Name: Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Lernen Sie die Einzelmolekülanalyse von laserlokalisierten DNA-Interstrang-Crosslinks zur Untersuchung zellulärer Schadensantworten. Diese Methode ermöglicht die direkte Bildgebung von DNA-Läsionen in vivo.

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Diese Forschung wurde teilweise durch die Intramural Research Program des NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) und dem Fanconi Anemia Research Fund unterstützt.

1. Herstellung von Dig-TMP <ol><li> Mische 50 mg (0,18 mmol) 4&#39;-Chlormethyl-4,5&#39; , 8-Trimethylpsoralen und 590 mg (2,7 mmol) 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanedi-amin in einem trockenen 25 ml Rund -bottom Kolben unter Stickstoff. Zugabe von 10 ml Toluol und Rückfluss für 12 h. Entfernung des Lösungsmittels in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck. <ol><li> Reinige den Rückstand durch Flash-Säulenchromatographie über Kieselgel. Eluieren der Säule mit Chloroform, Methanol und 28% iger Ammoniaklösung (9: 1: 0,5). Dampfe das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck und erholen das reine 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen als ein hellgelbes viskoses Flüssigkeit. </li><li> Mischen 5,5 mg (0,012 mmol) 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen mit 5 mg (0,008 mmol) Digoxigenin-NHS-Ester in ein trockener Rundkolben unter Stickstoff gegeben. 0,5 mL wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) eind 3,4 &amp; mgr; L Trimethylamin zugegeben und bei 50 ° C für 18 Stunden. </li><li> Entfernung des Lösungsmittels in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck. </li><li> Löse den Rückstand in einer minimalen Menge Dichlormethan. Geben Sie die Lösung in 2 ul spots horizontal über den Boden einer präparativen Dünnschichtplatte mit Kieselgel als stationäre Phase. Führen des präparativen TLC in Chloroform: Methanol: 28% Ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1). </li><li> Maskiert die Platte mit Ausnahme der vertikalen Kanten und identifizieren, die Band des Produkts mit kurzwelligem UV-Lampe 254 nm. Schabt das Produkt von der Platte mit einem Spatel und isolieren, um das reine Produkt mit Chloroform: Methanol: 28% Ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1) -Mischung. </li><li> Entfernen Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck. Man löst die verbleibenden Pellets in 1 ml 50% EtOH: H 2 O, verzichtet werden in 50 ul - Aliquots in 1,5 - ml - Röhrchen (~ 20 Aliquots) und trocken in einem Zentrifugalverdampfer , bis das gesamte Lösungsmittel verdampft (~ 3 h). </li><li>Wieder aufzulösen jedes Aliquots in 200 ul 50% EtOH: H 2 O und wieder trocken in einem Zentrifugalverdampfer. Man löst jedes Aliquot wieder in 200 ul 50% EtOH: H 2 O, trocken in einem Zentrifugalverdampfer und speichert Pellets bei -20 ° C zur Langzeitlagerung. </li></ol></li><li> Zur Verwendung lösen sich die Pellets in 50 ul 50% EtOH: H 2 O ein 1 Bereiten: 100 - Verdünnung des gelösten Dig-TMP in H 2 O und OD bei 250 nm messen. Der Extinktionskoeffizient von Dig-TMP ist 25.000. Die Lösung ist für etwa einen Monat stabil , wenn bei -20 ° C gelagert. Überprüfen der Konzentration von OD bei 250 nm vor jeder Verwendung zu messen. <ol><li> Berechnen Stammkonzentration: Abs x 100 x 10 6 / 25.000 = Konzentration (in um). Typischerweise wird die Stammlösung etwa 3 mm. Es ist wichtig, in diesem Bereich zu sein, um das Volumen des EtOH zu dem Medium gegeben zu minimieren. </li></ol></li></ol> 2. Laser Lokalisierte Dig-TMP ICLs <ol><li> Perform Laser Lokalisierung mit einem konfokalen Mikroskop mit einem SRS Stickstofflaser (337 nm) gepumpt wird durch eine Farbstoffzelle eine Linie von 365 nm und Brennen 3 ns-Impulse bei 10 Hz, mit einer Leistung von 0,7 nW emittieren. </li><li> Macht eine vertikale Markierung auf der Seite eines 35 mm Glasboden-Zellkulturschale mit einem Markierungsstift. Zerkratzen ein Kreuzes in der Mitte des Glases auf der Kulturfläche mit einem Diamantstift, so daß die schwarzen Streifen auf der Seite der Schale ist an der Spitze eines Arms des Kreuzes. Das Kreuz wird auf der Wachstumsoberfläche des Glases markiert, so dass sie und die Zellen in der gleichen Brennebene sein werden. </li><li> Sterilisieren die Platte mit einer Spülung von 70% EtOH nach der Markierung. Trockene, bevor die Zellen Plattierung. </li><li> Plattenzellen (Standard-Laborstämme wie HeLa oder U2OS) im Kreuz markierten Kulturschalen einen oder zwei Tage vor. Zelle sollte aktiv werden zu teilen und 50-70% konfluent am Tag des Experiments. Inkubiere 24 h mit 1 &amp; mgr; M 5-Chlor-2-desoxyuridin (CldU) gleichmäßig Etikett DNA. </li><li> HinzufügenDig-TMP in 50% EtOH: H 2 O zu Zellkulturmedium bis zu einer Endkonzentration von 20 uM. Bringen des Mediums auf 37 ° C. Ändert das Medium über die Zellen und im Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 