Name: Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Erfahren Sie eine Immunfluoreszenzmethode zur Analyse von Stressgranula-Bildung in Säugetierzellen nach bakterieller Infektion. Diese Technik ermöglicht die automatisierte quantitative Untersuchung zellulärer Stressantworten.

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PS ist ein Empfänger der Bill und Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV wurde von einem Schweizerischen National Science Foundation Early Postdoc Mobility Stipendium und einem Roux-Cantarini Postdoktorandenstipendium unterstützt. PJS wird von einem HHMI-Stipendium und ERC-2013-ADG 339579-Entschlüsselung unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion, Lokalisierung und Analyse von SGs in nicht-infizierten Zellen und Zellen, die mit dem cytosolischen Pathogen S. flexneri in Gegenwart oder Abwesenheit von exogenem Stress infiziert sind. Mit Hilfe der kostenlosen Imaging-Software erlauben die Protokolle die präzise qualitative und quantitative Analyse der SG-Bildung, um die Unterschiede in den gegebenen Phänotypen zu identifizieren und statistisch zu adressieren. Es gibt mehr...

Die Visualisierung von Host-Pathogen-Interaktionen auf zellulärer Ebene ist eine leistungsstarke Methode, um Einblicke in pathogene Strategien zu gewinnen und wichtige Zellwege zu identifizieren. In der Tat können Pathogene als Werkzeuge verwendet werden, um wichtige zelluläre Ziele oder Strukturen zu lokalisieren, da sich Pathogene entwickelt haben, um zentrale zelluläre Prozesse als Strategie für ihr eigenes Überleben oder ihre Ausbreitung zu untergraben. Die Visualisierung von zellulären Komponenten kann durch rekombinante Expression von fluoreszenzmarkierten Wirtsproteinen erreicht werden. Während dies eine Echtzeitanalyse ermöglicht, ist die Erzeugung von Zelllinien mit speziell markierten Wirtsproteinen sehr aufwendig und kann zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Zweckmäßiger ist der Nachweis von zellulären Faktoren, die spezifische Antikörper verwenden, da mehrere Wirtsfaktoren gleichzeitig analysiert werden können und einer nicht auf einen bestimmten Zelltyp beschränkt ist. Ein Nachteil ist, dass nur eine statische Ansicht erfasst werden kann, da die Immunfluoreszenzanalyse die Wirtszell-Fixierung erfordertIon. Ein wichtiger Vorteil der Immunfluoreszenz-Bildgebung ist jedoch, dass sie sich sowohl qualitative als auch quantitative Analysen eignet. Dies wiederum kann verwendet werden, um statistisch signifikante Unterschiede zu erhalten, um neue Einblicke in Host-Pathogen-Wechselwirkungen zu liefern. Fluoreszierende Bildanalyse-Programme sind leistungsstarke analytische Werkzeuge für die Durchführung von 3D- und 4D-Analysen. Allerdings sind die hohen Kosten der Software und ihre Wartung machen Methoden auf freie Open-Source-Software mehr attraktiv. Eine sorgfältige Bildanalyse mit Bioanalyse-Software ist wertvoll, da sie die visuelle Analyse untermauert und bei der Zuweisung statistischer Signifikanzen das Vertrauen in die Richtigkeit eines gegebenen Phänotyps erhöht. Bisher wurden SGs mit der freien ImageJ Software analysiert, was die manuelle Identifikation einzelner SGs 4 erfordert. Hier stellen wir ein Protokoll für die Induktion und Analyse der zellulären SG-Bildung im Rahmen von bac zur VerfügungTerial-Infektionen mit der freien Open-Source-Bio-Bild-Analyse-Software ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Die Bio-Bildanalyse-Software verfügt über ein eingebautes Spot-Detektor-Programm, das sich hervorragend für die SG-Analyse eignet. Es ermöglicht die Feinabstimmung des automatisierten Erkennungsprozesses in bestimmten Regionen von Interesse (ROIs). Dies