Name: Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Lernen Sie die DRG-Injektion und dorsale Wurzelquetschung zur Untersuchung der sensorischen Axonregeneration bei erwachsenen Ratten. Dieses Modell ermöglicht Gentherapie-Studien ohne direkte Rückenmarksverletzung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Christopher und Dana Reeve Foundation, dem Medical Research Council, der European Research Council ECMneuro und der Cambridge NHMRC Biomedical Research Center unterstützt. Wir möchten unsere tiefste Dankbarkeit ‚zu Heleen Merel van während der Dreharbeiten t Spijker und Justyna Barratt für ihre technische Unterstützung zum Ausdruck bringen. Wir möchten, dass Dr. Elizabeth Moloney und Professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) zur Unterstützung bei AAV-Produktion danken.

Alle folgenden Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Vereinigten Königreich Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt Falls Sie nicht wissen mit diesen Verfahren, überprüfen Sie bitte mit den lokalen / nationalen Vorschriften und Veterinär Rat einholen, bevor das Protokoll zu starten. 1. Die Wahl eines geeigneten Stammes von Tiere Hinweis: Eine dorsale Wurzel Quetschverletzungen führt zum Verlust der Empfindung und Pfote Deafferentation. Häufige Nebenwirkungen von forepaw Deafferentation können, gehören Über Grooming, Selbstverstümmelung und Pfote autotomy. <ol><li> Erhalten Tiere für das Verfahren. HINWEIS: Bei Ratten, die aktiveren Stämme wie Lister-Hooded Wistar und haben eine höhere Inzidenz von Paw autotomy nach Deafferentation den fügsamen Stämmen verglichen, wie Lewis und Sprague-Dawley. Wenn möglich, die fügsam Stamm, Lewis, sollte immer an erster Stelle in Betracht gezogen werden. Sollte eine besonders aktive Belastung für das Experiment notwendig sein, durch genetischen mNDERUNG oder spezifische Verhaltensbeurteilung Anforderungen soll Veterinärbehandlung vorhanden sein, schädliche Wirkungen zu begegnen erwartet. </li></ol> 2. Vorbereitung des Virus für die Injektion ACHTUNG: Behandeln Sie alle Viren in Übereinstimmung mit biologischen und Laborsicherheitsbestimmungen. <ol><li> Verdünnen oder das Virus zu einem Titer von 2 x 10 12 Genomkopie (GC) konzentrieren / mL folgende einzelne Virusverpackung Protokollen 9. HINWEIS: Hier wurde das Virus in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) mit 5% Saccharose verdünnt. Der Titer kann optimiert werden, abhängig von der Art des Virus-Promotor, konstruiert Größe sowie gezielter Zelltyp. </li><li> Optional: 1% farbigen Farbstoff (zB Fast Green) an die Virus - Lösung für die einfache Visualisierung der Injektion später. Mischen Sie die Lösung sehr sanft. </li><li> Halten Sie die Lösung auf Eis für den sofortigen Einsatz (innerhalb von 4 h) oder in einem -80 ° C-Gefrierschrank für die LangZeitlagerung. </li></ol> 3. Durchführung der präoperativen Vorbereitung des Tier HINWEIS: Aufgrund der extremen Invasivität der Operation sollten aseptische Techniken jederzeit verwendet werden. <ol><li> Vorbereiten und Sterilisieren alle chirurgischen Instrumente und das Rücken Stereotaxierahmen vor der Operation zu beginnen. Beispielsweise sterilisieren, die Werkzeuge in einem Autoklaven bei 134 ° C. Verwenden Sie einen frischen Satz von sterilisierten Werkzeugen für jedes Tier. </li><li> Betäuben das Tier. Bestätigen Sie die richtige anesthetization durch die Pfote Kneifen für den Rückzug Reflex zu testen oder durch die Hornhaut für die