Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Auswirkungen einer bakteriellen Infektion auf die Fähigkeit von Wirtszellen zu untersuchen, Stressgranula als Reaktion auf exogenen Stress zu bilden. Diese Methode ist ein wertvolles Werkzeug in der zellulären Mikrobiologie, um zu beurteilen, ob ein bestimmter Erreger den gesamten Stressgranula-Weg verändern oder unterlaufen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Stressgranula mithilfe kostenloser Bildanalyseprogramme umfassend und automatisiert sowohl qualitativ als auch quantitativ analysiert werden können.

Diese Methode liefert Einblicke in die Dynamik der Stressgranula-Bildung und -Zusammensetzung sowie in die Auswirkungen eines bestimmten Pathogens auf diese Parameter. Vielen Dank. Bevor Sie mit der Infektion beginnen, impfen Sie eine rote Kolonie von S. flexneri M90T von einer frisch ausgestrichenen Tryptic-Soja-Agar-Platte mit 1 % Congo-Rot-Agar in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen, das acht Milliliter Tryptic-Soja-Brühe enthält.

Nach dem Festziehen des Deckels die Kolonie über Nacht unter Schütteln bei 222 U/min und 30 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag 150 Mikroliter der Bakterien in acht Milliliter frische Tryptic-Soja-Brühe für etwa zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 222 U/min unterkultivieren, um eine Induktion der Virulenzgenexpression in der späten exponentiellen Phase einzuleiten und die Infektiosität der Bakterien zu erhöhen. Sobald die optische Dichte der Unter-Kultur zwischen 0,6 und 0,9 liegt, ein Milliliter der Bakterien in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen, um sie durch Zentrifugation zu sammeln.

Und resuspendieren Sie das Pellet in Infektionsmedium mit einer optischen Dichte von eins. Danach saugen Sie die Überstände aus jedem Well einer HeLa-Zell-Deckglas-Kultur ab. Und waschen Sie die HeLa-Zellen vorsichtig mit jeweils 500 µL frischem, auf Raumtemperatur gebrachtem HeLa-Zell-Medium pro Well.

Ersetzen Sie die Waschung durch jeweils 500 µL Infektionsmedium pro Vertiefung und zentrifugieren Sie die 24-Loch-Platte, um die Bakterien auf die Zellen abzuscheiden. Überführen Sie die angesetzten bakteriellen Kokulturen für 30 Minuten in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C, um die Infektion der Wirtszellen zu ermöglichen. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die exogenen Bakterien durch dreimaliges Waschen mit jeweils einem Milliliter frischem HeLa-Kulturmedium bei 37 °C pro Waschgang.

Anschließend die infizierten Zellen mit einem Milliliter frischem Kulturmedium, das Gentamicin enthält, bedecken und die Platte in den Zellkultur-Inkubator zurückstellen. Am Ende der Inkubation das Medium durch 500 Mikroliter des geeigneten Kulturmediums ersetzen, das mit dem gewünschten Stressor ergänzt ist, und die Zellen erneut in den Gewebekultur-Inkubator zurückbringen. Nach einer Stunde das Überstand vollständig abpipettieren und die Proben in 0,5 Milliliter 4 %iger Paraformaldehyd-Lösung in PBS bei Raumtemperatur für 30 Minuten fixieren.