30 min dem Dig-TMP äquilibrieren zu ermöglichen. </li><li> Während die Zellen werden inkubiert, schaffen, die x / y-Koordinaten des Sichtfeldes, in dem der Laser aktiv ist. Folgen Sie den Kalibriervorgang des Herstellers, in dem der Laser durch die Software gerichtet ist eine verspiegelte Glasobjektträger entlang einer horizontalen und diagonalen Linie zu ätzen. Die beiden Linien definieren die Grenzen des Feldes, in dem der Laser ein Ziel treffen kann. </li><li> Die Platte wird in der Klimakammer bei 37 ° C mit einem kontrollierten CO 2 und Feuchtigkeit, auf dem Mikroskoptisch und Fokus mit dem 60X Öl Ziel auf dem Schnittpunkt des Kreuzes. </li><li> Direkte den 365 nm-Laserstrahl zu einem ROI, der durch den Untersucher mit dem Form-Werkzeug in der Software, um einen Streifen von 3 &amp; zu bilden# 181; mx 0,6 um. Der Umriss des ROI wird durch die Cursor in den Kernen von Zellen in der unmittelbaren Nähe der Kreuzung des Quer gelegen angeordnet. Stellen Sie die z Brennebene des Lasers auf halbem Wege durch den Zellkern zu zielen. Verwenden eines Lasers im Bereich von 350-370 nm. 405 nm - Laser kann nicht - Vernetzungen 19 induziert. HINWEIS: Wir finden die ROI in nukleoplasmatischen Bereiche außerhalb der Nukleoli, die aus Nukleoplasma in differentieller Interferenzkontrast (DIC) -Bildgebung unterschieden werden können. </li><li> Stellen Sie sicher , den Fokus und die Aktivität des Lasers durch die Leistungseinstellung auf ein Niveau zu erhöhen ausreicht , um eine Zelle zu tilgen (die Zelle wird verdunkeln und dann verschwinden). Dies ist ein wichtige diagnostische für einen ungehinderten Lichtpfad für den Laser durch das Mikroskop und dann durch das Deckglas und in die Zellen. <ol><li> Senken Sie die Leistungseinstellung auf gerade genug, um die Psoralen und die ICL induzierte DDR zu aktivieren (dies empirisch für jeden Laser / Mikrofon bestimmt werden muss,ROSCOPE Kombination). Verwenden Sie eine Laserintensität einstellen (1,7% hier), die nicht die DDR in Abwesenheit von Psoralen nicht aktiviert (überwacht durch die Bildung von γ-H2AX). ANMERKUNG: Dies ist eine wichtige Feststellung, und die Einstellungen können eine Einstellung erfordern, wenn die Laserquelle oder eine Komponente in dem Lichtpfad geändert wird. Folgen Sie die Anhäufung von GFP-Reparaturproteine ​​getaggt wie XPC oder FAN1, welche beide rasch rekrutiert werden (in Sekunden) an den Laser Psoralen Streifen, aber nicht allein den Laser ausgesetzt, um den ROI. Einige Proteine ​​der DDR erscheinen innerhalb von Sekunden, während mehrere Minuten können für andere erforderlich sein. Es ist notwendig, Zeitverlauf Bestimmungen für jedes Protein von Interesse durchzuführen. Wir bemerken auch, dass in Zellen, die nicht mit dem Laser ausgesetzt waren, gibt es keine Streifen reagieren Proteine. </li></ol></li><li> Nachdem alle Zellen in einem Feld haben die Platte Umzug in ein neues Feld gezielt worden, an der Kreuzung des Kreuzes Aufenthalt in der Nähe. </li><li> In Experimenten bestimine die Verteilung der inter Läsion Abstände Zellen an den Laser in 20-25 Feldern (4-5 Zellen / Feld) um den Schnittpunkt belichten. Um Replikationsmuster in der Nähe der lokalisierten ICLs inkubieren Zellen mit 10 &amp; mgr; M 5-iod-2-desoxyuridin (IDU) nach der Laserbrenn zu analysieren. HINWEIS: Die Zeit der Inkubation mit IdU ist etwas willkürlich. Wir haben so kurz wie 20 Minuten und solange 60 min (siehe unten) verwendet. Längere Impulse (einige Stunden) führen oft in mehreren Replikationsweg Koaleszieren und damit die Möglichkeit, das Bild zu verlieren, den Fortschritt der einzelnen Gabeln. In einigen Experimenten ces werden 24 h mit CldU markiert vor der Belichtung mit Dig-TMP gleichmäßig zu Markierungs-DNA, gefolgt von Pulsmarkierung Replikationsweg. </li></ol> 3. Ernte von Zellen und Dehnen von DNA-Fasern <ol><li> Entfernen der Platte von der Bühne, das Medium entfernen, und wasche mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS-Lösung. Legen Sie eine 10 &amp; mgr; l Tropfen eines handelsüblichen Trypsin/ EDTA-Lösung auf dem Schnittpunkt des Kreuzes in der Mitte der Glasoberfläche. </li><li> Inkubieren für 3-4 min bei Raumtemperatur (RT) und dann mit den abgelösten Zellen in die Pipettenspitze die Trypsinlösung zeichnen. Es besteht keine Notwendigkeit, das Trypsin zu neutralisieren. </li><li> Platzieren Sie den Tropfen Trypsin / EDTA mit den Zellen an einem Ende eines silanisierten Glasobjektträger. Lyse der Zellen und lassen Sie die DNA durch Zugabe von 10 ul 0,5% SDS-Lösung und für 3-4 min bei RT inkubieren vorsichtig mit der Pipettenspitze Mischen, so dass die Peripherie des Pools zu trocknen. </li><li> Kippen Sie die Schlitten 20 ° und die Flüssigkeit bis zum Ende laufen. Die DNA-Fasern werden ausgefahren / ausgestreckt durch die hydrodynamischen Kräfte der fließenden Flüssigkeit. Lassen Sie die Folien der Luft trocknen (~ 10 min) und fixieren in 3: 1 