Name: Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Expression und Reinigung von S100A12 für antimikrobielle Forschung gegen Helicobacter pylori. Diese optimierte Methode liefert hohe Ausbeuten stabiler Dimere zur Untersuchung von Metallbindung und antimikrobieller Aktivität.

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Diese Forschung wurde von der Abteilung für Veteranen Angelegenheiten Karriere Entwicklung Award 1IK2BX001701, CTSA Award UL1TR000445 aus dem National Center for Advancing Translational Sciences, die National Science Foundation Award Nummern 1547757 und 1400969 und NIH Grant GM05551 unterstützt. Ihr Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt offizielle Ansichten des Nationalen Zentrums für die Förderung der Translationswissenschaften oder der National Institutes of Health dar.

1. Ausdruck von S100A12 <ol><li> Transformieren Sie kompetente BL21 DE3-Zellen mit einem pGEMEX-S100a12-Plasmid unter Verwendung eines Standard-Hitzeschock-Protokolls 18 . Füge 1 bis 5 μl Plasmid zu 50 μl Bakterien in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis hinzu. Inkubieren für 20 min. </li><li> Schütteln Sie die Zellen bei 42 ° C für 30 s. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 2 min. </li><li> Füge 500 μl SOC-Medium zu den Zellen hinzu. Inkubieren bei 37 ° C unter Schütteln bei 250 U / min auf einem Orbitalschüttler für 1 h. </li><li> Plättchen 150 μl der Transformationsreaktion auf LB-Agar-Medium (ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin). Inkubieren für 12-16 h bei 37 ° C. </li><li> Wähle eine Kolonie. Inokulieren Sie 2 ml LB (ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin). </li><li> Inkubieren für 4-6 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler (300 U / min). Die OD 600 sollte zwischen 1-3 Absorptionseinheiten lesen. </li><li> Füge 500 μl Starterkultur zu 50 ml ZYM-5052 Autoindu hinzuCtion media 26, ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin. Für eine optimale Belüftung und maximale Expression verwenden Sie einen 250 mL verwirrten Erlenmeyerkolben. Schütteln Sie (300 U / min) für 24 h bei 37 ° C. </li><li> Bakteriensuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation (4.000 xg, 10 min) bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Sie das Medium, protokollieren Sie Probe und speichern Sie Zellpaste bei -80 ° C. Die Probe ist seit Jahren stabil. </li></ol> 2. Reinigung von S100A12 unter Verwendung von Niederdruckchromatographie <ol><li> Resuspendieren von Zellen in 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Sonate die Suspension auf Eis, um Zellen zu lysieren. Verwenden Sie ~ 20 W Ausgang, 5 s und 5 s aus Zyklus für 5 min. </li><li> Übertragen Sie die Lösung auf Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen. Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugation, 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand dekantieren und auf einen sauberen 100 ml Polypropylen-Becher überführen. Kühlen Sie die Lösung ab, indem Sie den Becher auf Eis legen. Rührei hinzufügenR und fügen langsam 11,20 g Ammoniumsulfat hinzu. Lassen Sie die Lösung auf Eis für weitere 1 h rühren. Dies wird eine 60% ige Lösung von Ammoniumsulfat schaffen und die meisten der E. coli endogenen Proteine ​​präzipitieren. S100A12 bleibt löslich. </li><li> Die Lösung bei 4 ° C, 20.000 xg für 20 min zentrifugieren, um das ausgefällte Protein zu pelletieren. </li><li> Den Überstand dekantieren und auf Dialyseschlauch übertragen (MWCO 3.500 kDa). Dialyse gegen 1 l 20 mM Tris, pH 8,0 bei 4 ° C. Ändern Sie den Dialysepuffer zweimal. Erlaube 4 Stunden zwischen den Änderungen. </li><li> Anionenaustauschchromatographie <ol><li> Führen Sie die Chromatographie auf einem Niederdrucksystem durch. Die typische Durchflussmenge beträgt 1 mL / min. </li><li> Äquilibrieren einer 5 ml Sepharose-Säule mit 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Laden Sie die ~ 40 ml S100A12-Lösung mit der Probenpumpe (sammeln Sie den Durchfluss). </li><li> Die Säule mit 10 ml 20 mM Tris, pH 8, waschen. </li><li> Entwickeln Sie die Säule mit einem 0-30% Gradienten (BuFfer B ist 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) über 19 Säulenvolumina (CV, 95 ml). Sammle 5 ml Fraktionen. </li><li> Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot jeder Fraktion und analysieren Sie mit MES SDS PAGE mit Coomassie Färbung. Gel mit konstanter Spannung (20 V / cm) für 30 min laufen lassen. </li><li> Poolfraktionen mit S100A12. S100A12 läuft bei ~ 10 kDa Protein auf einem denaturierenden Gel. </li><li> Konzentrieren Sie die Fraktionen auf 5 ml unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (MWCO 10 kDa). Zentrifuge bei 3.000 xg für ~ 8 min. Nehmen Sie den Spitzenbruch. </li></ol></li><li> Größenausschlusschromatographie <ol><li> Äquilibrieren Sie die S75-Säule mit 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl. </li><li> Injizieren Sie &lt;5 ml