Lidschlussreflex berühren. <ol><li> Für erwachsene Ratten Inhalationsanästhesie wie Isofluran arbeiten, verwenden 4% Isofluran in 2,0 l / min Sauerstoff für die Induktion. Für Wartung während der Operation verwenden, 2 - 3% Isofluran in 1,5 l / min Sauerstoff, Variieren die Isofluran-Konzentration nach dem Atemmuster des Tieres Über- oder Unterdosierung zu vermeiden. </li></ol></li><li> Aufce das Tier zunächst betäubt ist, notieren Sie die präoperative Gewicht des Tieres. </li><li> Für die zervikale DRG Injektion, scheren das Fell auf dem Hals zwischen den Ohren gerade distal des scapulae ab. Desinfizieren Sie die rasierte Fläche mit einem Antiseptikum Produkt. </li><li> Einzuzuspritzen 2 ml Kochsalzlösung subkutan in der Flanke des Tieres, zusammen mit einer geeigneten Dosis des Analgetikums (beispielsweise 5 mg / kg Carprofen) und Antibiotika (beispielsweise 5 mg / kg Enrofloxacin). </li><li> Bewerben Augensalbe sowohl für die Augen Hornhauttrocknung während des Verfahrens zu verhindern. </li><li> Weiter zur Operation an einem Wirbelsäulen Stereotaxierahmen mit einem Heizkissen bei 37 ° C unterhalb des Tieres platziert. </li></ol> 4. Injizieren DRG und Durchführen einer Hinterwurzel Quetschverletzungen HINWEIS: Dies ist eine äußerst heikle Operation. Es ist ratsam, ein paar tote Tiere üben zunächst mit der Anatomie vertraut zu machen, bevor fortTierChirurgie zu leben. <ol><li> Locate die prominenten C2 und T2 Dornfortsätze über die Haut. Führe einen Hautschnitt zwischen den C2 und T2 Dornfortsätzen mit einer No.10 Skalpellklinge (einmal die Haut geöffnet wird, ein weißes, faseriges Gewebe-Mittellinie auf der ersten Schicht des Muskels sichtbar sein soll, wobei die erste Schicht von Muskel hat eine &quot; geleeartige“Textur). </li><li> Machen Sie einen ähnlich großen Einschnitt auf der ersten Schicht des Muskels entlang der weißen Mittellinie ein Skalpell. Gehen Sie nicht über den prominenten T2 spinous Prozess, da es einen großen arteriellen Zweig von der absteigenden Aorta ist dort in der Nähe befindet. HINWEIS: Starke Blutungen ab überall von diesem Schritt erfolgen können. Halten Sie immer die Blutung und entfernen Sie das Blut durch die Verwendung sterilisierten Wattestäbchen oder chirurgische resorbierbaren Schwämme klare Visualisierung jederzeit zu ermöglichen. Fortschreiten mit dem Verfahren „blind“ zu unerwünschten Schäden führen kann später an das Rückenmark, DRG, oder dorsal root, was zu unerwarteten Nebenwirkungen bei dem Tiere. </li><li> einfahren dieerste Schicht von Muskel zwei Retraktoren unter Verwendung einer platziert rostral und eine caudal; die zweite Schicht von Muskeln, mit einem quergestreifter Aussehen, sollte sichtbar sein. </li><li> Lokalisieren der Mittellinie der zweiten Schicht des Muskels (wo zwei Längsmuskeln können durch ein dünnes, membranartigen Gewebe verbunden beobachtet werden). Seziert das membranöse Gewebe ein Paar von Mikroschere mit den beiden Längsmuskeln zu trennen. Vermeiden Sie ein Skalpell, wenn möglich, da dies zu unnötigen Muskelschäden und Blutungen führen kann. </li><li> Stellen Sie die Retraktoren dementsprechend die dritte Schicht aus dünnem Muskel zu, die Wirbelsäule bedecken. Die Dornfortsätze können mit einer Zange über die dritte Schicht des Muskels durch leichtes Berühren fühlbar. