellen bVerhalten in der Lunge herausfordernd, mit dem WinCF-System werden viele dieser Faktoren entfernt und das Verhalten des Lungenmikrobioms kann direkt untersucht werden, was eine feinere Analyse der Bakterienaktivität in einem Schleimhautbronchiole ermöglicht. Das WinCF-System bietet eine Methode zum Bilden und Analysieren von Bakterien in einer Weise, die die Lungenumgebung effektiv nachahmt. Traditionelle Methoden zum Aufwachsen von Lungenbakterien beteiligten sich oft an der Kultivierung von Proben auf traditionellen Agarplatten. Diese Methoden lassen die Proben dem atmosphärischen Sauerstoff offen und vernachlässigen die hypoxischen und oft anoxischen Zustände bei Lungenbronchiolen, die mit dem Schleim 12 , 13 verbunden sind . Die Kultivierung auf Agar unter aeroben Bedingungen ist nichts wie die Umgebung der CF-Lunge und kann Kliniker und Forscher über das Verhalten der Krankheitserreger, die sie behandeln wollen, irreführen. Zusätzlich sind die Nährstoffe für Bakterien auf Agarplatten erhältlichSind unähnlich zu denen, die in der tatsächlichen Sputum, die in WinCF durch die Verwendung von künstlichen Sputum Medien (ASM) berücksichtigt wird. Wie die Pseudomonas- Kulturen in Sriramulu et al. 14 , ASM enthält einen bestimmten Satz von Komponenten, die die verfügbaren Ressourcen für Sputum-Mikroben nachbildet und auch die physikalische Konsistenz von Sputum repliziert. Weil eine kranke Lunge ein spezifisches Mikrobiom hat, sollte das Studium solcher Mikroorganismen idealerweise auch in den spezifischen Bedingungen der Lunge stattfinden. Das WinCF-System ermöglicht eine schnelle Analyse und eine einfache Manipulation der experimentellen Bedingungen, um mikrobielle Veränderungen zu beobachten, ähnlich wie sie bei einer tatsächlichen Lungenbronchiole auftreten würden. Diese Technik ermöglicht die Inokulation einer Vielzahl von verwandten Probenarten einschließlich Sputum, Speichel, andere Körpersekrete und reine oder gemischte Bakterienkulturen. Die Natur des experimentellen Aufbaus ermöglicht eine sofortige visuelle Interpretation vondas mikrobielle Gemeinschaft Verhalten und ist so konzipiert, leicht nachgeschaltete Anwendung einer Vielzahl von mikrobiologischen und omics Verfahren zu ermöglichen. Solche Studien sind wichtig, weil bakterielle Veränderungen Gemeinschaft Zusammensetzung basierend auf den physikalisch-chemischen Bedingungen ihrer Umwelt. Mit WinCF die chemischen Bedingungen der Medien manipuliert werden, um die Auswirkungen auf die bakterielle Aktivität zu analysieren. Zum Beispiel kann der Säuregehalt der Medien geändert werden, bevor mit einer Probe der Inokulation. Nach der Inkubation kann die bakterielle Aktivität in jedem dieser Bedingungen direkt miteinander verglichen werden und Rückschlüsse darüber, wie Bakterien in diesen Sputum-Proben verhalten sich als Reaktion auf verschiedene pH gezogen werden. Hier erläutern wir die Verfahren zur Anwendung des WinCF System und Beispiele dafür, wie die Medien Chemie manipuliert werden kann, die Auswirkungen auf die Lunge microbiome zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Farbcodierte Kapillarröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260943</td><td></td></tr><tr><td>Cha-Seal Tube Sealing Compound</td><td>Kimble-Chase</td><td>43510</td><td></td></tr><tr><td>Mucin aus Schweinemagen</td><td>Sigma</td><td>M1778</td><td></td></tr><tr><td>Ferritin, kationisiert aus Pferdemilz</td><td>Sigma</td><td>F7879</td><td></td></tr><tr><td>Lachssperma DNA Natriumsalz (sonifiziert)</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A2159</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminosäuren</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>Eigelb Emulsion, 50%</td><td>Dalynn Biologicals</td><td>VE30-100</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2157500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen mit aufgedruckten Graduierungen und Schieberkappen</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen mit aufgedruckten Graduierungen und Schieberkappen</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr></tbody></table>

das wincf-modell - ein preiswerter und tragbarer mikrokosmos eines schleims verstopfte bronchiole zur untersuchung der mikrobiologie von lungeninfektionen

