Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen
8. Mai 2017
Der Schleim verstopft die Atemwege von zystischer Fibrose (CF) Patienten sind eine ideale Umgebung für die mikrobielle Krankheitserreger zu gedeihen. Das Manuskript beschreibt ein neuartiges Verfahren der CF-Lunge microbiome in einer Umgebung für die Untersuchung, dass imitiert, wo sie Krankheit und wie Veränderungen der chemischen Bedingungen verursachen mikrobielle Dynamik antreiben kann.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Lungenmilieu nachzuahmen und Krankheitserreger auf eine Weise zu kultivieren, die derjenigen ähnlicher ist, unter der sie Krankheiten verursachen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Atemwegsmikrobiologie zu beantworten, beispielsweise wie sich unterschiedliche bakterielle Krankheitserreger in der Lunge von Patienten mit Mukoviszidose gegenseitig beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache Manipulation der experimentellen Bedingungen ermöglicht.
Um mikrobielle Reaktionen zu beobachten, wie sie in einem echten Bronchialsystem der Lunge auftreten würden. Den Ablauf demonstriert Will Comstock aus unserem Labor. Um künstliches Sputum-Medium herzustellen, mischen Sie 16 Milliliter der zuvor hergestellten Muceum-Grundlösung, zwei Milliliter Kaliumchlorid-Grundlösung, zwei Milliliter Natriumchlorid-Grundlösung, 200 Mikroliter Eigelbemulsion, 5,6 Milliliter DNA-Grundlösung, 120 Mikroliter Ferritin-Grundlösung, 5,78 Milliliter essentieller Aminosäurenlösung, 5,78 Milliliter nicht-essentieller Aminosäurenlösung und 2,44 Milliliter sterilem Wasser.
Die sorgfältige Herstellung eines sterilen künstlichen Sputummediums ist äußerst wichtig, da jegliche Kontamination die bakterielle Aktivität in den inkubierten Kapillarröhrchen beeinflussen kann. Nach dem vorsichtigen Schütteln zur Vermischung pipettieren Sie fünf Milliliter des Mediums in acht sterile 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Das Medium kann nun modifiziert werden, um die gewünschten chemischen Bedingungen zu erreichen. Beispielsweise wurde bei den hier gezeigten Medien der pH-Wert verändert und Farbstoffe hinzugefügt, um ihre unterschiedlichen Säuregrade widerzuspiegeln. Als Nächstes werden unter einer sterilen Biosicherheitswerkbank jeweils 900 Mikroliter Medium zu acht sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
Vorgang zur Homogenisierung zuvor gewonnener Sputumproben: Das Sputum mithilfe einer Dreimilliliter-Spritze wiederholt aufziehen und ausstoßen, bis eine gleichmäßige Konsistenz erreicht ist. Jeweils 100 Mikroliter des homogenisierten Sputums in acht Mikrozentrifugenröhrchen geben. Anschließend die Röhrchen gründlich vortexen, um eine ausreichende Durchmischung zu gewährleisten.
Beschriften Sie acht weitere sterile 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen entsprechend den zuvor vorbereiteten Mikrozentrifugenröhrchen mit Medium. Dies werden die Inkubationsröhrchen sein. Sterilisieren Sie ein Papierhandtuch mit 70 %igem Ethanol-Lösung und lassen Sie es trocknen.
Zerreißen Sie das Handtuch in Stücke von jeweils etwa vier Quadratzoll. Zerknüllen Sie dann ein Stück auf dem Boden jedes Inkubationsrohrs. Legen Sie je ein Papierklümpchen auf den Boden jedes Inkubationsrohrs und befeuchten Sie jedes Klümpchen mit 1 Milliliter steriler Wasser leicht, um eine feuchte Umgebung innerhalb des Rohrs zu schaffen.
Füllen Sie für jedes Reagenzglas mit Medium drei Glas-Kapillarröhrchen, indem Sie ein Ende des Röhrchens in das Medium tauchen und es leicht horizontal neigen, sodass die Kapillarwirkung das Medium in das Röhrchen zieht. Beenden Sie das Befüllen, indem Sie vorsichtig einen behandschuhten Finger über das offene Ende des Röhrchens legen, und verschließen Sie das andere Ende, indem Sie es in eine Masse aus kapillarem Dichtkitt drücken.
Platzieren Sie jeden Satz aus drei Kapillarrohren in 15-Milliliter-Inkubationsröhrchen, wobei die mit Kitt verschlossene Seite nach unten zeigt. Verschließen Sie anschließend die Röhrchen und stellen Sie sicher, dass sie beschriftet sind. Diese drei Kapillarrohre dienen der Replikation jeder Kontrollbedingung.
Wenn alle Inkubationsröhrchen mit ihren vorgesehenen Kapillarröhrchen gefüllt sind, stellen Sie die Gestelle bei 37 Grad Celsius so auf, dass die Röhrchen horizontal inkubiert werden und dabei entstehendes Gas nicht aus dem offenen Ende entweichen kann. Inkubieren Sie die Röhrchen 48 Stunden lang.
Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Inkubator, wobei Sie sicherstellen müssen, dass sie waagerecht gehalten werden. Nehmen Sie die Kapillarröhrchen vorsichtig aus den Inkubationsröhrchen heraus und halten Sie dabei jedes Set aus drei Röhrchen von anderen Sets getrennt. Ordnen Sie die Kapillarröhrchen nebeneinander auf einer Lichtbox an, sodass sie ausgerichtet sind und der Inhalt der Röhrchen sichtbar ist und von unten beleuchtet wird.
Erzeugen Sie alle drei Röhrchen eine Lücke, um unterschiedliche chemische Bedingungen voneinander zu trennen. Richten Sie danach die Kamera direkt über den Röhrchen aus, sodass alle Röhrchen im Sichtfeld sichtbar sind und das Licht aus der Leuchtkiste einen ausreichenden Kontrast sowie eine klare Visualisierung der Farbe der Röhrchenfarbstoffe ermöglicht. Um den Inhalt der Röhrchen für nachgeschaltete Analysen zu entnehmen, nehmen Sie jeweils einen Satz der triplikaten Kapillaren einzeln aus der Leuchtkiste heraus. Führen Sie eine stumpfe 25-Gauge-0,5-Zoll-Nadel in das verschlossene Ende des Kapillarröhrchens ein, um die Dichtung zu durchbrechen.
Drehen Sie dann das Kapillarrohr um, damit das Medium aus dem oberen Bereich in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen tropfen kann. Falls das Medium nicht austritt, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Medium aus dem Rohr zu pressen, indem Sie den Kolben der Pipette nach unten drücken, nachdem sie in das Ende des Kapillarrohrs eingeführt wurde. Wie hier gezeigt, war die einzige Veränderung, die sich über das pH-Spektrum hinweg nach 48 Stunden Inkubation zeigte, wenn keine Sputumproben dem Medium zugesetzt wurden, ein geringfügiger Volumenrückgang des Mediums infolge leichter Verdunstung.
Inokulierte Kapillarröhrchen zeigten Volumenänderungen, das Auftreten von Gasblasen, veränderte Färbung sowie das Erscheinen opaker Ablagerungen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich in dem zugegebenen Sputum enthaltene Bakterien und andere Mikroben im künstlichen Medium vermehren und verändern können. Nach der Inkubation können weitere Methoden wie Metabolomik und DNA-Sequenzierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zum Verhalten der in den Kapillarröhrchen wachsenden Mikroben zu beantworten.
Das winCF-System ist eine neuartige Methode, um die Aktivität des Lungenmikrobioms zu untersuchen; wichtig für viele Erkrankungen, einschließlich CF, COPD, Asthma und andere.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt das WinCF-System vor, eine Labormethode, die entwickelt wurde, um die Lungenumgebung zur Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften, insbesondere im Zusammenhang mit zystischer Fibrose (CF), nachzuahmen. Durch die Rekonstruktion der chemischen und physikalischen Bedingungen von mit Schleim verstopften Bronchiolen ermöglicht das Protokoll es Forschern, zu untersuchen, wie Umweltfaktoren das mikrobielle Wachstum, Wechselwirkungen und die Gemeinschaftsstruktur im Hinblick auf chronische Atemwegserkrankungen beeinflussen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Pneumologie
- Mikrobielle Ökologie
Hintergrund
- Chronische Atemwegserkrankungen wie die Mukoviszidose führen häufig zu Schleimpfropfen, die einzigartige Mikroumgebungen in der Lunge schaffen.
- Diese Bedingungen begünstigen die mikrobielle Besiedlung und komplexe Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern.
- Sauerstoffgradienten und chemische Bedingungen in der Lunge beeinflussen die Dynamik mikrobieller Gemeinschaften.
- Herkömmliche Kultivierungsmethoden können die Lungenumgebung nicht ausreichend replizieren.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Laborsystems, das die Lungenumgebung für das mikrobielle Wachstum genau nachahmt.
- Untersuchung, wie chemische Bedingungen wie pH- und Sauerstoffgradienten die mikrobielle Ökologie bei Mukoviszidose und anderen Atemwegserkrankungen beeinflussen.
- Vermittlung von Manipulation und Beobachtung mikrobieller Reaktionen unter kontrollierten Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines künstlichen Sputummediums mit definierter chemischer Zusammensetzung.
- Änderung des pH-Werts des Mediums und Zugabe von Farbstoffen zur Visualisierung.
- Inokulation mit homogenisierten Sputumproben zur Einführung nativer mikrobieller Gemeinschaften.
- Inkubation der Proben in engen Glas-Kapillarröhrchen zur Erzeugung von Sauerstoffgradienten.
- Beobachtung des mikrobiellen Wachstums, der Gasbildung, von Farbveränderungen und der Biofilmbildung.
- Gewinnung des Inhalts der Röhrchen für nachgeschaltete Analysen wie DNA-Sequenzierung oder Metabolomik.