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der dritten Schicht von Muskel Mikroscheren mit und sanft abzukratzen den Muskel vom Knochen einer Kürette oder Skalpell in einer Seitwärts Weise mit deutlich die Wirbel aus. Bei Bedarf wegschneiden einige der Muskeln oder Sehnen, um die Lami zu machennectomy einfacher. </li><li> Zu belichten des linksen C5 - C8 DRGs, führt eine linke hemi-Laminektomie auf dem C4 - Wirbel T1 durch vorsichtiges Teil der Lamina entfernt und Pedikel ein Paar von feinen Rongeurs verwenden. Die DRG ist nahe der Quer Foramen des Wirbels angeordnet. HINWEIS: C3 - C7 Wirbel nicht einen prominenten spinous Prozess. Die DRG C5 zwischen C4 und C5 Wirbeln befindet, ist die C6 DRG zwischen C5 und C6 Wirbel, und so weiter, während die C8 DRG zwischen C7 und T1 Wirbeln ist. Es gibt keinen C8 Wirbel, trotz der Gegenwart eines C8 DRG und eine Rückenmarksegment C8. </li><li> Sobald genug von der DRG wird zur Injektion freigelegt worden ist, bereitet die Spritze durch die Virus gefüllte Mikroliterspritze mit einem Maße, 33-Gauge-Nadel stumpf auf den stereotaxische Spritzenhalter angebracht platzieren. Vor der Injektion verwenden, um eine 30-Gauge-Nadel eine abgeschrägte kleinen oberflächlichen Öffnung auf jede der gezielten DRG zu machen mit dem Einstechen der Injektionsnadel zu unterstützen. </li><li> Legen Sie die 33-gAuge entfernt Nadel in der Mitte der DRG daß die Knöpfe gedreht sanft die stereotaxische Koordinaten einzustellen. Nicht über-die Nadel, da diese Flüssigkeit aus der Bauchseite des DRG austreten verursachen kann. Bei Leckage die Position der Nadel sofort auftreten, anzupassen. HINWEIS: Die numerischen Stereotaxierahmen Koordinaten nicht verwendet werden; jedoch ist es hilfreich, um den Rahmen zu nutzen, um die Nadel für die Injektion zu halten. </li><li> Einzuspritzen 1 ul des Virus in jedem DRG bei 0,2 &amp; mgr; l / min, eine Infusionsspritzenpumpe. Warten für weitere drei Minuten, bevor die Nadel zurückzuziehen. Während der Injektion wird die DRG langsam Farbe ändern, wenn die Viruslösung einen Farbstoff enthält. </li><li> Um eine gleichzeitige C5 auszuführen - C8 dorsal root Quetschverletzung, zerquetschen jeder Wurzel dreimal 10 s jeweils unter Verwendung eines Paar von feiner bestückte Zange (Bonn Micro), gegenüberliegenden Enden der Zange vollständig; eine weiße Linie in dem Gewebe an der Quetschstelle erscheinen soll. Gehen Sie nicht tiefer als bei der forc erforderlicheps, da dies kann zu Schäden an der ventralen Wurzel führen. </li><li> Im Anschluss an die Injektion und / oder zu vernichten, stellen Sie sicher, dass es keine Blutungen oder kleine Stücke von Knochenfragmenten an der Einschnittstelle vor dem Schließen bis das Tier nach links ist. Wenn bevorzugt wird, stellt ein kleines Stück chirurgischer resorbierbaren Schwamms auf der Oberseite des freiliegenden Rückenmark und DRG. </li><li> Lassen Sie die dritte Schicht des Muskels natürlich auf die Wirbelsäule, ohne Vernähung zurückzuziehen zurück. Lose Naht die beiden auf der zweiten Schicht Längsmuskeln mit resorbierbaren Nahtmaterial 6-0 (≈ 3 Fäden unterbrochen). Vernähen die erste Schicht des Muskels (≈ 5 unterbrochen Nähte) mit resorbierbaren Nahtmaterial 6-0. </li><li> Vernähen die Haut mit resorbierbaren 5-0 Nahtmaterial (≈ 10 unterbrochen Nähte). