Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Auswirkungen einer bakteriellen Infektion auf die Fähigkeit von Wirtszellen zu bewerten, Stressgranula zu bilden, um auf exogenen Stress zu reagieren. Diese Methode ist ein wertvolles Werkzeug auf dem Gebiet der zellulären Mikrobiologie, um zu beurteilen, ob ein bestimmter Krankheitserreger in der Lage ist, den gesamten Stressgranula-Signalweg zu verändern oder zu untergraben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stressgranula qualitativ und quantitativ rigoros und automatisiert mit kostenlosen Bildanalyseprogrammen analysiert werden können.

Diese Methode gibt Aufschluss über die Dynamik der Bildung und Zusammensetzung von Stressgranulieren und darüber, wie diese Parameter von einem bestimmten Erreger beeinflusst werden. Vielen Dank. Bevor Sie mit der Challenge beginnen, impfen Sie eine rote S.flexneri M90T-Bakterienkolonie aus einer frisch gestreiften tryptischen Soja-Agar-Platte mit 1 % Kongo-Rot-Agar in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das acht Milliliter tryptische Sojabrühe enthält.

Nachdem Sie den Deckel festgezogen haben, inkubieren Sie die Kolonie über Nacht unter Schütteln bei 222 U/min und 30 Grad Celsius. Am nächsten Tag subkultivieren Sie 150 Mikroliter der Bakterien in acht Millilitern frischer tryptischer Sojabrühe für etwa zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 222 U/min, um eine späte exponentielle Phaseninduktion der Virulenzgenexpression einzuleiten und die bakterielle Infektierbarkeit zu verbessern. Wenn die optische Dichte der Subkultur zwischen 0,6 und 0,9 liegt, wird ein Milliliter der Bakterien in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt, um sie durch Zentrifugation zu sammeln.

Und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Infektionsmedium mit einer optischen Dichte von eins. Als nächstes aspirieren Sie die Überstände aus jeder Vertiefung einer HeLa-Zell-Deckglaskultur. Und waschen Sie die HeLa-Zellen vorsichtig mit 500 Mikrolitern frischem HeLa-Zellmedium bei Raumtemperatur pro Well.

Ersetzen Sie die Wäsche durch 500 Mikroliter Infektionsmedium pro Vertiefung und zentrifugieren Sie die 24-Well-Platte, um die Bakterien auf die Zellen zu schleudern. Übertragen Sie die abgesetzten bakteriellen Kokulturen für 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator, um die Infektion der Wirtszelle zu erleichtern. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die exogenen Bakterien mit drei Spülgängen in einem Milliliter frischem 37 Grad Celsius HeLa-Kulturmedium pro Waschgang aus den Zellen.

Decken Sie dann die infizierten Zellen mit einem Milliliter frischem Kulturmedium ab, das Gentamicin enthält, und stellen Sie die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation wird das Medium durch 500 Mikroliter des entsprechenden Nährmediums ersetzt, das mit dem gewünschten Stressor ergänzt wird, und die Zellen wieder in den Gewebekultur-Inkubator zurückgeführt. Nach einer Stunde wird der Überstand vollständig aspiriert und die Proben 30 Minuten lang in 0,5 Millilitern 4%-Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur fixiert.

Entsorgen Sie anschließend das Fixiermittel in den entsprechenden Abfallbehälter und waschen Sie die Deckgläser zwei Minuten lang mit einem Milliliter Tris-gepufferter Kochsalzlösung unter leichtem Schütteln. Am Ende des Waschvorgangs aspirieren Sie das TBS vollständig und permeabilisieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 500 Mikrolitern 0,3 % Triton X-100 in TBS. Ersetzen Sie nach 10 Minuten die permeabilisierende Lösung durch einen Milliliter TBS, schwenken Sie die Platte vorsichtig und ersetzen Sie die TBS eine Stunde lang bei Raumtemperatur durch einen Milliliter Blockierungslösung.

Um die Zellen mit einem primären Antikörpercocktail von Interesse zu markieren, geben Sie 50 Mikroliter des primären Antikörpermixes pro Deckglas auf ein Stück Parafilm aus Kunststoff, das fest auf die Tischplatte geklebt ist. Nehmen Sie dann mit einer Pinzette das erste Deckglas auf. Tupfen Sie den Rand des Deckglases auf ein Stück Seidenpapier, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Legen Sie das Deckglas vorsichtig auf den Tropfen und inkubieren Sie die Deckgläser unter den entsprechenden Etikettierungsbedingungen. Am Ende der Inkubation der primären Antikörpermarkierung werden alle Deckgläser in eine einzelne Vertiefung einer neuen 24-Well-Platte mit einem Milliliter TBS pro Vertiefung überführt und die Zellen dreimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler gewaschen. Nach der letzten Wäsche beschriften Sie die Zellen auf jedem Deckglas mit der entsprechenden Sekundärantikörper-Cocktail-Mischung, wie gerade gezeigt.

Und inkubieren Sie die Deckgläser eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation der sekundären Antikörpermarkierung waschen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS dreimal in einer neuen 24-Well-Platte unter leichtem Schütteln, wie gerade gezeigt, aber vor Licht geschützt. Tauchen Sie nach dem letzten Waschen jedes Deckglas kurz in entionisiertes Wasser, um das Salz zu entfernen, tupfen Sie die Deckglaskanten auf ein Taschentuch und montieren Sie die Deckgläser vorsichtig blasenfrei auf fünf Mikroliter Fluoreszenzeindeckmedium pro Objektträger.

Versiegeln Sie dann das Deckglas mit Nagellack. Und bewahren Sie die Objektträger nach Bedarf bis zur Bildgebung auf. Um die Zellen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, wählen Sie zunächst das geeignete Objektiv und die geeigneten Fluoreszenzkanäle für die Bildaufnahme aus.