Methanol / Essigsäure 10 min. Entfernen Sie die Folien aus der Fixier-Lösung und Luft wieder trocken. An diesem Punkt kann sie auf unbestimmte Zeit in 70% EtOH bei -20 ° C gelagert werden. Bei der Entfernung aus dem EtOH 70% an der Luft trocknen, bevor die ne ermöglichenxt Schritt. </li><li> Wasche Objektträger in PBS und dann in 2,5 M HCl denaturiert für 1 h bei RT. Diese Behandlung depurinates DNA die inkorporierten halogenierten Nukleobasen für Antikörper zugänglich zu machen. </li><li> Neutralisieren Objektträger in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Wasche zweimal in PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) für jeweils 5 Minuten. </li><li> Block gleitet und mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) und 10% Ziegenserum in PBS. Deckt die Folien vorsichtig mit einem Parafilm die Blockierungslösung gleichmäßig über die Folie verteilt und für 1 h bei RT inkubiert. </li><li> Jeweils 100 &amp; mgr; l 1: 200-Verdünnung in Blockierlösung von Ratten-Anti-Bromdesoxyuridin (erkennt spezifisch CldU) primäre Antikörper zu jeder Folie. Deckt die Folien vorsichtig mit einem Parafilm die Verdünnung gleichmäßig über den Objektträger zu verteilen und für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Entfernen Sie den Parafilm und waschen Sie die Folien dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten. </li><li> Jeweils 100 &amp; mgr; l von verdünnten (1: 100), Ziege-anti-Ratte-Alexa Fluor 647 in jede Folie Blockierungslösung. Bedecke, Verdecke dasgleitet sanft mit einem Parafilm und für 45 min bei RT inkubiert. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten. </li><li> Jeweils 100 ul verdünnten (01.40) Maus-Anti-Bromdesoxyuridin (LDU erkennen und CldU Diese duale Spezifität die Blockierung von CldU durch den Ratten-anti BrdU im Stand der Inkubation erforderlich macht.) Primären Antikörper und Kaninchen-anti-DIG-Antikörper (1: 200 ) -Lösung zu jeder Folie in blockieren. Decken Sie die Folien vorsichtig mit einem Parafilm und Inkubation in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten. </li><li> Jeweils 100 &amp; mgr; l von verdünnten (1: 100) , Ziege - anti-Maus - Alexa Fluor 488 und c (1: 5000) , Ziegen - anti-Kaninchen - Sonde (zB Qdot 655) in jede Folie Blockierungslösung. Decken Sie die Folien vorsichtig mit Parafilm und Inkubation für 45 min bei RT. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten. </li><li> Überschüssiges PBST auf einem Papiertuch. Je 50 &amp; mgr; L Antifade Befestigungsmedium auf jeden Objektträger geben und mit einem Deckglas. Bild oder Speicher fürnicht mehr als 48 h bei -20 ° C. </li></ol> 4. Faser Imaging durch Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Durchführen der Bildaufnahme durch ein 63X Ziel auf einem inverses Mikroskop mit einem daran befestigten vollständig motorisierten Filterrad mit FITC, Cy5 und Q-Punkt 655 Erkennung. Der Anregungsfilter 425 nm, und das Emissionsfilter 655 nm mit 20 nm an der Emissionsspitze 20 zentriert. </li></ol>

<ol><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%3A+three+levels+of+DNA+repair+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2013).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li>
<li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate+effects%2C+endogenous+DNA+damage%2C+and+signaling+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li>
<li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li>
<li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts%3A+their+role+in+carcinogenesis%2C+epidemiology%2C+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li>
<li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs%3A+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li>
<li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li>
<li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li>
<li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li>
<li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255(2011).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84(2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li>
<li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+%286-4%29+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li>
<li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA%3A+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li>
<li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Laser-Lokalisierungstechnologie erfordert die Verwendung von adhärenten Zellen mit Kernen, die in Hellfeld-Mikroskopie sichtbar sind. Wir haben versucht, nicht-adhärente Zellen, wie primäre Lymphozyten zu befestigen, oder lose anhaftenden Kulturzellen wie AD293, auf die Glasoberfläche mit zelladhäsiven Zubereitungen wie Polylysin oder Collagen, oder komplexere Mischungen. Obwohl diese Behandlungen die Zellen an die Oberfläche binden kann, finden wir, dass sie in der Regel gerundet bleiben, was es sehr schwierig, in ...