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Nähte nicht zu eng sind. Vorwölbung der Haut ist ein Zeichen von Überdrehen und können Beschwerden an das Tier verursachen. </li><li> Wenn schwere Blutungen während der Operation aufgetreten ist, injiziert subkutan 1 bis 2ml Kochsalzlösung, den Verlust von Flüssigkeit aus dem Tiere wieder aufzufüllen, wie unter lokalen Regelungen zulässig. </li><li> Vorzusehen eßbaren hydratisierende Gel und ermöglicht es dem Tier zu gewinnen zum regelmäßigen Überwachung der Durchführung mindestens 1 h vollständig von der Anästhesie, bevor das Tier zurück zu dem Haltebereich zurückkehrt. </li><li> Halten Sie das Tier für mindestens 3 Wochen für eine optimale Transgen-Expression auf sensorische Axonregeneration zu bewerten. </li></ol> 5.es Durchführen von Postoperative Pflege des Tieres <ol><li> Geben Sie Lebensmittel Maische und weiche Baumwollbettwäsche für das Tier während der ersten Woche nach der Operation. Bei Bedarf verabreicht zusätzliche Dosen von analgetischen und Antibiotikum mit der Erholung im Einklang mit den lokalen / nationalen Vorschriften und Veterinär Beratung zu unterstützen. </li><li> Entfernen Sie die Nähte auf der Haut nach 7 - 10 Tagen. HINWEIS: Häufige Nebenwirkungen der Operation umfassen die Bildung von seroma oder Hämatom an der Einschnittstelle, Kratzspuren auf der Haut aufgrund der Juckreiz verursacht durchdie inneren resorbierbaren Fäden, subtile sensorische oder Bewegungsdefiziten und Anzeichen von Selbstverstümmelung auf der deafferentierten Pfote nach der Quetschverletzungen dorsalen Wurzel. Für alle Schutzfragen, die wesentlich schwerer sind als erwartet, suchen Sie sofort ein Tierarzt. </li></ol> 6. Durchführen einer Anterograde CTB Injection für Axonal Tracing HINWEIS: Es wird empfohlen, Choleratoxin B-Untereinheit (CTB) axonalen Tracing in der Woche vor der Gewebesammlung durchzuführen. <ol><li> Bereiten Sie 1% CTB Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Optional: 1% gefärbten Farbstoff zu der Lösung für die einfache Visualisierung der Injektion später. Mischen Sie die Lösung sehr sanft. </li><li> Anesthetize das Tier (siehe Schritt 3.2.1) und Stabilisierung der linken Vorderpfote durch das Glied zum Tisch Taping. </li><li> Manuell und 1 ul 1% CTB langsam subkutan in die Mitte des glabrous Fußballen und vier Ziffern unter Verwendung einer Mikroliterspritze versehen wi injizierenth eine maßgefertigte, 33-Gauge-Nadel kurz. Hinweis: Vor der Injektion, hilft es, zunächst eine 30-Gauge-Nadel verwenden, um eine abgeschrägte kleine oberflächliche Öffnung an der Haut zu machen, die mit dem Einführen der Injektionsnadel unterstützt. </li><li> Lassen Sie das Tier vollständig aus der Narkose erholen, bevor das Tier zu dem Haltebereich zurückkehrt. </li></ol> 7. Sammeln Tissue <ol><li> Um das Virus injiziert DRG und Rückenmark für die Immunhistochemie zu sammeln, eine Überdosis Anästhetikum administrieren und transkardial perfundiert das Tier mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von kaltem 4% Paraformaldehyd. Vorsichtig führen Sie eine vollständige Laminektomie auf dem Rücken der festen Gewebe unter dem Mikroskop zu sammeln. Weiter mit Gewebepräparation, Sektionierung, und die Verarbeitung , wie für die Analyse erforderliche 4, 5, 6. HINWEIS: Die zurückgewonnene Inzisionsstelle sollte offensichtlich sein, wie durch die Anwesenheit von s beobachtetAuto Gewebe. </li><li> Alternativ kann das Virus injiziert DRG für in - vitro - Kultur zu sammeln, um das Tier opfern artgerecht mit einem genehmigten Verfahren, wie beispielsweise eine ansteigende Konzentration an Kohlendioxid. Sorgfältig seziert die DRG unter einem Mikroskop, aseptische Bedingungen, wann immer möglich zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Gewebekultur nach Wunsch 4, 5, 6, 10. </li></ol>