Entfernen Sie anschließend das Fixativ in den geeigneten Abfallbehälter und waschen Sie die Deckgläser mit einem Milliliter trisgepufferter Salzlösung zwei Minuten lang unter vorsichtigem Schütteln. Am Ende der Wäsche aspirieren Sie das TBS vollständig und permeabilisieren die Zellen in jeder Vertiefung mit 500 Mikrolitern 0,3 % Triton X-100 in TBS. Nach 10 Minuten ersetzen Sie die Permeabilisierungslösung durch ein Milliliter TBS, schwenken die Platte vorsichtig und ersetzen anschließend das TBS durch ein Milliliter Blockierungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Um die Zellen mit einem gewünschten Primärantikörper-Cocktail zu markieren, geben Sie 50 Mikroliter der Primärantikörper-Mischung pro Deckglas auf ein Stück Plastik-Parafilm, das fest auf der Arbeitsfläche mit Klebeband befestigt ist. Heben Sie dann mit einer Pinzette das erste Deckglas auf und tupfen Sie den Rand des Deckglases vorsichtig auf ein Stück Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Platzieren Sie die Deckglas vorsichtig auf dem Tropfen und inkubieren Sie die Deckgläser unter den geeigneten Markierungsbedingungen. Am Ende der Inkubation mit dem primären Antikörper überführen Sie jedes Deckglas in eine einzelne Vertiefung einer neuen 24-Loch-Platte, die je Vertiefung ein Milliliter TBS enthält, und waschen Sie die Zellen dreimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler. Nach dem letzten Waschschritt markieren Sie die Zellen auf jedem Deckglas mit der entsprechenden Sekundärantikörper-Cocktail-Mischung, wie zuvor gezeigt.

Und inkubieren Sie die Deckgläser eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Ende der Inkubation mit dem sekundären Antikörper waschen Sie die Zellen dreimal in je einem Milliliter PBS in einer neuen 24-Well-Platte mit sanftem Schütteln, wie gerade gezeigt, jedoch lichtgeschützt. Nach dem letzten Waschschritt tauchen Sie jedes Deckglas kurz in deionisiertes Wasser, um das Salz zu entfernen, tupfen die Ränder des Deckglases vorsichtig mit einem Tuch ab und montieren die Deckgläser sorgfältig auf je fünf Mikroliter Fluoreszenz-Einbettmedium pro Objektträger, wobei keine Blasen entstehen dürfen.

Dann verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack und lagern Sie die Objektträger bis zur Bildaufnahme entsprechend. Um die Zellen mittels fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie abzubilden, wählen Sie zunächst das geeignete Objektiv und die geeigneten fluoreszierenden Kanäle für die Bildaufnahme aus.

Erwerben Sie anschließend Bildstapel der Zellen mithilfe der geeigneten Bildgebungssoftware. Sobald alle Bilder aufgenommen wurden, verwenden Sie die geeignete Bildanalyse-Software, um die Bildstapel zusammenzuführen, und speichern Sie die Stapel als TIFF-Dateien. Laden Sie danach ein Kontroll- und ein experimentelles TIFF-Bild in die Bildanalyseplattform und wählen Sie „Lookup Table“, um die Kanalparameter im Sequenzfenster zu öffnen.

Klicken Sie auf alle Kontrollkästchen der Kanalregisterkarten, um alle Kanäle zu deaktivieren. Klicken Sie dann auf Kanal null und auf die Farbleiste von Kanal null, um die gewünschte Farbe auszuwählen, und erhöhen Sie gegebenenfalls die Intensität des Kanals, um alle Strukturen sichtbar zu machen. Nachdem Sie die geeigneten Farbkanäle für die experimentelle Analyse ausgewählt und angepasst haben, wählen Sie die Registerkarte „Canvas“ und passen Sie die Zoom-Registerkarte so an, dass etwa 10 Zellen pro Sichtfeld sichtbar sind.

Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, klicken Sie auf die Zelle von Interesse und ziehen Sie die Linie um die Zelle herum, um die Zellgrenze abzugrenzen. Um diesen Bereich von Interesse zu benennen, klicken Sie im Fenster „Region of Interest“ mit der rechten Maustaste auf die Zelle von Interesse und doppelklicken Sie auf den Namen der Region of Interest, um diesen zu ändern. Nachdem alle Zellen von Interesse auf dieselbe Weise ausgewählt und benannt wurden, öffnen Sie die Spot-Detektor-Anwendung im Reiter „Detection and Tracking“.