DNA wird unter konstantem Angriff von exogenen Mitteln wie Strahlung, ultraviolettem Licht, Umweltgifte, Verbrennungsprodukte, etc. Darüber hinaus ist es auch durch endogene Radikalspezies hergestellt durch oxidative Stoffwechsel angegriffen wird. All diese Faktoren haben das Potenzial , chemisch oder physikalisch die Integrität der DNA - 1 zu stören. Störungen in dem Genom können die DNA-Schadensantwort (DDR) aktivieren, eine Rekrutierung und posttranslationale Modifikation Kaskade mit Hunderten, wenn nicht Tausende von Proteinen und in Läsion Reparatur beteiligt microRNAs, Regulation des Zellzyklus, Apoptose, Seneszenz und Entzündungsweg 2. Die meisten unserer Informationen über die DDR stammt aus Studien mit DSBs. Dies ist zum großen Teil durch die Verfügbarkeit von Technologien für Brüche sind , darunter ein sequenzspezifische Pausen, in genomischer DNA in lebenden Zellen 3. Darüber hinaus ist die propensity von Pausen Brennpunkte der DDR-Proteine ​​zu induzieren, die durch Immunofluoreszenz angezeigt werden können, ist sehr hilfreich für die Bestimmung der Kinetik und Anforderungen des Antworten Proteine. Eine der Schlüsseltechnologien für die DDR studiert wurde von Bonner und Kollegen vorgestellt, die einen Laserstrahl verwendet , 4 einen Streifen von DSBs in einer „Region of Interest“ (ROI) in den Kernen von lebenden Zellen zu lenken. In der Tat haben sie einen langen Fokus, in denen Proteine ​​der DDR können durch Immun identifiziert werden. Dies wurde durch die Demonstration der starken Streifen von phosphoryliertem Histon H2AX (γ-H2AX) in den Laser-exponierten Zellen veranschaulicht. Seitdem hat sich der Laser Ansatz in zahlreichen Studien der DDR eingesetzt wurden durch DSBs induziert. Obwohl mächtig und beliebt, und die Quelle der dramatischen Immun Bilder, sei darauf hingewiesen, dass in den meisten Experimenten die Laserintensität eingestellt wird, um beobachtbare Ergebnisse zu produzieren, ohne Sorge um die Läsion Identität,Dichte oder Abstand. Tatsächlich kann es schwierig sein, diese Schätzungen. So sind sie weitgehend ignoriert, trotz der Vielzahl der in die DNA eingeführt Läsionen durch Laser 5. Dies trägt zu den vielen Widersprüche in der Literatur 6. Im Gegensatz zu DSBs meisten chemischen Modifikationen der DNA nicht stimulieren die Bildung von diskreten Foci von DDR-Proteinen. Dies ist wichtig im Hinblick auf unserem gegenwärtigen Verständnis der Läsion Frequenzen. Es wird geschätzt, dass menschliche Zellen in Kultur nicht weniger als 50 DSBs pro Zellzyklus entstehen, 7 weitgehend während der S - Phase gebildet, 8, 9. Weniger in nicht-proliferierenden Zellen gebildet. Dies kontrastiert mit der Anzahl von Nukleobasen Verluste oder Änderungsereignisse, die 1 in die Zehntausende pro Zelle / Tag, 10. So wissen wir am meistendie DDR durch Ereignisse induziert, die relativ selten sind, und viel weniger über die von Helix zu verzerren Läsionen induziert, die weitaus häufiger in Aggregat sind. Um Fragen über die zelluläre Antwort zu adressieren Modifikationen der genomischen DNA kovalent, wollten wir mit einer Helix verzerrenden DNA-Addukt arbeiten, die inhärente DDR Induktionsaktivität hatte. Darüber hinaus erleichtern experimentelles Design und Interpretation, die wir waren in einer Struktur, deren Einführung interessiert Bezug auf die Zeit kontrolliert werden konnte und war offen für die Visualisierung. Dementsprechend entwickeln wir eine Strategie, die auf Psoralen. AT sites: Psoralene sind gut photoaktive DNA-Interkalatoren begünstigende 5&#39; TA gekennzeichnet. Im Gegensatz zu anderen Vernetzungsmitteln wie beispielsweise Stickstoffsenfgase und Mitomycin C (MMC) sie sind nicht reaktiv, es sei denn DNA ausgesetzt langwelligem UV (UV-A) Licht. Die interkalierten Moleküle reagieren mit Thymin-Basen auf gegenüberliegenden Strängen helix verzerrenden Interstrang-Vernetzungen (ICLs herzustellen) 11. Mit dem Psoralen trimethyl in unseren Experimenten verwendeten die meisten Produkte sind ICLs, relativ wenige Monoaddukte erzeugt werden (weniger als 10%) 12 und Intrastrang - Quervernetzungen zwischen benachbarten Basen auf einem Strang nicht ausgebildet sind . Weil sie leistungsfähiger Blöcke