Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung eines Densovirus, HaDV2, auf seinen Wirt, den Baumwollkapselwurm, zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Virus-Wirt-Interaktion zu beantworten, wie z.B. die Wirkung von Viren, die nun wegweisend sind, auf ihren Wirten. Der Hauptvorteil dieser Technik, die Larven zur Konstruktion von viruspositiven und -negativen Stämmen verwenden, besteht darin, dass sie von denselben Par-ne-Co-Wirten stammen, wodurch der gleiche genetische Hintergrund gewährleistet wird.

Zu Beginn des Experiments wurden acht Einzelpaare von neu eingeschlossenen Motten mit einem Kunststoffkäfig pro Paar verpaart, der mit Baumwollgaze überzogen war, um eine gute Belüftung zu gewährleisten und als Substrat für die Eiablage zu dienen. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, eine virusfreie Kolonie zu erhalten, verwenden Sie mindestens 30 Paarungen von Einzelpaaren. Füttern Sie erwachsene Motten mit einem in 10 % Zucker und 2 % Vitaminlösung getränkten Wattebausch und füllen Sie die Lösung täglich auf.

In der heutigen Zeit nach der Paarung, wenn die weiblichen Erwachsenen ihre Eier auf die Baumwollgaze legen, beginnt man, die Gaze täglich zu wechseln. Sammeln und pflegen Sie gazehaltige Eier im selben Wachstumsraum wie die erwachsenen Motten, bis die Eier schlüpfen. Übertragen Sie frisch geschlüpfte Larven sofort auf neue 24-Well-Platten mit einem Individuum pro Well.

Fünf Tage nach der ersten Eiablage sammeln Sie die Elternmotten und lagern sie in flüssigem Stickstoff. Überprüfen Sie die Eltern mittels PCR mit spezifischen Primern auf HaDV2 und behalten Sie die HaDV2-freien Individuen als HaDV2-freien, nicht infizierten Stamm bei. Adulte Motten einzeln sammeln und sofort in flüssigem Stickstoff lagern.

Sammeln Sie einzelne Motten mit einem sterilisierten Mörser und Stößel vollständig in flüssigem Stickstoff zerkleinern. Füllen Sie etwa 10 Mikrogramm Schmutz in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen um. Füllen Sie dann den restlichen Schmutz in ein neues Röhrchen um und lagern Sie ihn sofort bei 80 Grad Celsius.

Extrahieren Sie DNA aus den 10 Mikrogramm Schmutz gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Protokollen. Sobald die Motten-DNA isoliert wurde, prüfen Sie mit dem Protokoll auf HaDV2. Entsprechend den Ergebnissen teilen Sie die verbleibenden Trümmer in zwei Gruppen auf: HaDV2-positiv und HaDV2-negativ.

Geben Sie jedem Individuum einen Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), um die verbleibenden Larvenreste vollständig aufzulösen. Kühlen Sie die Zentrifuge auf vier Grad Celsius ab und schleudern Sie dann das Homogenat. Filtrieren Sie den Flüssigkeitsüberstand auf Eis mit dem 0,22-Mikron-Membranfilter.

Sammeln Sie 200 Mikroliter der gefilterten Flüssigkeiten pro Röhrchen und lagern Sie sie sofort bei 80 Grad Celsius. Zur Bestimmung der Wirksamkeit der oralen Infektion mit den HaDV2-infizierten filtrierten Flüssigkeiten unterschiedlicher Konzentration durch Verdünnung der HaDV2-haltigen Flüssigkeit. In einem Abzug werden gleichmäßig 200 Mikroliter HaDV2 verteilt, die gefilterte Flüssigkeiten für jede Konzentration auf der Oberfläche der festen künstlichen Nahrung enthalten.

Beginnen Sie als Nächstes mit der Übertragung von 100 frisch geschlüpften Larven auf das HaDV2-haltige künstliche Futter in einer Petrischale. Klopfen Sie vorsichtig auf die Baumwollgaze einschließlich der frisch geschlüpften Larven, um die Larven von der Gaze auf ein weißes Blatt Papier zu übertragen. Klopfen Sie vorsichtig auf das Papier, so dass die Larven Seide drehen und sich vom Papier abheben

Berühren Sie die Seide mit einer sterilisierten Pinzette und bringen Sie die Larven in eine Petrischale. Nach 48 Stunden wird eine einzelne Larve pro Mulde auf die künstliche Diät auf 24-Well-Platten übertragen. Die mit HaDV2 geimpften Larven werden mit den gleichen Konzentrationen wie im adulten Stadium

Überprüfen Sie den HaDV2-Infektionsstatus der Erwachsenen anhand des Protokolls. Erwachsene, die mit 10 bis zur achten Kopienzahl pro Mikroliter HaDV2 geimpft wurden, führten zu einer 100%igen Infektion und werden als HaDV2-positiver Stamm gehalten. Um eine Kontamination zu vermeiden, sterilisieren Sie die Pinzette und die Schere dreimal in 75%igem Ethanol und erhitzen Sie sie dann in der Flamme einer Alkohollampe.

Wiegen Sie mit einer Analysenwaage die leeren Röhrchen, die zur Aufbewahrung des Gewebes verwendet werden sollen. Legen Sie dann die Larven und erwachsenen Motten des infizierten Stammes etwa fünf Minuten lang auf Eis. Fixieren Sie die gefrorenen Larven auf dem Zystosepement mit zwei Insektenstiften, die in die intersegmentalen Membranen in der Nähe des Kopfes und des letzten Abdomensegments eingeführt werden.