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James Fawcett ist ein bezahlter Berater für Acorda Therapeutics und Novartis.

In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung eine DRG Injektion und dorsal root Quetschverletzung im unteren Halsrückenmark eines erwachsenen Ratte durchzuführen. Da dies eine sehr invasive und empfindliche Operation ist, empfehlen wir dringend, dass alle potentielle Anwender vor vorrückenden ausreichende Ausbildung und Praxis erhalten Tierchirurgie zu leben. Der Anwender sollte nicht nur mit Rückenmark Anatomie, sondern auch mit der umgebenden Muskelgewebe, Wirbelknochenstruktur und Gefäße vertraut ...

Axon Erreichen Regeneration nach Schädigung des Nervensystems ist eine anspruchsvolle Aufgabe 1. Um den Ausfall von Axonregeneration im zentralen Nervensystem (ZNS) zu untersuchen, haben die Forscher eine Vielzahl von Nervenverletzungen Modelle verwendet. Als Regionen des ZNS unterscheiden, ist es wichtig, ein anatomisch geeignetes Modell zu studieren Axonregeneration zu verwenden. Durch das entsprechende Modell verwenden, können die Forscher eine spezifische Behandlung formulieren von der Schwere der Verletzung basiert, der neuronalen Zelltyp von Interesse und den gewünschten Rücken-Darm-Trakt Regeneration für die Beurteilung, im Gegensatz zu einer „One-for-all“ Behandlungsstrategie. In Verletzung des Rückenmarks, zum Beispiel stammen die meisten schwächenden Symptome der Verlust der Empfindung und Fortbewegung. Verlust der Empfindung wird durch Schäden an den aufsteigenden sensorischen Bahnen verursacht, während der Verlust der Fortbewegung durch Schäden an den absteigenden motorischen Bahnen verursacht wird. Aufgrund zellulären und anatomischen Unterschiede zwischen diesen two Wege konzentrieren sich viele gezielte Axonregeneration Studien nur auf den einen oder anderen Weg, mit der Begründung, dass eine erfolgreiche Erholung der entweder von enormem Nutzen für die Patienten sein würde. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll, das eine direkte Spinalganglien (DRG) Injektion mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen dorsal root Quetschverletzung im unteren Halsrückenmark einer erwachsenen Ratte als Modell Regeneration zu studieren sensorische Axonen verwendet. DRG sensorisch Neuronen sind verantwortlich für die sensorischen Informationen, wie taktile Empfindung und Schmerzweiterleitung, von der Peripherie zum ZNS. Die langen axonale Projektionen von sensorischen Neuronen im Rückenmark dienen als ein gutes Modell Fern Axonregeneration zu studieren. Darüber hinaus, wie Nager eine sensorische Bahn Läsion wie ein dorsale Wurzel Quetschverletzungen mit minimalen Wohlergehen Komplikationen überleben können, können die Forscher CNS Axonregeneration studieren, ohne die Notwendigkeit vollständig in das Rückenmark zur Läsion. A Quadruple C5 - C8 (zervikale level 5 bis 8) dorsale Wurzel Quetschverletzungen wurde ein nützliches Modell für forepaw Deafferentation 2 gezeigt werden. Darüber hinaus bietet ein dorsales Wurzel Quetschverletzungen ein „sauberes“ Modell Axonregeneration als eine direkte Verletzung des Rückenmarks zu studieren, weil sie durch andere Faktoren wie Glia Narbenbildung unkompliziert. Die Verwendung von viralen Gentherapie Neuronen in einem regenerativen Zustand neu zu programmieren zunehmend als vielversprechende Behandlungsstrategie für viele neurologische Erkrankungen 3 angesehen. Studien haben die Anwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV) Vektor trägt das Transgen eines wachstumsförderndes Protein gezeigt , mit Verhaltensbesserung 4, 5, 6 robust Axonregeneration erzielen. Die scheinbare niedrige Pathogenität von AAV in Hervorrufen einer Immunantwort und die Fähigkeit, sich nicht teilende Zellen transduzieren, wie Neuronen, machenes der optimale Vektor für die Gentherapie. Zusätzlich wird die rekombinante AAV Form zur Therapie verwendet. In dieser Form ist er unfähig , seine viralen Genoms in das Wirtsgenom zu integrieren , 7, um das Risiko von Insertionsmutagenese zu reduzieren , im Vergleich zu anderen viralen Vektoren, wie Lentivirus. Dies macht AAV eine sichere Wahl für gentherapeutische Anwendungen. Als DRG die Zellkörper von sensorischen Neuronen enthält, ist es das am besten geeignete anatomische Ziel für die Verabreichung des Virus für die Gentherapie zu untersuchen und / oder sensorische Axonregeneration zu fördern. In einer Studie wurde verschiedene AAV - Serotypen und Lentivirus, AAV - Serotyp 5 (AAV5) Vergleichen gezeigt in DRG - Neuronen transduzieren über einen Zeitverlauf von mindestens 12 Wochen die effizienteste, wenn 8 direkt in den DRG injiziert. Zusätzlich kann AAV mehr als 40% Transduktionseffizienz erreichen, alle DRG neuronalen Subtypen Umwandlungs, wie mit dem großen Durchmesser Neurofilament 200 kDa(NF200) -positiven Neuronen und der kleine Durchmesser Calcitonin gene-related peptide (CGRP) - oder isolectin b4 (IB4) -positiven Neuronen 4, 8. Da das chirurgische Verfahren der DRG-Injektion und Quetschverletzungen dorsalen Wurzel extrem invasiv und empfindlich ist, sind wir der Meinung, dass dieser Artikel neue Benutzer helfen wird, das Verfahren auf eine sehr effiziente Art und Weise zu lernen. In diesem Artikel zeigen wir repräsentative Ergebnisse von erwachsenen Ratten vier Wochen nach der Injektion eines Kontrollvirus AAV5-GFP (green fluorescent protein) in C6 - C7 DRGs mit einem gleichzeitigen C5 - C8 dorsaler Wurzel Zu. Dieses Modell eignet sich besonders für Forscher, die die Verwendung von viralen Gentherapie untersuchen zu sensorischen Axonregeneration zu fördern.