Replikation und Transkription, Psoralen und andere Vernetzungsmittel sind, wie cis-Platin und MMC, werden in der Chemotherapie eingesetzt. Somit Psoralen Studien ermöglichte, dass die Aktivierung der DDR durch eine Helixstruktur zu verzerren, gefolgt, und auch einen Einblick in die zelluläre Antwort auf eine Verbindung mit der klinischen Bedeutung zur Verfügung gestellt. Wir ein Reagenz synthetisiert, in dem trimethylpsoralen verknüpft wurde an Digoxigenin (Dig), ein pflanzliches Sterin nicht in Säugerzellen gefunden und häufig als immunotag verwendet. Die Anforderung für die Photoaktivierung erlaubt die Lokalisierung von Laserlicht (365 nm) von Psoralen ICLs in definierten ROI in Kernen in lebenden Zellen. Diese können durch imm angezeigt werdenunofluorescence gegen das Markierungs-Dig. DNA - Reparatur und DDR - Proteine erschienen in den Streifen des Laser lokalisierten ICLs 13, 14. Die DDR durch die hohen Laserintensitäten aktiviert verwendet DSBs produzieren könnte 15 aufgrund isoliert oder gruppierten Schaden sein, 16. Folglich ist die Relevanz der Ergebnisse aus diesen Experimenten natürlich Läsionen vorhanden bei viel niedrigeren Konzentration auftritt, ist ungewiss. Um ähnliche Fragen zu Psoralen Addukts Frequenz und Abstand in der DNA - Adresse, nutzten wir DNA - Fasertechnologie 17 und immunoquantum Punkte. Quantenpunkte sind deutlich heller als Fluoreszenzfarbstoffe und sind nicht durch Belichtung gebleicht. So werden sie häufig für Einzelmolekül - Bildgebung verwendet 18, eine Anwendung , für die Fluoreszenzfarbstoffe nicht ausreichend hell sein . Einzelne DNA-Fasern können auf g gestrecktlass Dias und können während der Inkubationen vor der Zellernte eingebracht durch Immunofluoreszenz gegen Nukleosidanaloga angezeigt werden. Wir behandelten Zellen mit Dig-Psoralen und den ROI zu Lasermikrobestrahlung ausgesetzt. Die Fasern wurden aus den Zellen und einzelne Dig-Psoralen-Addukte hergestellt mit den immunoquantum Punkte sichtbar gemacht werden konnten. die Zellen ausgesetzt Analoga für relativ kurze Zeiten Nukleosid (20-60 min) ermöglicht die Anzeige der Replikationsweg in der Nähe des Laser lokalisierte ICLs.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenin NHS-Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chlor-psoralen</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoglykol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>DC-Platten</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Flass Glassäule 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2 konfokales Spinning-Disk-Mikroskop, ausgestattet mit automatisierter Tisch- und Klimakontrollkammer und Plattenhalter</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>mit Volocity Software</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>mit einem Stickstoff-gepulsten Laser&nbsp;</td></tr><tr><td>Farbstoffzelle</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 Farbstoff</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glas Botomm Platten 1,5 Deckglas, 10 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Neu Comer Supply</td><td>Part # 5070</td><td>Neue Silane Objektträger</td></tr><tr><td>Maus Anti BrdU Antikörper (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 von 40</td></tr><tr><td>Ratte Anti BrdU Antikörper (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 zu 200& nbsp;</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti Dig</td><td>Antikörper ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 zu 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 Ziege anti Kaninchen</td><td>IgG ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 zu 5.000</td></tr><tr><td>AF647- Ziegen anti Ratte IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 zu 100</td></tr><tr><td>AF488-Ziegen anti maus IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 zu 100</td></tr><tr><td>Zeiss Epifluoreszenz Mikroskop A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp; mit Axiovision Software</td></tr><tr><td>Q-dot 655 Filter</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

einzelmolekülanalyse von laser lokalisierte psoralen addukten

