Kleine RNA Transfektion in primären humanen Th17-Zellen durch Next Generation Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die effiziente Transfektion primärer humaner T-Zellen mit kleinen RNA-Reagenzien unter Verwendung der Elektroporation der nächsten Generation. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der T-Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise wie spezifische Genprodukte die Differenzierung und Immunfunktion von T-Zellen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine äußerst effiziente und zuverlässige Methode zur Transfektion primärer humaner T-Zellen mit sRNAs und anderen synthetischen kleinen RNA-Reagenzien darstellt.

Diese Methode kann Einblicke in die Biologie menschlicher Th17-Zellen liefern, ist jedoch auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise auf andere Lymphozyten von Mensch oder Maus. Am Tag null beschichten Sie sechswellige Zellkulturplatten mit 1,5 Milliliter pro Vertiefung Antihuman-CD3 und Antihuman-CD28 in PBS mit Calcium und Magnesium für mindestens zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Nachdem die mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut (CBMCs) isoliert und gewaschen wurden, führen Sie die Isolierung von CD4-positiven T-Zellen durch negative Selektion unter Verwendung eines kommerziellen menschlichen CD4-positiven T-Zell-Kits durch.

Fügen Sie Isolationspuffer hinzu und resuspendieren Sie die mononukleären Zellen. Überführen Sie die Zellen in ein neues 5-mL-Röhrchen, geben Sie dann je 100 µL fetalen Kälberserum (FBS) und 100 µL der Antikörpermischung pro Röhrchen hinzu und inkubieren Sie jedes Röhrchen 20 Minuten bei 4 °C auf einem Rotationswellen-Shaker, um gut zu mischen. Nach der Inkubation fügen Sie drei bis vier Milliliter Isolationspuffer hinzu, um die Zellen zu waschen.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für acht Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Überführen Sie die magnetischen Perlen in ein neues Gefäß und geben Sie ein gleiches Volumen Isolierungspuffer hinzu, um die Perlen zu waschen.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Mikropipette, um die Perlen gründlich zu mischen, und stellen Sie das Röhrchen anschließend mindestens eine Minute lang auf den Magneten. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die magnetischen Perlen in dem gleichen Volumen, das ursprünglich vor der Waschung überführt wurde. Geben Sie 500 Mikroliter des Isolationspuffers zu jedem Röhrchen hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, anschließend fügen Sie 500 Mikroliter vorgewaschener magnetischer Perlen hinzu.

Die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotationswellen-Shaker mit den magnetischen Perlen inkubieren, um sie gut zu mischen. Nach der Inkubation die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette mindestens 10 Mal gründlich auf- und abpipettieren, dann drei bis vier Milliliter Isolationspuffer hinzufügen und jedes Reagenzglas zwei Minuten lang in den Magneten stellen. Die negativ selektierten CD4-positiven T-Zellen im Überstand vorsichtig in ein neues Reagenzglas überführen.

Nach Abschluss der Isolierung von CD4-positiven T-Zellen die Zellen auf Eis stellen und mit einem Hämozytometer zählen. Die mit Antikörper beschichteten Platten zwei Mal mit PBS waschen und anschließend 1,5 Milliliter der zweifachen Mischung aus Th17-polarisierendem Medium in jede Vertiefung geben. Danach die humanen CD4-positiven T-Zellen zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.

Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn, resuspendieren Sie die Zellen anschließend in serumfreiem Basalmedium und geben Sie die Zellen so aus, dass das Endvolumen drei Milliliter pro Vertiefung beträgt und die polarisierenden Zytokine nun eine Endkonzentration von 1× aufweisen. Danach stellen Sie die Platten für zwei Tage in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C. Am zweiten Tag beschichten Sie 48-Loch-Gewebekulturplatten mit jeweils 250 Mikroliter pro Vertiefung Antihuman-CD3- und Antihuman-CD28-Antikörper in PBS mit Kalzium und Magnesium für mindestens zwei Stunden bei 37 °C. Um kleine RNAs für die Transfektion vorzubereiten, pipettieren Sie je eine Mikroliter einer fünf Mikromolar-Stammlösung der siRNA in eine 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe für jede Transfektion.