<table><tbody><tr><td>Schneller grüner FCF-Farbstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>Zur Visualisierung farbloser Lösung. Empfohlene Konzentration: 1%</td></tr><tr><td>Choleratoxin B-Untereinheit</td><td>Liste Biologische Laboratorien</td><td>104</td><td>Für die anterograde axonale Verfolgung. Empfohlene Konzentration: 1%</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td>Inhalationsanästhetikum (Wirkstoff: Isofluran)</td></tr><tr><td>Baytril 2,5% injizierbares</td><td>Bayer</td><td>05032756093017</td><td>Antibiotikum (Wirkstoff: Enrofloxacin). Vom Hersteller empfohlene Dosierung: 10 mg/kg</td></tr><tr><td>Carprieve 5,0% w/v</td><td>Norbrook</td><td>02000/4229</td><td>Analgetikum (Wirkstoff: Carprofen). Vom Hersteller empfohlene Dosierung: 4 mg/kg</td></tr><tr><td>Lacri-Lube</td><td>Allergan</td><td>PL 00426/0041</td><td>Augensalbe</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12502-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeur Curved 0,7 mm Cup</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Micro Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11083-07</td><td>Zur Durchführung von dorsalen Wurzelquetschungen Verletzungen</td></tr><tr><td>Gewebetrennungsschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Feinschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Goldstein Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 17003-03</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere (gerade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 15018-10</td><td></td></tr><tr><td>SURGIFOAM Resorbierbarer Gelatineschwamm</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>Zur Blutungskontrolle</td></tr><tr><td>Mikroliterspritze RN701 (10 &mu; L)</td><td>Hamilton</td><td>80330</td><td></td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte abnehmbare Nadel (für DRG-Injektion)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 Gauge, 38 mm, Punktform 3</td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte abnehmbare Nadel (für CTB-Injektion)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 Gauge, 10 mm, Punktform 3</td></tr><tr><td>UltraMicroPump mit SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr></tbody></table>