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Die DNA-Schadensantwort (DDR) wurde in Studien von Doppelstrangbrüchen (DSB), induziert durch Lasermikrostrahlbestrahlung in lebenden Zellen extensiv charakterisiert. Die DDR helix DNA kovalente Modifikationen verzerrenden, einschließlich Interstrang- DNA-Vernetzungen (ICL), ist nicht so gut definiert. Wir haben die von ICLs stimuliert DDR studiert, lokalisiert durch Laser-Photoaktivierung von immunotagged Psoralene, in den Kernen von lebenden Zellen. Um grundlegende Fragen über Adduktverteilung und Replikationsgabel Begegnungen zu adressieren, kombinierten wir Laser-Lokalisierung mit zwei anderen Technologien. DNA-Fasern werden häufig während kurzer Impulse integriert anzuzeigen, den Fortschritt der Replikationsgabeln durch Immunofluoreszenz von Nukleosidanaloga verwendet. Immunoquantum Punkte wurden für Einzelmolekül-Bildgebung weit verbreitet. In dem neuen Ansatz, DNA Fasern aus Zellen, den Laser-lokalisierte ICLs werden auf Objektträger verteilt. Die markierten ICLs sind mit immunoquantum Punkten und th angezeigte inter-Läsion Entfernungen bestimmt. Replikationsgabel Kollisionen mit ICLs visualisiert und andere Begegnung Muster identifiziert und quantifiziert werden.

Laser lokalisierte Dig-TMP (1A) ICLs kann den Psoralen verknüpfte durch Immunofluoreszenz gegenüber der Dig-Markierung angezeigt werden. Obwohl der Laser gerichtet werden kann, auf einer Fläche von jeder Kontur zu schlagen, sind Streifen nicht „natürlich“ Formen in Zellen und berechtigtes Signale leicht von Artefakten aufgrund von nicht-spezifischen Bindung von primären oder sekundären Antikörpern unterschieden werden können. Diese Funktion ist hilfreich, wenn Antikörper...

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Einzelmolekül-Analyse der Verteilung laserlokalisierter DNA-Interstrangquervernetzungen in genomischer DNA durchzuführen, um zelluläre Reaktionen auf DNA-Interstrangquervernetzungen zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, insbesondere hinsichtlich der Verteilung von DNA-Schäden, die mittels Lasertechnologie – einem weit verbreiteten experimentellen Werkzeug – induziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die direkte Abbildung von durch die laseraktivierte Verbindung in genomischer DNA induzierten DNA-Schäden ermöglicht.Das war zuvor nicht möglich. Die Durchführung des Verfahrens wird Julia Gichimu und Hima Gali aus unserem Labor demonstrieren. Jedes Mal, wenn der Ziellaser verwendet wird, ist es wichtig, eine Kalibrierung mit der Spiegelprobe durchzuführen, um sicherzustellen, dass der Laser die korrekten XYZ-Koordinaten trifft, und um den Bereich des vom Kamerasystem erfassten Feldes zu bestimmen, in dem der Laser zum Auftreffen eingestellt werden kann.Suchen Sie ein Feld auf dem Objektträger, das zuvor geätzt wurde. Stellen Sie die Belichtungszeit und die Laserleistung ein. Passen Sie dann den Fokus an, um zu einem benachbarten, nicht gezielten Feld auf dem Spiegelobjektträger zu wechseln.Starten Sie den Kalibrierungsprozess. Die Software feuert den Laser ab, um entlang einer horizontalen und einer diagonalen Linie die Spiegelprobe zu gravieren. Diese Linien definieren die Grenzen des Feldes, in dem der Laser eine Zielzelle treffen kann.Legen Sie mehrere Regionen von Interesse, also ROIs, innerhalb des Feldes fest und feuern Sie den Laser ab, um zu bestätigen, dass er die ausgewählten Bereiche anvisiert und somit die entsprechenden XYZ-Koordinaten trifft. Bei der Einrichtung des Mikroskop-Ziellasersystems muss zudem eine biologische Kalibrierung durchgeführt werden. Der erste Schritt besteht darin, die minimale Laserleistung zu definieren, die erforderlich ist, um Trimethylpsoralen (TMP) zu photoaktivieren, Interstrang-Quervernetzungen zu induzieren und die Rekrutierung eines mit GFP markierten Reparaturfaktors auszulösen, dessen Kinetik zuvor charakterisiert werden kann.In diesem Experiment wird eine U2OS-Zelllinie verwendet, die stabil mit einem Plasmid transfiziert ist, das GFP-Fan1 exprimiert. Wie hier gezeigt, bestätigt die Betrachtung der Bildsequenz als Video die Rekrutierung von GFP-Fan1 in die definierte Ziel-ROI, wenn die Zellen zehn Minuten lang sechs µM TMP