konzentrierte S100A12-Fraktionen (aus der Ionenaustauschchromatographie). </li><li> Die Säule mit einer Durchflussmenge von 1 mL / m über 120 mL entwickeln. Sammle 5 ml Fraktionen. </li><li> Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot jeder Fraktion und analysieren Sie mit SDS PAGE mit Coomassie Färbung. Validieren Sie die Proteinidentität mitWestern-Blot oder Massenspektrometrie (berechnete Molekülmasse der monomeren Untereinheit 10.575.0 Da, gemessen 10575.4 Da). </li></ol></li><li> Poolfraktionen <ol><li> Messen Sie die Extinktion des Proteins A 280 mit einem Spektrophotometer. Verwenden Sie den SEC-Puffer als Leerzeichen. Der berechnete Extinktionskoeffizient für S100A12-Homodimer beträgt 5960 M -1 cm -1 . HINWEIS: Typische Ausbeuten sind 35-45 mg S100A12 pro 50 ml Kultur. </li><li> Aliquot S100A12 in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (1 mg / Röhrchen) einfrieren, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol></li></ol> 3. Antimikrobielle Aktivität Assays <ol><li> Streifen H. pylori- Stamm G27 auf tryptische Soja-Agarplatten, ergänzt mit 5% Schafblut (Blut-Agar-Platten). Wachsen 2-3 Tage bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Hacken Sie H. pylori in Brucella Brühe, ergänzt mit 1x Cholesterin. Kultur überNachtschütteln (250 U / min) bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Verdünnen Sie H. pylori 1:10 in 50% Brucella-Bouillon, 50% Calprotectin-Puffer plus 1x Cholesterin und Kultur im Medium allein oder ergänzt mit 100 μM Zinkchlorid plus 0, 100 oder 1000 μg / ml gereinigtem S100A12. Kultur über Nacht schütteln (250 U / min) bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Am nächsten Tag führen Sie serielle Verdünnungen und Platten auf Blut-Agar-Platten. Bakterienkolonien für 2-3 Tage bei 37 ° C in Raumluft wachsen lassen, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. Aufzählen der koloniebildenden Einheiten zur Berechnung des Bakterienwachstums in Gegenwart oder Abwesenheit von S100A12 und / oder exogenem Zink. </li></ol>

<ol><li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+and+S100A9%3A+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity%2C+traditional+risk+factors%2C+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+%28DAMP%29+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828(2015).</li>
<li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li>
<li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines%3A+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li>
<li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins%3A+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li>
<li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li>
<li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n2/full/nrc3893.html">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li>
<li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B%2FZn2%2B+signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li>
<li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-associated+S100+proteins%3A+new+mechanisms+that+regulate+function%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
<li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Immunity%3A+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li>
<li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705(2016).</li>
<li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+structural+states+of+S100A12%3A+A+key+to+its+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li>
<li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+genotypes%2C+host+factors%2C+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li>
<li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li>
<li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastric+precancerous+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dig+Dis%22%5BJournal%5D)">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer%3A+epidemiology+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li>
<li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450(2014).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense%2C+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li>
<li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li>
<li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+calgranulin+proteins+S100A8%2C+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li>
<li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es wird ein effizientes Protokoll für die Expression und Reinigung von humanem S100A12 vorgestellt. Das E. coli- Expressionssystem ist das häufigste Mittel, das für die Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet wird, insbesondere wenn mg-Mengen für biochemische und biophysikalische Studien erforderlich sind. Eine Schlüsselverbesserung des hier beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung von Autoinduktionsmedien 26 , die die Ausbeute an gereinigtem Protein um einen Faktor von fast...