überwindet die Notwendigkeit einer manuellen Analyse einzelner SGs und beseitigt die Abtastvorspannung. Viele Umgebungsbelastungen induzieren die Bildung von SGs, die phasen-dichte zytosolische, nicht-membranöse Strukturen von 0,2 - 5 μm im Durchmesser 5 , 6 sind . Diese zelluläre Antwort ist evolutionär in Hefe, Pflanzen und Säugetieren konserviert und tritt auf, wenn die globale Protein-Translation gehemmt wird. Es handelt sich um die Aggregation von blockierten Translationsinitiationskomplexen in SGs, die als Haltungsplätze für translational-inaktive mRNAs betrachtet werden, was eine selektive Translation einer Untermenge von zellulären mRNAs ermöglicht.Nach der Beseitigung der Belastung, SGs auflösen und globale Preise der Proteinsynthese wieder aufnehmen. SGs bestehen aus Translationsdehnungsinitiationsfaktoren, Proteinen, die an dem RNA-Metabolismus beteiligt sind, RNA-bindende Proteine ​​sowie Gerüstproteine ​​und Faktoren, die an der Wirtszell-Signalisierung 2 beteiligt sind , obwohl die genaue Zusammensetzung in Abhängigkeit von der angewandten Belastung variieren kann. Umwelteinflüsse, die die SG-Bildung induzieren, schließen die Aminosäure-Verhungern, die UV-Bestrahlung, den Hitzeschock, den osmotischen Schock, den endoplasmatischen Retikulumstress, die Hypoxie und die Virusinfektion 2 , 7 , 8 ein . Es wurde viel Fortschritte gemacht, um zu verstehen, wie Viren die SG-Bildung induzieren und auch untergraben, während wenig darüber bekannt ist, wie andere Pathogene wie Bakterien-, Pilz- oder Protozoenpathogene diese zelluläre Stressreaktion 1 , 7 beeinflussen . ShigeLla flexneri ist ein gram-negatives fakultatives zytosolisches Pathogen des Menschen und der Erreger von schweren Durchfall oder Shigellosis. Shigellosis ist eine große öffentliche Gesundheit Belastung und führt zu 28.000 Todesfälle jährlich bei Kindern unter 5 Jahren im Alter von 9 , 10 . S. flexneri infiziert das Kolon-Epithel und verbreitet Zelle-zu-Zelle durch Entführung der Zytoskelettkomponenten des Wirts 11 , 12 . Die Infektion des Epithels unterstützt die Replikation von S. flexneri innerhalb des Cytosols, aber infizierte Makrophagen sterben durch einen entzündlichen Zelltodprozess namens Pyroptose. Infektion führt zu einer massiven Rekrutierung von Neutrophilen und einer schweren Entzündung, die von Hitze, oxidativem Stress und Gewebezerstörung begleitet wird. Während also infizierte Zellen internen Belastungen durch Infektion induziert werden, wie z. B. Golgi-Störung, genotoxischer Stress und zytoskeletale UmlagerungS, infizierte Zellen sind auch Umweltbelastungen durch den entzündlichen Prozess unterworfen. Die Charakterisierung der Wirkung von S. flexneri- Infektion auf die Fähigkeit von Zellen, auf Umweltbelastungen mit einer Anzahl von SG-Markern zu reagieren, hat gezeigt, dass die Infektion zu qualitativen und quantitativen Unterschieden in der SG-Zusammensetzung führt 3 . Allerdings ist wenig über andere bakterielle Pathogene bekannt. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Infektion von Wirtszellen mit dem zytosolischen Pathogen S. flexneri , die Beanspruchung von Zellen mit unterschiedlichen Umweltbelastungen, die Markierung von SG-Komponenten und die qualitative und quantitative Analyse der SG-Bildung und Zusammensetzung im Kontext von infizierten Und nicht infizierten Zellen. Diese Methode ist weithin anwendbar auf andere bakterielle Pathogene. Zusätzlich kann die Bildanalyse der SG-Bildung für Infektionen durch Viren oder andere Pathogene verwendet werden. Es kann verwendet werden, um SG zu analysierenBildung bei Infektion oder die Wirkung einer Infektion auf die SG-Bildung als Reaktion auf exogene Spannungen.