dorsalwurzelganglion injection und dorsale wurzel quetschverletzungen als modell für sensory axonregeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Die Axonregeneration nach einer Verletzung des Nervensystems ist eine herausfordernde Aufgabe. Da sich verschiedene Teile des Zentralnervensystems (ZNS) anatomisch voneinander unterscheiden, ist es wichtig, ein geeignetes Modell für die Untersuchung der Axonregeneration zu identifizieren. Mit Hilfe eines geeigneten Modells können wir eine spezifische Behandlung formulieren, die auf der Schwere der Verletzung, dem interessierenden neuronalen Zelltyp und dem gewünschten Spinaltrakt zur Beurteilung der Regeneration basiert. Innerhalb der sensorischen Bahn sind DRG-Neuronen für die Weiterleitung sensorischer Informationen von der Peripherie zum ZNS verantwortlich. Wir stellen hier ein Protokoll vor, das eine DRG-Injektion mit einem viralen Vektor und eine gleichzeitige Verletzung des dorsalen Wurzelquetsches im unteren zervikalen Rückenmark einer erwachsenen Ratte als Modell zur Untersuchung der sensorischen Axonregeneration verwendet. Wie anhand eines Kontrollvirus, AAV5-GFP, gezeigt, zeigen wir die Wirksamkeit einer direkten DRG-Injektion bei der Transduktion von DRG-Neuronen und der Verfolgung sensorischer Axone in das Rückenmark. Wir zeigen auch die Wirksamkeit der dorsalen Wurzelquetschverletzung bei der Denervierung der Vorderpfote als Verletzungsmodell zur Bewertung der Axonregeneration. Trotz der Notwendigkeit einer speziellen Ausbildung für die Durchführung dieses invasiven chirurgischen Eingriffs ist das Protokoll flexibel, und potenzielle Benutzer können viele Teile modifizieren, um ihren experimentellen Anforderungen gerecht zu werden. Wichtig ist, dass es als Grundlage für diejenigen dienen kann, die auf der Suche nach einem geeigneten Tiermodell für ihre Studien sind. Wir glauben, dass dieser Artikel neuen Benutzern helfen wird, das Verfahren auf sehr effiziente und effektive Weise zu erlernen.

Als Darstellung ist eine quer verlaufende Rückenmark Abschnitt mit dem daran befestigten DRG präsentiert die Wirksamkeit dieses Protokoll zeigen DRG Neurone in transduzierende und sensorischen Axonen im Rückenmark von vier Wochen nach einer Kontrollvirus, AAV5-GFP, direkt in die C7 Verfolgungs Injizieren DRG ohne dorsale Wurzel Quetschverletzungen (Abbildung 1A). Axone in sowohl der dorsalen Säule und dem Hinterhorn des Rückenmarks GFP exprimieren (1B) s...