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Viele chronische Atemwegserkrankungen führen zu Schleimverschluss der Atemwege. Lungen eines Individuums mit zystischer Fibrose sind ein exemplarischer Fall, bei dem ihre Schleimhautbronchiolen einen günstigen Lebensraum für die mikrobielle Kolonisation schaffen. Verschiedene Pathogene gedeihen in dieser Umgebung, die miteinander interagieren und viele der mit CF-Krankheit assoziierten Symptome antreiben. Wie jede mikrobielle Gemeinschaft haben die chemischen Bedingungen ihres Lebensraumes einen erheblichen Einfluss auf die Gemeinschaftsstruktur und die Dynamik. Beispielsweise gedeihen unterschiedliche Mikroorganismen in unterschiedlichen Konzentrationen von Sauerstoff oder anderen gelösten Konzentrationen. Dies gilt auch in der CF-Lunge, wo Sauerstoffkonzentrationen geglaubt werden, um die Physiologie und Struktur der Gemeinschaft zu treiben. Die hier beschriebenen Methoden sind so ausgelegt, dass sie die Lungenumgebung nachahmen und die Erreger in einer Weise erhöhen, die derjenigen ähnlich ist, aus der sie eine Krankheit hervorrufen. Manipulation der chemischen Umgebung dieser Mikroben wird dann verwendet, um zu untersuchen, wie die chemistry von Lungeninfektionen regelt seine mikrobielle Ökologie. Das Verfahren, das WinCF System bezeichnet wird, basiert auf künstlichen Sputum Medium und schmalen Kapillarröhrchen bedeutete einen Sauerstoffgradienten bereitzustellen, die ähnlich zu der in Schleim verstopft Bronchiolen existiert. Manipulieren chemische Bedingungen, wie beispielsweise die Medien pH-Wert des Sputums oder Antibiotika Drucks, ermöglicht die Visualisierung der mikrobiologische Unterschiede in den Proben, farbige Indikatoren, die gerade für Gas oder Biofilm-Produktion, oder Extrahieren und die Sequenzierung des Nukleinsäure Inhalts jeder Probe.

Das mikrobiologische Wachstum über die verschiedenen chemischen Zustände, die in den Proben induziert wurden, variierte drastisch in einigen Fällen und subtiler in anderen. Viele Veränderungen in der Aktivität waren in der Natur visuell, sobald die Inkubationszeit endete. Im Beispiel der pH-Manipulation variierten die Proben über dem pH-Spektrum stark, wie durch mehrere Faktoren gezeigt wurde, die nach der Inkubation sichtbar wurden. Wenn dem Medium keine Sputumproben zugesetzt wurden, z...

Der Schleim verstopft die Atemwege von zystischer Fibrose (CF) Patienten sind eine ideale Umgebung für die mikrobielle Krankheitserreger zu gedeihen. Das Manuskript beschreibt ein neuartiges Verfahren der CF-Lunge microbiome in einer Umgebung für die Untersuchung, dass imitiert, wo sie Krankheit und wie Veränderungen der chemischen Bedingungen verursachen mikrobielle Dynamik antreiben kann.

Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Lungenmilieu nachzuahmen und Krankheitserreger auf eine Weise zu kultivieren, die derjenigen ähnlicher ist, unter der sie Krankheiten verursachen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Atemwegsmikrobiologie zu beantworten, beispielsweise wie sich unterschiedliche bakterielle Krankheitserreger in der Lunge von Patienten mit Mukoviszidose gegenseitig beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache Manipulation der experimentellen Bedingungen ermöglicht.Um mikrobielle Reaktionen zu beobachten, wie sie in einem echten Bronchialsystem der Lunge auftreten würden. Den Ablauf demonstriert Will Comstock aus unserem Labor. Um künstliches Sputum-Medium herzustellen, mischen Sie 16 Milliliter der zuvor hergestellten Muceum-Grundlösung, zwei Milliliter Kaliumchlorid-Grundlösung, zwei Milliliter Natriumchlorid-Grundlösung, 200 Mikroliter Eigelbemulsion, 5,6 Milliliter DNA-Grundlösung, 120 Mikroliter Ferritin-Grundlösung, 5,78 Milliliter essentieller Aminosäurenlösung, 5,78 Milliliter nicht-essentieller Aminosäurenlösung und 2,44 Milliliter sterilem Wasser.Die sorgfältige Herstellung

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Nielsen, T. B., et al., Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Beatmator-assoziierte und im Krankenhaus erworbene bakterielle Pneumonie. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert das Verfahren, bei dem Bakterien über den Oropharynx in die Lunge einer anästhesierten Maus geleitet werden, um eine Lungeninfektion auszulösen und eine Immunantwort auszulösen.