S100-Proteine ​​sind eine Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen mit einer Vielzahl von Funktionen 1 . Sie werden in einer gewebe- und zellspezifischen Weise exprimiert und regeln ein breites Spektrum an zellulären Funktionen 2 , 3 . Einzigartige Calcium-bindende Proteine, S100-Proteine ​​zeigen sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Funktionen 4 , 5 . Innerhalb der Zelle induziert die Ca 2+ -Bindung eine Konformationsänderung, die eine hydrophobe Oberfläche aussetzt, die spezifisch auf Proteinbindungspartner 6 abzielt. Dieser intrazelluläre Mechanismus reguliert wichtige Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung und Energiestoffwechsel. Im extrazellulären Milieu zeigen S100-Proteine ​​zwei Funktionen 7 . In einem, sie fungieren als Schmerz assoziierte molekulare Muster (DAMP) Proteine ​​und initiieren einen Pro-inflammAtory Immunantwort durch Interaktion mit Mustererkennungsrezeptoren 8 , 9 . Zusätzlich sind mehrere Mitglieder der S100-Protein-Klassen-Sequester-Übergangsmetalle, eine Funktion, die dazu dient, mikrobielle Pathogene in einem Prozess zu verhungern, der als Ernährungsstörung 10 , 11 bezeichnet wird . S100A12 (auch bekannt als Calgranulin C und EN-RAGE) wird in Makrophagen und Neutrophilen stark exprimiert und als potentieller Biomarker für entzündliche Erkrankungen identifiziert 12 , 13 . Zusätzlich zu dem Binden von Calcium an seinen EF-Hand-Stellen hat S100A12 zwei hochaffine Übergangsmetall-Bindungsstellen, die sich an gegenüberliegenden Enden der Dimer-Grenzfläche 14 , 15 befinden . Jede Bindungsstelle besteht aus drei Histidinresten und einem Asparaginsäurerest und kann Zink oder Kupfer chelatierenSup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . In letzter Zeit haben wir berichtet, dass S100A12-abhängiger Zink-Hunger bei der Regulierung des Helicobacter pylori -Wachstums und der Aktivität der entzündlichen Virulenzfaktoren wichtig ist. H. pylori infiziert den Magen von etwa der Hälfte der menschlichen Bevölkerung der Welt; Es ist wohl einer der erfolgreichsten bakteriellen Pathogene 19 . Infektion mit H. pylori kann zu signifikanten Magen-Krankheit Ergebnisse einschließlich Gastritis, Magen-und Zwölffingerdarm-Geschwür, Schleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom und invasiven Magen-Adenokarzinom (Magenkrebs) führen. Magenkrebs ist die führende Ursache für Nicht-Cardia-Krebs-assoziierten Tod in der Welt, und der einzige größte assoziierte Risikofaktor für Magenkrebs ist Infektion mit H. pylori . H. pylori bleibt in der Magen-Nische trotz einer robuEine Immunantwort auf den Erreger und unterstreicht die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses von Immunmechanismen zur Bekämpfung dieser bakteriellen Infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- assoziierte Entzündungen zeichnen sich durch eine tiefe Infiltration von polymorphonuklearen Zellen oder Neutrophilen aus, die ein Repertoire antimikrobieller Proteine, einschließlich S100A12, an der Stelle der Infektion 18 , 24 , 25 ablagern. In dem Bemühen, den komplexen Dialog zwischen Host und Pathogen zu verstehen, suchten wir die Technik zu verfeinern, um S100A12 zu reinigen und es zu verwenden, um die antimikrobielle Wirkung zu untersuchen, die sie auf diesen medizinisch relevanten Erreger ausübt. Das Protokoll unten beschreibt eine verbesserte Technik für die S100A12-Reinigung in ihrem biologisch aktiven Zustand; Fähig, Nährstoffmetalle mit hohem Affini zu bindenTy und chelatisieren sie weg von eindringenden Mikroorganismen. Darüber hinaus unterstreichen die nachstehenden Methoden die Nützlichkeit dieses Proteins als kritisches Reagenz, um den Mechanismus zu untersuchen, durch den angeborene antimikrobielle Moleküle das Wachstum von bakteriellen Pathogenen einschränken. S100A-Familie Proteine ​​haben Anerkennung als eine wichtige Gruppe von angeborenen