<table><tbody><tr><td>Primärantikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eIF3b (N20), Herkunft Ziege&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>Robuster und weit verbreiteter SG-Markierer. Die zytosolische Färbung ermöglicht die Abgrenzung von Zellen. Verdünnung 1:300</td></tr><tr><td>eIF3b (A20), Herkunft Ziege&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16378</td><td>Gleiches Ziel wie eIF3b (N20) und in unseren Händen war identisch mit eIF3b (N20). Verdünnung 1:300</td></tr><tr><td>eIF3A (D51F4), Herkunft Kaninchen (MC: monoklonal)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>3411</td><td>Teil des Multiprotein-eIF3-Komplexes mit eIF3b . Verdünnung 1:800</td></tr><tr><td>eIF4AI, Herkunft Ziege&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-14211</td><td>Empfohlen von (Ref # 13). Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>eIF4B, Herkunft Kaninchen</td><td>Abcam</td><td>ab186856</td><td>Guter Stressgranulatmarker in unseren Händen. Verdünnung 1:300</td></tr><tr><td>eIF4B, Herkunft</td><td>Kaninchenzell-Signalisierung</td><td>3592</td><td>Empfohlen von Ref # 13. Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>eIF4G, Herkunft Kaninchen</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Weit verbreiteter SG-Marker. (Ref # 13): funktioniert möglicherweise nicht gut in Mauszelllinien. Verdünnung 1:300</td></tr><tr><td>G3BP1, Herkunft Kaninchen (MC: monoklonal)</td><td>BD Biosciences</td><td>611126</td><td>Weit verbreiteter SG-Marker. Verdünnung 1:300</td></tr><tr><td>Tia-1, Herkunft Ziege&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1751</td><td>Weit verbreiteter SG-Markierer. Kann auch in P-Körpern gefunden werden, wenn SG vorhanden sind (Ref # 13). Verdünnung 1:300</td></tr><tr><td>Alexa-konjugierte Sekundärantikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A488 Anti-Ziege, Herkunft Esel</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11055</td><td>Kreuz absorbiert. Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>A568 Anti-Ziege, Herkunft Esel</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11057</td><td>Kreuz absorbiert. Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>A488 Anti-Maus, Herkunft Esel</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>A568 Anti-Maus, Herkunft Esel</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10037</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>A647 Anti-Maus, Herkunft Esel</td><td>Thermo Fisher</td><td>A31571</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>A488 Anti-Kaninchen, Herkunft Esel</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21206</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>A568 Anti-Kaninchen, Herkunft Esel</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10042</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Andere Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shigella flexneri</td><td></td><td></td><td>Erhältlich in verschiedenen Labors auf Anfrage</td></tr><tr><td>Trypton Casein Soja (TCS) Bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>211825</td><td>Standard Wachstumsmedium für Shigellen, Anwendung - Bakterienwachstum</td></tr><tr><td>TCS-Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>236950</td><td>Standard-Wachstumsagar für Shigellen, Anwendung - Bakterienwachstum</td></tr><tr><td>Kongorot</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>27215.01</td><td>Distriminierungswerkzeug für Shigell, die das Virulenzplasmid verloren haben, Anwendung - Bakterienwachstum</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274</td><td>Nützlich zur Beschichtung von Bakterien, um die Infektion zu erhöhen, Anwendung - Infektion</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Selektive Abtötung von extrazellulären, aber nicht zytosolischen Bakterien, Anwendung</td></tr><tr><td>- Infektion HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056 PH-Puffer</td><td>nützlich bei der Inkubation von Zellen bei RT, Anwendung - Zellkultur</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>31885</td><td>Standardkulturmedium für HeLa-Zellen, Anwendung - Zellkultur</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S1810-100</td><td>5%ige Supplementierung für HeLa-Zellkulturmedium, Anwendung - Zellkultur</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td>1:100 Verdünnung für HeLa-Zellkulturmedium, Anwendung - Zellkultur</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Reagenzverdünnungsmittel, Anwendung - Zellkultur</td></tr><tr><td>Natriumarsenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7400</td><td>Potenter Stressgranulat-Induktor (Hinweis: hochgiftig, besondere Handhabung und Entsorgung erforderlich), Anwendung - Stressinduktor</td></tr><tr><td>Clotrimazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6019</td><td>Potenter Stressgranulat-Induktor (Hinweis: Gesundheitsgefahr, besondere Handhabung und Entsorgung erforderlich), Anwendung - Stressinduktor</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA-Elektronenmikroskopie</td><td></td><td>15714</td><td>)4% PFA wird für die Standardfixierung von Zellen verwendet, Anwendung - Fixierung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Wird bei 0,03% für die Permeabilisierung von Wirtszellen vor der Immunfluoreszenzfärbung verwendet, Anwendung - Permeabilisierung</td></tr><tr><td>A647-Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22287</td><td>Verdünnung erfolgt bei 1:40, am besten während der Sekundärantikörperfärbung zugegeben, Anwendung - Färbung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Nucdidsäurefärbung zur Visualisierung des Wirtskerns und von Bakterien, Anwendung - Färbung</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR701501</td><td>Paraffinfilm nützlich für Immunfluoreszenzfärbung von Deckgläsern, Anwendung - Färbung</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>36930</td><td>Robustes Eindeckmedium, das für die meisten Fluorophore geeignet ist, Anwendung - Einbetten</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Günstiges und robustes Eindeckmedium, das für die meisten Fluorophore geeignet ist, Anwendung - Einbetten</td></tr> von <tr><td>24-Well-Zellkulturplatten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>Standard-Gewebekulturplatten, Anwendung - Zellkultur</td></tr><tr><td>12 mm&nbsp; Glasdeckgläser</td><td>NeuVitro</td><td>1001/12</td><td>Zellkulturträger für Immunfluoreszenzanwendungen, Anwendung - Zellstützzange</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Günstiges und robustes Eindeckmedium, das für die meisten Fluorophore geeignet ist, Anwendung - Einbetten</td></tr><tr><td>Programme und Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Datenanalyse- und Grafikprogramm mit robusten statistischen Testoptionen, Anwendung - Datenanalyse</td></tr><tr><td>Leica SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Konfokales Mikrosystem, Anwendung - Bild Akquisition</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Professionelles Bildanalyseprogramm, Anwendung - Datenanalyse</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Datenanalyse</td><td></td><td>- und Grafikprogramm, Anwendung - Datenanalyse</td></tr></tbody></table>