Vorbereitung eines murinen Oropharyngeal-Aspirationsmodells zur Etablierung bakterieller Lungeninfektionen

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Entwicklung eines ex vivo Schweinelungenmodells für bakteriellen Biofilm auf infiziertem bronchiolärem Gewebe. Biofilme sind bakterielle Aggregate, die in eine Matrix eingebettet sind, die an einer Oberfläche haftet. Dieses Modell wird verwendet, um die Antibiotika-Empfindlichkeit von Bakterien in verschiedenen Stadien der Biofilmbildung zu untersuchen.

Ex-vivo-Lungenmodell von Schweinen: Eine Technik zur Entwicklung eines Lungenmodells zur Untersuchung bakterieller Biofilme auf bronchiolärem Gewebe von Schweinen

Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Softlithographie wurde verwendet, um ein repräsentatives maßstabsgetreues Modell von pulmonalen alveolierten Atemwegen zu erstellen, die sich periodisch ausdehnen und zusammenziehen und physiologische Atembewegungen nachahmen. Diese Plattform bildet respiratorische Azinusströmungen auf einem Chip nach und soll die experimentelle Untersuchung der Dynamik und Ablagerung von inhalativen Aerosolen im Lungenacinus erleichtern.

Ein Mikrofluidik-Modell bionisch Atem Pulmonary acinar Airways

Infektiöse Lungenentzündung gehört zu den häufigsten Infektionen beim Menschen. Eine geeignete in-Vivo -Modell ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und Prüfung der Wirksamkeit neuer Therapeutika. Mit diesem Modell murine oropharyngealen Aspiration Pneumonie kann man die Pathogenese und neue Therapien gegen diese tödliche Infektionen untersuchen.

Murine oropharyngealen Aspiration Modell der Ventilator-assoziierten und nosokomiale Bakterielle Pneumonie

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Dieses Manuskript beschreibt die Etablierung eines infektiösen Modells der Lungenentzündung bei Mäusen und die entsprechende Charakterisierung der Verletzungsauflösung sowie Methoden zur Züchtung von Bakterien und zur intratrachealen Instillation. Ein neuartiger Ansatz mit Hilfe der hochdimensionalen Durchflusszytometrie zur Bewertung der Immunlandschaft wird ebenfalls beschrieben.

Experimentelles Modell zur Evaluierung des Abklingens von Lungenentzündungen

Lung-on-Chip-Modelle übertreffen herkömmliche 2D-Kulturen, indem sie die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Perfusion der Endothelzellen nachahmen und den Blutfluss und den Nährstoffaustausch simulieren, die für lungenphysiologische Studien entscheidend sind. Dies erhöht die Relevanz der Lungenforschung und bietet eine dynamische, physiologisch genaue Umgebung, um das Verständnis und die Behandlung von Atemwegsinfektionen zu verbessern.

Immunkompetentes Alveolen-on-Chip-Modell zur Untersuchung der Immunantworten der Alveolarschleimhaut

Dieses Protokoll beschreibt ein lungenrelevantes Polymikrobien-Biofilmmodell für Mukoviszidose (CF) mit vier Spezies, mit dem die Auswirkungen bakterieller Wechselwirkungen zwischen den Spezies untersucht werden können.

Züchtung eines Mukoviszidose-relevanten polymikrobiellen Biofilms zur Untersuchung von Phänotypen in der Gemeinschaft

Diese Methodik ermöglicht die Etablierung eines polymikrobiellen Biofilmmodells bei Mukoviszidose für antimikrobielle Sensitivitätstests in Forschungs- und klinischen Laboratorien. Dieses Modell liefert genaue und zuverlässige Ergebnisse über einen Bereich von Ausgaben.

Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose

Erfahren Sie das WinCF-System zur Simulation der Lungenumgebung für Mikrobiologie-Forschung bei Mukoviszidose. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften in verstopften Bronchiolen.

Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen (Video) | JoVE Journal

Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen

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