Immunsystem Moleküle gewonnen, die an der Immunsignalisierung sowie Host Verteidigung teilnehmen 27 . Das am meisten untersuchte ist Calprotectin (MRP-8/14, Calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin ist ein Neutrophil-assoziiertes Protein, das ein Heterodimer der S100A8- und S100A9-Untereinheiten bildet, die Übergangsmetalle an der Dimer-Grenzfläche 31 bindet. Es wurde gezeigt, dass Calprotektin zwei Metallbindungsstellen besitzt: Standort 1 kann Zn 2+ , Mn 2+ oder Fe 2+ binden und Standort 2 können<html> Binden Zn 2+ 31 , 32 . Zahlreiche Berichte haben gezeigt, dass Calprotektin antimikrobielle Aktivitäten gegen verschiedene Pathogene wie Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli und H. pylori aufweist und dass die hemmenden Wirkungen auf die Metallchelataktivität von Calprotectin 25 , 28 zurückzuführen sind , 29 . Bisherige Arbeiten zeigten, dass Calprotektin zahlreiche Aktivitäten auf H. pylori ausübt, einschließlich der Veränderung der Lipid-A-Struktur in der äußeren Membran und unterdrückt das Cag-Typ IV-Sekretionssystem (das ein wichtiger proinflammatorischer Virulenzfaktor innerhalb von H. pylori ist ), wodurch die Biofilmbildung und die Unterdrückung induziert wird H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen WeiseClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Darüber hinaus zeigten genetische und biochemische Assays die antibakterielle Aktivität von Calprotectin gegen H. pylori wurde weitgehend aus seiner Fähigkeit, Nährstoff Zink 25 zu binden abgeleitet. H. pylori erfordert Zink, wie es bei früheren Untersuchungen bestimmt wurde, die ein chemisch definiertes Medium nutzten, um die Mikronährstoffanforderungen für dieses Pathogen zu ermitteln, um zu wachsen und zu vermehren 34 . Zusätzlich war Calprotectin in H. pylori- infizierten Geweben sehr reichlich vorhanden und mit neutrophilen Infiltraten assoziiert, was anzeigt, dass der Wirt Calprotektin als antimikrobielle Strategie während der Infektion und nachfolgende Entzündung 25 , 35 einsetzen kann . Der jüngste Beweis von den unvoreingenommenen Proteomik-Screening-Techniken deutet darauf hin, dass unter Bedingungen, bei denen reaktive Sauerstoffspezies reichlich vorhanden sind, calprotecZinn unterliegt posttranslationalen Modifikationen, die die Hexa-Histidin-Bindungsstelle verändern und dadurch die Metallbindungsaktivität des Proteins 36 hemmen. Als solches haben wir vermutet, dass andere S100A-Familienproteine ​​unter dem breiten Repertoire dieser Moleküle potentiell als Hilfsmetall-Chelatoren wirken könnten. Wir haben S100A12 für eine weitere Studie ausgewählt, weil es in dem oben erwähnten Screen für die posttranslationale Modifikation nicht identifiziert wurde, es hat die Fähigkeit, Zink zu binden, und es ist sehr reich an menschlichen Geweben, die von H. pylori- infizierten Individuen stammen. Unsere Arbeit zeigt, dass S100A12 H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen Weise im G27-Stamm von H. pylori hemmen kann und dass die antimikrobielle Aktivität dieses Proteins durch die Zugabe von überschüssigem Nährstoff-Zink umgekehrt werden kann. Diese Arbeit ergänzt unsere bisherige Arbeit, die darauf hinweist, dass S100A12 antimikrobielle Aktivität gegen PMSS1 und 7.1 ausübt3-Stämme von H. pylori , die ihre breite antibakterielle Wirkung gegen zahlreiche klinische Isolate und Labor-adaptierte Stämme von H. pylori 18 zeigen . Gemeinsam bestätigen diese Ergebnisse die Bedeutung von S100A12 als Mechanismus zur Kontrolle des Bakterienwachstums und der Proliferation durch Ernährungsunempfindlichkeit. Zukünftige Untersuchungen dieser wichtigen Wirtsbakterien-Interaktion könnten die Ausnutzung der Aktivität von S100A12 zur Verringerung der Bakterienbelastung innerhalb von Wirtsgeweben oder die Bestimmung des Beitrags dieses Proteins zur Immunsignalisierung im Kontext der H. pylori- Infektion umfassen.