immunfluoreszenzanalyse der stressgranulat-bildung nach bakterieller herausforderung von säugetierzellen

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Die Fluoreszenz-Bildgebung von zellulären Komponenten ist ein wirksames Instrument zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen. Pathogene können viele verschiedene Merkmale infizierter Zellen beeinflussen, darunter Organellen-Ultrastruktur, zytoskeletale Netzwerkorganisation sowie zelluläre Prozesse wie Stressgranulat (SG). Die Charakterisierung, wie Pathogene Host-Prozesse untergraben, ist ein wichtiger und integraler Bestandteil des Feldes der Pathogenese. Während variable Phänotypen leicht sichtbar sind, ist die genaue Analyse der qualitativen und quantitativen Unterschiede in den zellulären Strukturen, die durch die pathogene Herausforderung induziert werden, für die Festlegung statistisch signifikanter Unterschiede zwischen experimentellen und Kontrollproben unerlässlich. SG-Bildung ist eine evolutionär konservierte Stressreaktion, die zu antiviralen Reaktionen führt und seit langem mit viralen Infektionen untersucht wird 1 . SG-Bildung wirkt sich auch auf Signalkaskaden aus und kann noch andere noch unbekannte Konsequenzen habenUnces 2 Die Charakterisierung dieser Stressreaktion auf andere Pathogene als Viren, wie bakterielle Pathogene, ist derzeit ein aufstrebendes Forschungsgebiet 3 . Dennoch ist die quantitative und qualitative Analyse der SG-Bildung noch nicht routinemäßig, auch in den viralen Systemen. Hier beschreiben wir ein einfaches Verfahren zur Induktion und Charakterisierung der SG-Bildung in nicht infizierten Zellen und in mit einem zytosolischen Bakterienpathogen infizierten Zellen, die die Bildung von SGs als Reaktion auf verschiedene exogene Spannungen beeinflussen. Die Analyse der SG-Bildung und -Anlage wird durch die Verwendung einer Anzahl von verschiedenen SG-Markern und des Spotdetektor-Plugins von ICY, einem Open-Source-Bildanalyse-Tool, erreicht.

Um das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll zu erläutern und zu demonstrieren, charakterisierten wir das Bild von Clotrimazol-induzierten SGs in HeLa-Zellen, die mit dem cytosolischen Pathogen S. flexneri infiziert waren oder nicht. Eine Skizze des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt und umfasst virulente und avirulierende S. flexneri, die auf kongo-rote Platten, Bakterienpräparation, Infektion, Zusatz von Umweltbelastung, Prob...

Wir beschreiben eine Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse der Stressgranulatbildung in Säugetierzellen, nachdem die Zellen mit Bakterien und einer Anzahl unterschiedlicher Belastungen herausgefordert wurden. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die zelluläre Stressgranulat-Antwort in einem breiten Bereich von Wirts-bakteriellen Wechselwirkungen zu untersuchen.

Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Auswirkungen einer bakteriellen Infektion auf die Fähigkeit von Wirtszellen zu untersuchen, Stressgranula als Reaktion auf exogenen Stress zu bilden. Diese Methode ist ein wertvolles Werkzeug in der zellulären Mikrobiologie, um zu beurteilen, ob ein bestimmter Erreger den gesamten Stressgranula-Weg verändern oder unterlaufen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Stressgranula mithilfe kostenloser Bildanalyseprogramme umfassend und automatisiert sowohl qualitativ als auch quantitativ analysiert werden können.Diese Methode liefert Einblicke in die Dynamik der Stressgranula-Bildung und -Zusammensetzung sowie in die Auswirkungen eines bestimmten Pathogens auf diese Parameter. Vielen Dank. Bevor Sie mit der Infektion beginnen, impfen Sie eine rote Kolonie von S. flexneri M90T von einer frisch ausgestrichenen Tryptic-Soja-Agar-Platte mit 1 % Congo-Rot-Agar in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen, das acht Milliliter Tryptic-Soja-Brühe enthält.Nach dem Festziehen des Deckels die Kolonie über Nacht unter Schütteln bei 222 U/min und 30 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag 150 Mikroliter der Bakterien in acht Milli

immunofluorescence-analysis-stress-granule-formation-after-bacterial

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Cayron, J., et al. Multiskalige Analyse des Bakterienwachstums unter Stressbehandlungen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt, wie eine mikrofluidische Platte für die Abbildung von Bakterienzellen unter Stressbedingungen vorbereitet und verwendet wird. Es wird der Prozess der Einführung einer Bakterienkultur und eines stressinduzierenden antibiotischen Mediums beschrieben, gefolgt von der Zellbeladung und dem mikroskopischen Aufbau. Mit Hilfe der Zeitraffer-Bildgebung im...

Mikroskopische Analyse des Bakterienwachstums unter Stress mit Hilfe von mikrofluidischen Kammern

Quelle: Vonaesch, P. et al., Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulatbildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Infektion von Epithelzellen mit dem pathogenen Bakterium Shigella flexneri und die daraus resultierende zelluläre Reaktion des Wirts. Bakterielle Effektorproteine stören die Wirtstranslation und lösen die Bildung membranloser Organellen aus, sogenannte Stressgranulate, die die adaptive Reaktion der Zelle auf...

Stressgranulatbildung während der Shigella-Infektion von krebsartigen Epithelzellen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung von Stressgranula bei Säugetieren, die aus mRNAs, RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und verschiedenen anderen Proteinen bestehen.

Ein Immunfluoreszenz-Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung von Stressgranula bei Säugetieren

Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

Wir haben eine mikrofluidische Plattform für schnelle Antibiotika-Empfindlichkeitstests entwickelt. Flüssigkeit wird mit hohen Geschwindigkeiten über Bakterien geleitet, die auf dem Boden eines mikrofluidischen Kanals immobilisiert werden. In Gegenwart von Stress und Antibiotika sterben anfällige Bakterienstämme schnell ab. Resistente Bakterien können diese belastenden Bedingungen jedoch überleben.

Stressinduzierte Antibiotika-Anfälligkeitstests auf einem Chip

Stress-Granulat (DMS) sind zytoplasmatische RNA Granulat installiert Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) und in der zellulären Antwort auf verschiedene Belastungen wichtig enthalten. Dynamik der SGs können in lebenden Zellen durch die Visualisierung der Lokalisation einer markierten Komponente von SGs in transfizierten primären Zellen nach Stress verfolgt werden.

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

Stressgranulate (SGs) sind nichtmembranöse zytoplasmatische Strukturen, die sich in Zellen bilden, die einer Vielzahl von Spannungen ausgesetzt sind. SGs enthalten mRNAs, RNA-bindende Proteine, kleine ribosomale Untereinheiten, Translations-bezogene Faktoren und verschiedene Zell-Signal-Proteine. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der mehrere experimentelle Ansätze verwendet, um bona fide SGs zu erkennen, zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die Verwendung von STED-Mikroskopie, gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen, die auf Deckgläsern beschichtet mit Antikörpern gegen den B-Zell-Rezeptor, ein Modell für die Anfangsphase verbreitet haben der immun Synapse Formation.

Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Wir präsentieren einen frei verfügbaren Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in bestimmten Zellkompartimenten in Fluoreszenzmikroskopiebildern. Dieser benutzerfreundliche Workflow wurde auf der Open-Source-Software Icy entwickelt und verwendet auch ImageJ-Funktionalitäten. Die Pipeline ist ohne Kenntnisse in der Bildanalyse erschwinglich.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

Erfahren Sie eine Immunfluoreszenzmethode zur Analyse von Stressgranula-Bildung in Säugetierzellen nach bakterieller Infektion. Diese Technik ermöglicht die automatisierte quantitative Untersuchung zellulärer Stressantworten.

Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

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