Hauptergebnisse
- Nicht-inokulierte Kontrollen zeigten minimale Veränderungen, hauptsächlich leichte Verdunstung.
- Inokulierte Proben wiesen mikrobielles Wachstum, Gasblasenbildung, Farbänderungen und trübe Ablagerungen auf, was auf einen aktiven mikrobiellen Stoffwechsel hinweist.
- Das System ermöglichte eine klare Visualisierung der Unterschiede in der mikrobiellen Aktivität unter variierenden chemischen Bedingungen.
- Die WinCF-Methode ermöglicht weitere molekularbiologische Analysen zur Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften und ihrer Funktionen.
Schlussfolgerungen
- Das WinCF-System simuliert effektiv die Lungenumgebung, um die Mikrobiologie der Atemwege zu untersuchen.
- Es ermöglicht die gezielte Steuerung chemischer Bedingungen, um deren Einfluss auf mikrobielle Gemeinschaften zu bewerten.
- Dieser Ansatz ist wertvoll für die Forschung zu Mukoviszidose, COPD, Asthma und anderen Erkrankungen, die die Mikrobiota der Atemwege betreffen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das WinCF-Modell bietet ein überschaubares, kostengünstiges Mikrosystem, um die Dynamik mikrobieller Gemeinschaften in mit Schleim verstopften Bronchiolen zu untersuchen, was direkt für chronische Atemwegserkrankungen wie die zystische Fibrose relevant ist. Durch die präzise Steuerung chemischer Gradienten und Umweltbedingungen ermöglicht dieses System eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium sowie die mechanistische Risikominderung von Atemwegsinfektionsmodellen. Aufgrund seiner Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit ist es als wiederverwendbare Plattform für die mikrobiologische Atemwegsforschung über das gesamte Portfolio hinweg geeignet.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die hypothesengeleitete Untersuchung mikrobieller Interaktionen unter krankheitsrelevanten chemischen Gradienten.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem die Auswirkungen von Sauerstoff- und Lösungsmittelkonzentrationen auf das Verhalten von Krankheitserregern isoliert werden.
- Erleichtert die funktionelle Validierung mikrobieller Zielstrukturen in einem physiologisch relevanten Kontext.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares System zur Beurteilung des mikrobiellen Wachstums und der Biofilmbildung unter kontrollierten Bedingungen.
- Ermöglicht quantitative Auswertungen wie farbmetrische Veränderungen, Gasproduktion und Visualisierung von Biofilmen für die Assay-Entwicklung.
- Ermöglicht Skalierbarkeit und Wiederverwendung der Plattform für die Wirkstoff-Screening gegen Atemwegspathogene.
Translationale und präklinische Forschung
- Bringt In-vitro-Befunde mit krankheitsrelevanten Mikroumgebungen in Verbindung, die bei zystischer Fibrose und anderen Atemwegserkrankungen beobachtet werden.
- Ermöglicht die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem nachgeschaltete molekulare Analysen (z. B. DNA-Sequenzierung, Metabolomik) unterstützt werden.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem vorhersagende Einblicke in die Reaktionen mikrobieller Gemeinschaften bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das WinCF-System ist in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Forschung integriert, indem es Hypothesentests, Assay-Entwicklung und translationsmedizinische Forschung an Atemweg-Mikrobiomen ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Aufklärung von Wegen und die biologische Risikominderung durch gezielte Manipulation von Umweltfaktoren.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Vergleichbarkeit mikrobieller Reaktionen unter verschiedenen Bedingungen.
- Analytik: Ermöglicht die Extraktion von Proben für nachgeschaltete molekulare und metabolomische Analysen.
- Translationale Forschung Verbindet in-vitro-Befunde mit krankheitsrelevanten Atemwegsmodellen für präklinische Studien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als modulare, anpassungsfähige Plattform für vielfältige Anwendungen in der respiratorischen Mikrobiologie.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in Modellen von Atemwegsinfektionen.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit mikrobiologischer Assays.
- Strategischer Wert: Optimiert die Entscheidungsfindung über Fortführung oder Einstellung von Projekten und die Kapitaleffizienz bei der Entwicklung von Atemwegsprogrammen.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen und Modellen für chronische Atemwegserkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrobiologie, steriler Technik und nachgeschalteter molekularer Analyse.
- Benötigt Zugang zu grundlegenden Laborgeräten, einschließlich Inkubatoren, Kapillarröhrchen und Lichtboxen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Zubereitung von Medien und der Manipulation von Umweltbedingungen.
- Anpassbar an verschiedene Sputumquellen und chemische Bedingungen für eine flexible Modellsystemnutzung.
- Auf in-vitro-Simulation beschränkt; bildet nicht die volle in-vivo-Atemwegskomplexität ab.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Preparing Medium and Artificial Sputum for Capillary Tube Loading
2:29
Filling the WinCF Capillary Tubes with Inoculated Artificial Sputum Medium
4:12
Incubation and Imaging the Extraction
5:38
Results: Microbiological Growth in the WinCF Capillary Tubes
6:22
Conclusion