Dieses Protokoll stellt die Verwendung einer Injektion eines dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen Verletzung des dorsalen Wurzelquetsches bei einer erwachsenen Ratte als Modell zur Untersuchung der sensorischen Axonregeneration dar. Dieses Modell eignet sich, um den Einsatz von Gentherapie zur Förderung der sensorischen Axonregeneration zu untersuchen.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Das Ziel dieses chirurgischen Ansatzes besteht darin, Behandlungen direkt auf der Ebene des neuronalen Zellkörpers anzuwenden und die Regeneration von Axonen nach einer therapeutischen Intervention zu beurteilen, ohne eine schädlichere Läsion im zentralen Nervensystem vornehmen zu müssen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Axonregeneration zu beantworten, beispielsweise, ob therapeutisch behandelte Axone im Rückenmark regenerieren und möglicherweise Zielstrukturen im Hirnstamm erreichen können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Forschende die Regeneration von Axonen im zentralen Nervensystem untersuchen können, ohne das Rückenmark direkt verletzen zu müssen.Dies verringert postoperative Komplikationen und verbessert das Wohlergehen der Tiere. Beginnen Sie damit, das Tier ordnungsgemäß zu anästhesieren. Überprüfen Sie die chirurgische Anästhesietiefe durch das Fehlen einer Reaktion auf einen Zehenquetschreiz.Wiegen Sie dann das Tier und notieren Sie das präoperative Gewicht. Für eine chirurgische DRG-Injektion rasieren Sie das Fell am Hals von zwischen den Ohren bis knapp unterhalb der Schulterblätter. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir stellen eine Methode zur Chromatinimmunpräzipitation aus Spinalganglien Gewebe nach axonalen Verletzungen. Der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetische Modifikation von Histon-und DNA wichtig für die Regeneration von verletzten Axonen sowohl in den peripheren und zentralen Nervensystems zu identifizieren.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Maus Ischiasnerv zu zerschlagen. Diese Methode verwendet leicht verfügbar Arterienklemmen und einfach und reproduzierbar produziert komplette Ischiasnerv verknallt. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um Muskeln ganzen Halterungen für die Analyse der Nervenregeneration nach Ischiasnerv verknallt vorzubereiten.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

Quelle: Li, Q., et al. Untersuchung der Axonregeneration von Säugetieren: In vivo Elektroporation des Spinalwurzelganglion einer adulten Maus. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt den Prozess der axonalen Regeneration in einem Ischiasnerv einer Maus nach einer Quetschverletzung. Der isolierte Nerv wird fixiert und für die Bildgebung vorbereitet, wobei fluoreszierende Proteine in Neuronen exprimiert werden, um das Axonwachstum sichtbar zu machen. Mit einem Epifluoreszenzmikroskop wird die...

Axonale Regeneration im Ischiasnerv einer Maus nach einer Quetschverletzung

Quelle: Cheah, M., et al. Injektion des Spinalwurzelganglion und Dorsale Root Crush Injury als Modell für die Regeneration des sensorischen Axons. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video zeigt ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Injektion einer Virussuspension in die Spinalganglien (DRGs) und zur Induktion einer kontrollierten axonalen Verletzung über einen dorsalen Wurzelcrush bei einer anästhesierten Ratte. Das Protokoll umfasst die Freilegung der DRGs, die Verabreichung eines wachstumsfördernden...

Modellierung der sensorischen Axonregeneration bei einer Ratte mittels Injektion des Spinalganglion und Dorsalwurzelquetschverletzung

Quelle: Li, Q. et al. Untersuchung der Axonregeneration von Säugetieren: In vivo Elektroporation des Spinalwurzelganglion einer adulten Maus. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Elektroporations-vermittelte Transfektion von DRG-Neuronen der Maus zur Untersuchung der Axonregeneration. Es beschreibt die Schritte zur Verabreichung von Nukleinsäurekonstrukten an DRG-Neuronen, zur Induktion von Ischiasnervenverletzungen und zur Beurteilung der axonalen Regeneration.

Elektroporations-vermittelte Transfektion von Spinalganglien der Maus zur Förderung der revitalisierten Axon

Drosophila-Larven sind eine attraktive Modellsystem für Live-Bildgebung aufgrund ihrer schein Kutikula und leistungsfähige Genetik. Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine Single-Layer-PDMS-Gerät, genannt die "Larve Chip" für die Live-Darstellung von zellulären Prozessen in Nervenzellen des 3. Larvenstadium Drosophila-Larven nutzen.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit der Drosophila sensorischen Neuron - dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron, das in Vivo verbindet live imaging, zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy und die mächtigen fliegen genetische Toolbox, als eine Plattform für das screening potenzieller Projektträger und Inhibitoren der Neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Lernen Sie die DRG-Injektion und dorsale Wurzelquetschung zur Untersuchung der sensorischen Axonregeneration bei erwachsenen Ratten. Dieses Modell ermöglicht Gentherapie-Studien ohne direkte Rückenmarksverletzung.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

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