<table><tbody><tr><td>S100A12 Expression</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expression cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) kompetente Zellen</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Komponenten</td><td></td><td></td><td></td>des Autoinduktionsmediums</tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4Research</td> <td>Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4Research</td> <td>Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Research Products International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Research Products</td><td>International G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lactose Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>Selection agent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>S100A12 Purification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start Chromatographie System</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>H. pylori Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blut-Agar-Platten</td><td>Laborbedarfsunternehmen</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brucella-Brühe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zinkchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, reinigung und antimikrobielle aktivität von s100a12

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin-Proteine ​​sind wichtige Mediatoren der angeborenen Immunität und sind Mitglieder der S100-Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen. Einige S100-Proteine ​​haben die Fähigkeit, Übergangsmetalle mit hoher Affinität zu binden und sie effektiv von eindringenden mikrobiellen Pathogenen in einem Prozess abzuscheiden, der als &quot;ernährungsbedingte Immunität&quot; bezeichnet wird. S100A12 (EN-RAGE) bindet sowohl Zink als auch Kupfer und ist in angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und Neutrophilen sehr reichlich vorhanden. Wir berichten über eine verfeinerte Methode für die Expression, Anreicherung und Reinigung von S100A12 in ihrer aktiven, metallbindenden Konfiguration. Die Verwendung dieses Proteins in Bakterienwachstums- und Lebensfähigkeitsanalysen zeigt, dass S100A12 eine antimikrobielle Wirkung gegen den bakteriellen Pathogen, Helicobacter pylori, aufweist . Die antimikrobielle Aktivität beruht auf der Zinkbindungsaktivität von S100A12, die Nährstoffzink chelatisiert und dadurch H. pylori verhungert, was Zink für Wachstum und p erfordertRolltation

S100A12 Expression und Reinigung Eine dreistufige Reinigung ergab 40 mg rekombinantes S100A12 aus 50 ml Bakterienkultur. Der erste Schritt war eine Ammoniumsulfat-Präzipitation von endogenen E. coli- Proteinen. Dieser Stufe folgte eine Anionenaustauschchromatographie (Abbildung 1A ). Das Protein wird von einer SDS-PAGE verfolgt, die mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt ist (Abbildung 1B ...

Hier stellen wir eine Methode zur Expression und Reinigung von S100A12 (Calgranulin C) vor. Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung seiner antimikrobiellen Aktivität gegen den menschlichen Pathogen H. pylori .