Erfassen Sie dann Bildstapel der Zellen mit der entsprechenden Bildgebungssoftware. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, verwenden Sie die entsprechende Bildanalysesoftware, um die Bildstapel zu reduzieren und als TIFF-Dateien zu speichern. Laden Sie als Nächstes ein Steuerelement und ein experimentelles TIFF-Bild auf die Bildanalyseplattform und wählen Sie Nachschlagetabelle aus, um die Kanalparameter im Sequenzfenster zu öffnen.

Klicken Sie auf alle Kontrollkästchen auf der Registerkarte "Kanäle", um alle Kanäle zu deaktivieren. Klicken Sie dann auf Kanal Null und dann auf die Farbleiste Kanal Null, um die bevorzugte Farbe auszuwählen und die Intensität des Kanals nach Bedarf zu erhöhen, um alle Strukturen zu visualisieren. Nachdem Sie jeden der geeigneten Farbkanäle für die experimentelle Analyse ausgewählt und angepasst haben, wählen Sie die Registerkarte Leinwand aus, und passen Sie die Registerkarte Zoom so an, dass etwa 10 Zellen pro Anzeigefeld visualisiert werden.

Klicken Sie mit dem Polygonwerkzeug auf die gewünschte Zelle, und verlängern Sie die Linie um die Zelle, um die Zellengrenze zu markieren. Um diesen Interessenbereich zu benennen, klicken Sie im Fenster "Interessenbereich" mit der rechten Maustaste auf die gewünschte Zelle, und doppelklicken Sie auf den Namen des Interessenbereichs, um ihn zu ändern. Nachdem Sie alle interessierenden Zellen auf die gleiche Weise ausgewählt und benannt haben, öffnen Sie die Anwendung "Spot Detector" auf der Registerkarte "Erkennung und Verfolgung".

Öffnen Sie den Reiter Pre Processing und wählen Sie den Kanal aus, der analysiert werden soll. Wählen Sie auf der Registerkarte Detektor die Option Helle Flecken über dunklem Hintergrund erkennen und wählen Sie die entsprechende Skala und Empfindlichkeit aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Interessenbereich den vorgeschlagenen Interessenbereich aus der Sequenz aus.

Wählen Sie auf der Registerkarte Filterung die Option NoFiltering aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Ausgabe die entsprechende Ausgabe aus. Wählen Sie Vorherige Spots entfernen, die als Interessenbereiche gerendert wurden, und klicken Sie auf Keine Datei ausgewählt, um den Ordner zum Speichern der Datei auszuwählen.

Wählen Sie dann auf der Registerkarte Anzeige die entsprechenden Optionen aus und klicken Sie auf Erkennung starten. Innerhalb der bildgebenden Analysesoftware kann der Spot-Detektor verwendet werden, um die Stressgranula in jedem der angegebenen interessierenden Bereiche zu identifizieren. Anschließend kann ein binäres Bild erstellt werden, das alle identifizierten Spannungskörnchen anzeigt.

Die Analyse von Stressgranulaten muss sorgfältig auf jeden analysierten Markt für Stressgranulate zugeschnitten werden. Wenn Sie z. B. die Größenanforderung des erkannten Interessenbereichs oder die Empfindlichkeit der Erkennungsparameter ändern, führt dies zu unterschiedlichen Ergebnissen. Bei höheren Pixelgrößenskalen werden kleinere Stressgranula nicht gezählt und die Anzahl der Stressgranula nimmt ab.

Eine Erhöhung der Sensitivität führt zu einer Erhöhung der Anzahl der Stresskörnchen. In diesem Experiment ergab beispielsweise eine Zweierskala mit einer Sensitivität von 100 das beste Ergebnis aus dem Stressgranula-Marker G3BP1. Während eine Zweierskala mit einer Sensitivität von 55 das beste Ergebnis für den EIF3B-Stressgranulatmarker lieferte.

Aus der Größe des Spannungsgranulats kann dann die Oberfläche berechnet werden. Häufigkeitsverteilungsdiagramme sind nützlich, um Verschiebungen in der Größe von Stressgranula zwischen verschiedenen Zellpopulationen hervorzuheben. Darüber hinaus kann die Intensität der Fluoreszenz Aufschluss über die Qualität der analysierten Stressgranula geben.

Sobald die Herausforderung der gesamten Zelle gemeistert ist, kann sie in etwa sechs bis sieben Stunden durchgeführt werden, und die Analyse kann in weiteren zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Kontroll- und die Versuchsproben immer gleichzeitig und unter den gleichen Bedingungen zu verarbeiten, um die Variabilität innerhalb der Daten zu minimieren. Nach diesem Verfahren kann die Analyse auch auf ein dreidimensionales Volumen erweitert werden, um zusätzliche Einblicke in die Lokalisierung von Stressgranula zu erhalten.

Dieses halbautomatische Verfahren ermöglicht eine rigorose und unvoreingenommene Analyse von Stressgranula in nicht infizierten und infizierten Zellen. Es kann bisher unbekannte Subversionen des Stressgranula-Signalwegs aufdecken. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen mit Bakterien infiziert, wie man die Bildung von Stressgranula induziert und wie man einen halbautomatischen Ansatz zur qualitativen und quantitativen Analyse von Stressgranula verwendet.

Und vergessen Sie nicht, dass bei Shigella flexneri und Stressgranulat induzierende Mittel wie Clotrimazol gefährlich sein können und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, die Arbeit in einem BL2-Labor und die ordnungsgemäße Entsorgung aller Reagenzien erforderlich sind.