und 1,2 % Laserlicht ausgesetzt werden. Der zweite Schritt besteht darin, zu überprüfen, ob diese Leistungseinstellung keine Rekrutierung in Abwesenheit der Substanz auslöst.Wie hier gezeigt, erfolgt keine Rekrutierung von GFP-Fan1 in die angesteuerte ROI, wenn Zellen 10 Minuten lang allein einem 1,2 %igen Laser ausgesetzt werden und das Bild als Video betrachtet wird. Drittens ist es wichtig, die minimale Leistungseinstellung festzulegen, die in der Lage ist, eine Zelle zu zerstören. Die Fähigkeit, eine Zelle bei dieser Leistungseinstellung zu zerstören, sollte als routinemäßige biologische Kalibrierung an jedem Tag getestet werden, an dem der Targeting-Laser verwendet wird.Legen Sie die ROI innerhalb des Zellkerns fest, wobei die Nukleoli ausgeschlossen werden sollen. Passen Sie den Fokus an. Stellen Sie die Laserleistung auf 12 % ein und feuern Sie.Schließlich ist es entscheidend, die Fokusebene in der Zellmitte einzustellen, um eine korrekte Zielgenauigkeit zu erreichen. Zur Demonstration werden drei Zellen in drei verschiedenen Fokusebenen anvisiert. Zellmitte.Zu hoch und zu niedrig. Drei Minuten nach der Zielsteuerung wird ein Stapel von Bildern, der sich über drei Mikrometer erstreckt, generiert, um die Verteilung des GFP-Lüfters entlang eines Streifens in der abgebildeten Fokusebene zu untersuchen.Nur die in der Mitte der Zelle gezielte Zelle zeigt einen GFP-Fächer mit einem Streifen in allen Z-Ebenen. Bereiten Sie vor der Durchführung der Laserlokalisation eine 35-Millimeter-Zellkulturschale mit Glasboden zur Zellkultivierung vor. Machen Sie mit einem Markierstift eine vertikale Markierung an der Seite jeder Schale.Verwenden Sie einen Diamantschreiber, um ein Kreuz in der Mitte des Glases auf der Kulturoberfläche einzuritzen, sodass der schwarze Streifen an der Seite der Schale am oberen Ende eines Arms des Kreuzes liegt. Das Kreuz wird auf der Wachstumsfläche des Glases markiert, damit es und die Zellen in derselben Fokusebene liegen. Säen Sie Zellen in sterilisierten, mit Kreuz markierten Kulturschalen aus und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang in einem Mikromolar Fünf-Chlor-Desoxyuridin, um die DNA einheitlich zu markieren.Am Tag des Experiments Digoxigenin-gebundenes TMP oder dig TMP in 50 % Ethanol der Zellkultur in einer Endkonzentration von 20 Mikromolar zugeben. Das Medium auf 37 Grad Celsius erwärmen. Das Medium in den Kulturschalen durch das dig TMP-haltige Medium ersetzen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren, um eine Gleichgewichtseinstellung von dig TMP zu ermöglichen.Während die Zellen inkubieren, führen Sie die Spiegelrutschen-Kalibrierung und 12 %iges Herausblasen einer Zelle wie zuvor gezeigt durch. Stellen Sie die Platte in die Umweltkammer bei 37 Grad Celsius mit kontrolliertem CO2 und Luftfeuchtigkeit auf dem Mikroskoptisch. Fokussieren Sie mit dem 60X-Öl-Objektiv auf den Schnittpunkt des Fadenkreuzes.Wählen Sie das erste Zielgebiet aus, und verwenden Sie das Formwerkzeug, um die ROIs in einzelnen Zellen festzulegen, die sich unmittelbar in der Nähe des Schnittpunkts des Fadenkreuzes befinden. Wählen Sie nucleoplasmatische Bereiche außerhalb der Nukleoli aus. Passen Sie die Z-Fokusebene an, um den Laser in der Mitte der Zellkerne zu positionieren.Stellen Sie als Nächstes die Leistung auf das Minimum ein, das erforderlich ist, um Psoralen in der Antwort auf DNA-Schäden durch Interstrang-Quervernetzung zu aktivieren. Hier werden 1,2 % verwendet. Zünden Sie den Laser.Nachdem alle Zellen in einem Feld gezielt wurden, bewegen Sie die Platte in ein neues Feld, wobei Sie nahe an der Kreuzungsstelle des Fadenkreuzes bleiben. Wiederholen Sie das eben gezeigte Verfahren in 12 bis 18 Feldern, um insgesamt 80 bis 100 Zellen zu bearbeiten. Um die Zellen zu gewinnen, nehmen Sie die Kulturschale vom Mikroskoptisch.Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit PBS-Lösung. Entfernen Sie das PBS und geben Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen einer kommerziellen Trypsin-EDTA-Lösung auf den Schnittpunkt des Kreuzes in der Mitte der Glasoberfläche. Inkubieren Sie drei bis vier Minuten bei Raumtemperatur und ziehen Sie dann die Trypsinlösung mit den abgelösten Zellen in eine Pipettenspitze. Platzieren Sie den Tropfen Trypsin-EDTA mit den Zellen an einem Ende eines silanisierten Objektträgers aus Glas. Um die Zellen zu lysieren und die DNA freizusetzen, geben Sie 10 Mikroliter einer 5 %igen SDS-Lösung hinzu und inkubieren drei bis vier Minuten bei Raumtemperatur, dabei vorsichtig mit der Pipettenspitze mischen und den Rand des Tropfens leicht austrocknen lassen. Kippen Sie den Objektträger um 20 Grad und lassen Sie die Flüssigkeit zum Ende hin ablaufen.Die hydrodynamischen Kräfte der strömenden Flüssigkeit dehnen und strecken die DNA-Fasern. Lassen Sie den Objektträger 10 Minuten lufttrocknen. Tauchen Sie den Objektträger in eine Lösung aus drei Teilen Methanol zu einem Teil Essigsäure und fixieren Sie 10 Minuten lang.Entfernen Sie dann den Objektträger aus der Fixierlösung und lassen Sie ihn erneut an der Luft trocknen. Zu diesem Zeitpunkt kann der Objektträger unbegrenzt in 70 % Ethanol bei 20 Grad Celsius aufbewahrt werden. Um den Objektträger zur Detektion von Dig-Signalen an DNA-Fasern mittels Fluoreszenzmikroskopie weiterzuverarbeiten, nehmen Sie den Objektträger mit den gestreckten DNA-Fasern aus der 70 % Ethanol-Lösung und lassen Sie ihn an der Luft trocknen.Denaturieren Sie anschließend die DNA-Fasern in Salzsäure und überführen Sie sie dann in einen Behälter mit Tris-Hydrochlorid bei pH 8 zur Neutralisation. Waschen Sie die Proben danach in PBS. Und schließlich färben Sie sie mit den geeigneten Antikörpern gemäß einem zuvor veröffentlichten Verfahren. Die Struktur von Trimethylpsoralen mit einem Digoxigenin-Tag ist dargestellt. Interstrang-DNA-Quervernetzungen, oder ICLs, können mittels Immunfluoreszenz gegen dig-TMP sichtbar gemacht werden. Dieses Beispiel zeigt Zellen mit einer Anreicherung eines bekannten Markers der DNA-Schadensantwort, γH2AX, das in Grün dargestellt ist, in ROIs, die mittels Laser lokalisierte, in Rot sichtbare ICLs enthalten.Der mit DAPI angefärbte Zellkern ist blau dargestellt. Das Helligkeitsfeld zeigt eine Zelle, die teilweise auf der mit dem Diamantschreiber markierten Stelle liegt. Beachten Sie, dass die ROIs außerhalb der Nukleoli platziert sind.Um die Häufigkeit und den Abstand der Addukte zu bestimmen, wurden die Zellen 24 Stunden vor der Einführung der ICLs mit fünf Chloro-Desoxyuridin inkubiert. Nach der Gewinnung der Zellen und dem Ausbreiten der DNA-Fasern wurden die DIG-Signale mit einem Amino-Quantenpunkt detektiert, der im fünf Chloro-Desoxyuridin in Rot sichtbar gemacht wurde, und mittels Amino-Fluoreszenz, die in Grün sichtbar ist. Die Analyse der DIG-Signale auf den Fasern ergab, dass die Abstände zwischen den ICLs von weniger als 10 KB bis über 160 KB reichen. Es wurde kein Hinweis auf gehäufte Addukte gefunden.Wenn diese Richtlinien befolgt werden, sollte es möglich sein, diesen Ansatz auf andere DNA-Addukte auszudehnen, beispielsweise oxidative Läsionen, die mittels Laser geeigneter Wellenlänge lokalisiert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video demonstriert die lokalisierte Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie, um Proteinsekrete von einer einzelnen Zelle zu detektieren. Unter Verwendung eines mikrofluidischen Aufbaus und eines peptidgebundenen plasmonischen Nanostruktur-Chips zeigen Änderungen der reflektierten Lichtintensität am Resonanzwinkel Wechselwirkungen mit sezernierten Proteinen aus einer einzelnen Zelle.

Lokalisierte Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie zum Nachweis von Proteinsekreten aus einer einzelnen Zelle

Wir berichten von einem Verfahren der in situ Veränderung der HF behandelt Si (001) -Oberfläche in einer hydrophilen oder hydrophoben Zustand durch Bestrahlen Proben in Mikrofluidkammern mit H 2 O 2 / H 2 O-Lösung (0,01% -0,5%) oder Methanol-Lösungen gefüllt mittels gepulster UV-Laser mit einer relativen niedrigen Impulsfluenz.

Selektive Bereichsänderung des Siliziumoberfläche Benetzbarkeit durch gepulste UV-Laser-Bestrahlung in flüssigen Umgebung

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Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

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