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Isolierung und Reinigung von S100A12 in seiner aktiven Form zu erleichtern, sodass es für antimikrobielle Assays verwendet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, beispielsweise welche Rolle S100A12, ein antimikrobielles Peptid, spielt, das als Reaktion auf eine Infektion durch pathogene Bakterien produziert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass unser optimiertes Protokoll hohe Ausbeuten an stabilem, reinem S100A12-Dimer liefert, das in der Lage ist, Nährmetalle zu binden und zu sequestrieren.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da S100A12 unter bestimmten Bedingungen Oligomere unterschiedlicher Größe bildet und diese Oligomere in vitro eine verminderte antimikrobielle Aktivität aufweisen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir begannen, die Reinigung und antimikrobielle Aktivität eines verwandten S100A-Familienproteins namens Calprotectin zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend für die Größen- und Säulenschritte der abschließenden Reinigung.Und die antimikrobiellen Assays sind wichtig für den Erfolg dieses Verfahrens. Um dieses Verfahren zu beginnen, transformieren Sie kompetente BL21 DE3-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie anschließend ein bis fünf Mikroliter Plasmid zu 50 Mikrolitern Bakterien in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis hinzu.20 Minuten lang inkubieren. Danach die Zellen 30 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius wärmebehandeln. Zwei Minuten lang auf Eis inkubieren.Dann 500 Mikroliter SOC-Medien hinzufügen. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf einem rotierenden Schüttler mit 250 U/min inkubieren. Anschließend 150 Mikroliter der Transformationsreaktion auf LB-Agar-Medium, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, aufplattieren.Ansatz für 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation eine einzelne Kolonie aussäen und zwei Milliliter LB-Medium, das mit Ampicillin ergänzt wurde, ansäen. Bei 37 Grad Celsius im Rüttelinkubator bei 300 U/min vier bis sechs Stunden lang inkubieren.Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter Starterkultur zu 50 Milliliter ZYM 5052 Autoinduktionsmedium mit Ampicillin hinzu. Schütteln Sie 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 300 Umdrehungen pro Minute. Überführen Sie dann die Bakteriensuspension in ein Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie bei 4.000 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation entfernen Sie das Überstandmedium, protokollieren die Probe und lagern Sie die Zellpaste bei minus 80 Grad Celsius ein. Zurückgehend beginnen Sie damit, die Zellpaste in 30 Milliliter 20 Millimolar Tris, pH 8,0, erneut aufzuschwemmen. Anschließend beschallen Sie die Suspension auf Eis bei 20 Watt mit einem Zyklus von fünf Sekunden an und fünf Sekunden aus für insgesamt fünf Minuten, um die Zellen zu lysieren.Überführen Sie die sonifizierte Lösung in Zentrifugenröhrchen für Hochleistungszentrifugen. Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g und vier Grad Celsius für 30 Minuten, um das Zelllysat zu klären. Danach gießen Sie den Überstand in einen sauberen 100-Milliliter-Polypropylenbecher ab.Stellen Sie den Becher zur Abkühlung der Lösung auf Eis. Geben Sie einen Rührstab hinzu und fügen Sie langsam 11,20 Gramm Ammoniumsulfat hinzu. Rühren Sie die Lösung eine Stunde lang auf Eis um.Anschließend die Lösung in Zentrifugenröhrchen überführen und bei 20.000 × g bei vier Grad Celsius 20 Minuten lang zentrifugieren, um das ausgefällte Protein zu pelletieren. Das Überstand in Dialyse-Schläuche abgießen. Gegen einen Liter 20 Millimolar Tris bei vier Grad Celsius und pH 8,0 dialysieren. Den Dialysepuffer zweimal wechseln, wobei zwischen den Wechseln jeweils vier Stunden liegen.Danach eine Fünf-Milliliter-Sephrose-Säule mit 10 Milliliter 20 Millimolar Tris äquilibrieren. Mithilfe der Probepumpe etwa 40 Milliliter der S100A12-Lösung auf die Säule laden. Den Durchlauf sammeln.Als Nächstes säulen Sie mit 20 Millimolar Tris. Entwickeln Sie die Säule mit einem Null- bis 30-%-Gradienten über 19 Säulenvolumina. Sammeln Sie Fraktionen zu je fünf Milliliter.Verwenden Sie eine MES-SDS-Seite mit Coomassie-Färbung, um einen 10-Mikroliter-Aliquot jeder Fraktion zu analysieren. Anschließend werden die Fraktionen, die S100A12 enthalten, gesammelt. Mit einem Ultrafiltrationsgerät werden die Fraktionen auf fünf Milliliter