Halten Sie alle Röhrchen auf Eis. Waschen Sie anschließend die mit Antikörper beschichteten Platten zwei Mal mit PBS und geben Sie dann 500 Mikroliter eines 1×-Th17-Polarisierungsmediums in jedes Well. Nachdem die Kulturplatten und die Transfektionsreagenzien vorbereitet wurden, resuspendieren Sie die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette, indem Sie vorsichtig pipettieren, aber sicherstellen, dass alle Zellen vom Boden der Wells gelöst sind.

Vereinigen Sie die Zellen in einem kegelförmigen Reagenzglas und zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 500 × g und vier Grad Celsius. Saugen Sie vorsichtig den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen anschließend zur Wäsche in mindestens einem Milliliter PBS. Zählen Sie die lebenden Th17-Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode zur Bestimmung der Vitalität und pelletieren Sie die Zellen danach in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit dem im Kit enthaltenen Resuspendierpuffer. Bewahren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf. Geben Sie in jedes Mikrozentrifugenröhrchen neun Mikroliter Zellen zu einem Mikroliter kleiner RNA hinzu.

Pipettieren Sie einmal, um die Zellen und kleinen RNAs für die Transfektion zu mischen, und geben Sie anschließend die Zellen in die bereitgestellte Pipettenelektrodenspitze. Um eine optimale Transfektion sicherzustellen, vermeiden Sie es, vor der Transfektion Luftblasen in die Pipettenelektrodenspitze einzubringen. Wir geben 9,5 µL Zellsuspension hinzu, um sicherzustellen, dass genügend Mischung vorhanden ist, um die Bildung von Blasen in der Elektroporationspipette zu verhindern.

Füllen Sie die bereitgestellte Küvette mit drei Milliliter elektrolytischem Puffer bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Küvette in die Neon-Pipettierstation und setzen Sie die Pipette dann in die Küvette ein. Elektroporieren Sie unverzüglich jedes 10-Mikroliter-Gemisch aus Zellen und kleiner RNA.

Nach Abschluss der Elektroporation die Zellmischung direkt 500 Mikroliter eines 1×-Th17-Polarisierungsmediums in vorbereitete Vertiefungen einer Kulturplatte hinzufügen. Anschließend die Platten für zwei weitere Tage in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C stellen. Sorgfältig, aber zügig arbeiten, um Zelltod zu vermeiden.

Wenn viele Proben elektroporiert werden sollen, können die Zellen gesammelt und in Chargen transfiziert werden. Dieses Konturdiagramm zeigt, dass T-Zellen, die unter Th17-polarisierenden Bedingungen kultiviert wurden, den Chemokinrezeptor CCR6 und den Transkriptionsfaktor ROR gamma T exprimierten, die nicht exprimiert wurden, wenn T-Zellen unter nicht-polarisierenden Bedingungen kultiviert wurden. T-Zellen, die unter Th17-polarisierenden Bedingungen kultiviert wurden, produzierten außerdem IL-17A nach erneuter Stimulierung, jedoch nicht unter ThN-Bedingungen.

Die Differenzierung in Th17-Zellen erfolgt auch nach Transfektion mit kleinen RNAs, jedoch wird in einigen Experimenten eine verminderte Häufigkeit der IL-17A-Produktion beobachtet. Dies verdeutlicht die Bedeutung eines chemisch abgestimmten Kontroll-Controls mit kleinen RNAs für den Vergleich innerhalb jedes Experiments. Die Vitalität bleibt nach der Transfektion mit kleinen RNAs erhalten und liegt typischerweise über 70 %. Die Transfektion menschlicher Th17-Zellen am zweiten Tag mit einem siRNA-Pool, der das Gen PTPRC, das CD45 kodiert, gezielt anspricht, führte im Vergleich zu einer chemisch abgestimmten Kontroll-siRNA zu einer starken Verringerung der Expression von CD45.

Die hier gezeigte unimodale Verschiebung der CD45-Expression weist auf eine Transfektionseffizienz nahe 100 % hin. Die Verringerung der ROR-gamma-T-Expression durch RNAi hatte eine funktionelle Wirkung, da diese Zellen im Vergleich zu Zellen, die mit einer Kontroll-siRNA transfiziert wurden, eine verminderte IL-17A-Produktion aufwiesen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man in vitro polarisierte humane Th17-Zellen mit kleinen RNAs mittels Elektroporation der nächsten Generation transfectiert.