Schneiden Sie dann im hinteren Bauch das Vorderbein der Larve ab, so dass die Hämolymphe herausfließt. Verwenden Sie eine Pipette, um innerhalb von etwa 10 Sekunden etwa 10 Mikroliter Hämolymphe der Larve zu pipettieren, um eine Bräunung und Gerinnung der Hämolymphe zu verhindern. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in die Nagelhaut, der von der letzten intersegmentalen Membran bis zum Kopf reicht.

Präparieren Sie mit zwei Pinzetten den Vorderdarm, den Mitteldarm, den Hinterdarm, den Fettkörper und die malpighischen Tubuli. Um eine Kontamination des verbleibenden Gewebes mit der Hämolymphe während der Dissektion zu verhindern, waschen Sie das präparierte Gewebe in PBS-Puffer. Mischen Sie Gewebeproben von drei Individuen zu einem Replikanten.

Übertragen Sie jedes Gewebe sofort in flüssigen Stickstoff in die Röhrchen. In einer sauberen Petrischale mit PBS-Puffer wird das Gewebe von weiblichen und männlichen Erwachsenen präpariert und jedes Gewebe sofort in flüssigem Stickstoff in die Röhrchen übertragen. Wiegen Sie die Eileiter und die oben genannten Gewebe separat zusammen und berechnen Sie die Masse des Gewebes.

Extrahieren Sie DNA aus diesen Geweben und führen Sie eine kPCR durch, um den Virustiter jedes Gewebes zu quantifizieren. Setzen Sie mindestens 100 Puppen oder neu geschlüpfte erwachsene Motten, die von dem nicht infizierten Stamm abstammen, in einen mit Baumwollgaze bedeckten 5-Liter-Drahtgitterkäfig. Nach zwei Tagen beginnen verpaarte erwachsene Weibchen, Eier auf die Baumwollgaze zu legen.

Sammeln und pflegen Sie die Baumwollgaze mit den Eiern. Fahren Sie mit der Inokulation von Neugeborenenlarven fort, indem Sie die Neugeborenenlarven des nicht infizierten Stammes auf das künstliche Futter übertragen, das HaDV2 enthält, um den infizierten Stamm zu etablieren. In ähnlicher Weise werden Neugeborenenlarven auf die künstliche Nahrung übertragen, die mit HaDV2-freier gefilterter Flüssigkeit bedeckt ist, um die Kontrollgruppen, den nicht infizierten Stamm, zu bestimmen.

Nehmen Sie mindestens 240 Larven in jede Behandlung auf. Nach 48 Stunden wird eine einzelne Larve pro Vertiefung auf 24-Well-Platten übertragen. Nummerieren Sie jede Larve in jeder Vertiefung fortlaufend und notieren Sie täglich das Stadium im Stadium und den Überlebensstatus.

Etwa fünf Tage später, wenn sich die künstliche Nahrung verschlechtert, übertragen Sie diese Personen gleichzeitig auf eine neue 24-Well-Platte mit frischer künstlicher Nahrung. Wiegen Sie die Larven vom siebten bis elften Tag mit einer Analysenwaage. Nach dem Wiegen werden die Larven einzeln wieder auf die 24-Well-Platte gelegt.

Nach der Häutung bis zum fünften Stadium, etwa zehn Tage nach dem Schlüpfen, werden die Larven in Glasröhren umgesiedelt. Übertragen Sie die Personen jeden Tag zur gleichen Zeit in die Glasröhre. Die Larven des fünften Stadiums können auch an der Breite der Kopfkapsel identifiziert werden.

Als nächstes codieren Sie jede Larve mit ihrer ursprünglichen Referenznummer auf der Glasröhre mit Farbe oder Markern. Erfassen Sie täglich den Larvenstatus. Notieren Sie die Puppen und das Scheidungsdatum für jedes Individuum in der Glasröhre und notieren Sie die Masse der drei Tage alten Puppen.

Nach der Eklosion ein Weibchen und ein Männchen in einen einzigen Käfig mit 10 % Saccharose und 2 % Vitaminlösung setzen. Füllen Sie die Saccharoselösung jeden Tag auf. Notiere das Todesdatum für jede Motte.

Wenn Eier gelegt werden, wechseln Sie die Baumwollgaze täglich. Zählen Sie sofort die Anzahl der Eier. Zählen Sie schließlich frisch geschlüpfte Nachkommen, während sie schlüpfen.

Tri-als wurden durchgeführt, um die Qualität der im Experiment verwendeten Proben sicherzustellen. Nachkommen der männlichen und weiblichen Eltern, die wir HaDV2-frei gezüchtet haben, wurden als nicht infizierter Stamm aufgezogen. Wir haben das Aktin-Gen erfolgreich in Eltern und Nachkommen unter Verwendung desselben DNA-Templates amplifiziert, was darauf hindeutet, dass die DNA-Templates von guter Qualität waren.

Die zufällig ausgewählten acht Nachkommen waren zudem frei von HaDV2, HaNPV und Wolbachia. Eine Standardkurve, die die Beziehung zwischen dem log der Qualität des Ausgangsmaterials und den gewonnenen CT-Werten definiert, zeigt eine starke lineare Korrelation zwischen den CT-Werten und dem log der anfänglichen Genkopienzahl von HaDV2. Die HaDV2-Kopienzahl wurde pro Mikrogramm jedes Gewebes berechnet, und der prozentuale Anteil des HaDV2-Gesamttiters für das spezifische Gewebe zeigte, dass HaDV2 hauptsächlich im Fettkörper verteilt war.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die empfindlichen Larven in den ersten fünf Tagen nach dem Schlüpfen während des gesamten Verfahrens zu behandeln.