konzentriert.Anschließend eine S75-Säule mit einer 120-Milliliter-Lösung aus 20 Millimolar Tris und 100 Millimolar Natriumchlorid äquilibrieren. Die fünf Milliliter Probe der konzentrierten Fraktionen injizieren. Danach die Säule über 120 Milliliter mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute entwickeln.Sammeln Sie Fraktionen zu je fünf Milliliter. Analysieren Sie jeweils ein 20-Mikroliter-Aliquot jeder Probe mittels SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung. Anschließend überprüfen Sie die Identität des Proteins und sammeln die Fraktionen gemäß dem schriftlichen Protokoll.Beginnen Sie damit, H. pylori in Brucella-Brühe, die mit 1X Cholesterin ergänzt wurde, auszustreichen. Kultivieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 250 U/min unter Zusatz von Luft mit 5 % Kohlendioxid. Verdünnen Sie H. pylori im Verhältnis 1:10 in eine Mischung aus 50 % Brucella-Brühe und 50 % Calprotectin-Puffer mit 1X Cholesterin.Und S100A12-Protein und/oder exogene Metalle nach Bedarf hinzufügen. Die antimikrobiellen Assays sind ein kritischer Punkt. Es ist wichtig, einen Calprotectin-Puffer zu verwenden, um die Stabilität der S100A12-Dimere sicherzustellen, und ein metallarmes Mineralsubstrat für die bakteriologischen Wachstumsassays bereitzustellen, damit das Protein nicht mit überschüssigen Mikronährstoffen überlastet wird, die üblicherweise in reichhaltigen komplexen bakteriologischen Medien enthalten sind.Am folgenden Tag verdünnen Sie die Proben seriell. Anschließend impfen Sie sie auf Blutagarplatten aus. Lassen Sie die Bakterienkolonien zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius in Luft mit 5 % Kohlendioxid wachsen.Danach die bakterielle Zellvermehrung wie im Textprotokoll beschrieben berechnen. In dieser Studie wird eine optimierte Methode zur Expression und Reinigung von S100A12 in seiner aktiven Metallbindungsform vorgestellt. Der dreistufige Reinigungsprozess beginnt mit einer Fällung endogener E.coli-Proteine mittels Ammoniumsulfat, gefolgt von einer Anionenaustauschchromatographie.Nach der Verfolgung des Proteins mittels SDS-PAGE mit Coomassie-Bright-Blue werden die Fraktionen, die S100A12 enthalten, für die Größenausschlusschromatographie gesammelt. S100A12 ist ein Homodimer mit 92 Aminosäuren pro Untereinheit und hat ein Gesamtmolekulargewicht von etwa 21 Kilodalton.Die antimikrobielle Aktivität von S100A12 wird anschließend mittels quantitativer mikrobiologischer Kulturtechniken untersucht. Die Zählung von Bakterienzellen zeigt, dass die Exposition gegenüber 100 Mikrogramm pro Milliliter S100A12 in Gegenwart oder Abwesenheit einer externen Nährstoffquelle Zink die Bakterienvitalität nicht signifikant hemmte. Bei der Exposition gegenüber 1.000 Mikrogramm pro Milliliter S100A12 hingegen führte das Medium allein zu einem 69-fachen Rückgang der Bakterienvitalität.Das Hinzufügen einer exogenen Zinkquelle kehrt dieses Ergebnis um, was zeigt, dass die antimikrobielle Aktivität von S100A12 von seiner Zink-Sequestrierungsaktivität abhängt. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann die Proteinexpression und -reinigung in drei bis vier Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die massenspektrometrische Analyse mit induktiv gekoppeltem Plasma eingesetzt werden, um weitere Fragen zu beantworten.Wie beeinträchtigt die Metallsequestrierung das mikrobielle Wachstum? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg, um die nutritive Immunität von H.pylori zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das antimikrobielle Protein S100A12 exprimiert, reinigt und seine Aktivität quantifiziert.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit H.pylori äußerst gefährlich sein kann. Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie beispielsweise die Arbeit in einem BS2-zertifizierten Bereich, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in den Bereich der Magenerkrankungen, einschließlich Ulkus, Gastritis und invasivem anexialem Karzinom.Indem wir diese Prozesse verstehen, sind wir besser gerüstet, um neuartige antimikrobielle Moleküle zu entwickeln, die auf diese Prozesse abzielen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biochemie der S100A-Proteinfamilie ermöglicht, kann sie auch zur Untersuchung ihrer Rolle bei der Immunsignalübertragung und zahlreichen Krankheitsprozessen wie Krebs, Arthritis und Infektionskrankheiten angewendet werden.

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

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