Öffnen Sie die Registerkarte „Pre Processing“ und wählen Sie den zu analysierenden Kanal aus. Wählen Sie im Bereich „Detector“ die Option „Helle Punkte auf dunklem Hintergrund erkennen“ und stellen Sie den geeigneten Maßstab und die entsprechende Empfindlichkeit ein. Wählen Sie unter der Registerkarte „Region of Interest“ den vorgeschlagenen Bereich von Interesse aus der Sequenz aus.

Wählen Sie unter der Registerkarte „Filterung“ die Option „Keine Filterung“. Wählen Sie im Ausgabebereich die entsprechende Ausgabe aus. Aktivieren Sie „Vorherige als Regionen von Interesse markierte Stellen entfernen“ und klicken Sie auf „keine Datei ausgewählt“, um den Ordner zum Speichern der Datei auszuwählen.

Dann im Reiter „Anzeige“ die entsprechenden gewünschten Optionen auswählen und auf „Erkennung starten“ klicken. Mithilfe der Bildanalyse-Software kann der Fleckendetektor verwendet werden, um die Stress-Granula innerhalb der jeweils festgelegten Regionen von Interesse zu identifizieren. Anschließend kann ein Binärbild erstellt werden, das alle identifizierten Stress-Granula darstellt.

Die Analyse von Stress-Granula muss sorgfältig an jeden untersuchten Markt für Stress-Granula angepasst werden. Beispielsweise führen Änderungen der Größenanforderung des erfassten interessierenden Bereichs oder der Empfindlichkeit der Erkennungsparameter zu unterschiedlichen Ergebnissen. Bei größeren Pixeldimensionen werden kleinere Stress-Granula nicht gezählt, und die Anzahl der Stress-Granula nimmt ab.

Wenn die Empfindlichkeit erhöht wird, steigt auch die Anzahl der Stress-Granula. Beispielsweise ergab in diesem Experiment ein Maßstab von zwei bei einer Empfindlichkeit von 100 das beste Ergebnis für den Stress-Granula-Marker G3BP1. Hingegen ergab ein Maßstab von zwei bei einer Empfindlichkeit von 55 das beste Ergebnis für den EIF3B-Stress-Granula-Marker.

Die Oberfläche kann anschließend anhand der Größe der Stress-Granula berechnet werden. Häufigkeitsverteilungsdiagramme eignen sich gut, um Verschiebungen in der Größe der Stress-Granula zwischen verschiedenen Zellpopulationen hervorzuheben. Außerdem kann die Intensität der Fluoreszenz Informationen über die Qualität der analysierten Stress-Granula liefern.

Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann die gesamte Zellbelastung in etwa sechs bis sieben Stunden durchgeführt werden, und die Analyse kann in weiteren zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets die Kontroll- und die experimentellen Proben gleichzeitig und unter denselben Bedingungen zu verarbeiten, um die Variabilität innerhalb der Daten zu minimieren. Nach diesem Verfahren kann die Analyse zusätzlich auf ein dreidimensionales Volumen erweitert werden, um weitere Einblicke in die Lokalisation von Stressgranula zu erhalten.

Dieses halbautomatisierte Verfahren ermöglicht eine stringente und unvoreingenommene Analyse von Stress-Granula in nicht infizierten und infizierten Zellen. Es kann bisher unbekannte Störungen des Stress-Granula-Weges aufdecken. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen mit Bakterien infiziert, die Bildung von Stress-Granula induziert und wie man einen halbautomatisierten Ansatz zur qualitativen und quantitativen Analyse von Stress-Granula verwendet.

Und vergessen Sie nicht, dass Shigella flexneri und Stress-Granula-induzierende Wirkstoffe wie Clotrimazol gefährlich sein können und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Arbeiten in einem Sicherheitslabor der Stufe 2 sowie die ordnungsgemäße Entsorgung aller Reagenzien erforderlich sind.