Name: Ein In Vitro Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Erfahren Sie die schnelle Gleichgewichtsdialyse zur Vorhersage der Arzneimittelbindung an Caseum bei Tuberkulose-Läsionen. Diese Methode ersetzt Tierversuche und ermöglicht reproduzierbare Daten zur Penetration antimikrobieller Substanzen.

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Wir wünschen Johnson &amp; Johnson, der TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X und Trius Therapeutics danken für die Bereitstellung von Bedaquilin, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid und Tedizolid sind. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li und Danielle Weiner unterstützte mit MALDI-Analyse, bioanalytische Verfahren, Herstellung der caseum Surrogat, chemische Synthese und Isolierung von Kaninchen-caseum. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der Bill und Melinda Gates-Stiftung, Auszeichnung # OPP1044966 und OPP1024050 V. Dartois, NIH Geteilt Instrumentation Grant-S10OD018072 sowie eine gemeinsame Finanzierung von der Bill and Melinda Gates Foundation und Wellcome Trust für ein Kompetenzzentrum durchgeführt für Lead-Optimierung für Krankheiten der Dritten Welt zu P. Wyatt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Use Committee des NIAID (NIH), Bethesda, MD durchgeführt. Alle Studien mit M. tuberculosis wurden in einem Labor mit Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt. 1. Kaninchen Infektionsmodell und Caseum Sammlung <ol><li> Infect Neuseeland weiße Kaninchen mit M. tuberculosis einen nasen nur Aerosol - Belichtungssystem unter Verwendung von wie oben beschrieben. 12, 13 erlauben die Infektion für 12-16 Wochen fortzuschreiten. Sedate die Kaninchen, die mit 35 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin intramuskulär, euthanize die Kaninchen mit 0,22 ml / kg Pentobarbital-Natrium und Phenytoin-Natrium intravenös und mit den necropsies fortzufahren. </li><li> Mit einer Pinzette und Skalpell entfernen Lunge aus der Brust cavity. Von jedem Lungenlappen, seziert aus einzelnen Hohlräumen und großen nekrotischen Granulome mit einem Skalpell. Vorsichtig abkratzen caseum aus dem Hohlraum und Granulom Wänden. Wiegen, aufnehmen und speichern Proben in 2 ml Röhrchen mit Schraubverschluss bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Gamma-Bestrahlung der infektiösen caseum Proben bei 3 MegaRad auf Trockeneis sie uninfectious und sicher für den Einsatz in einem BSL-2 Labor zu machen. </li></ol> 2. In - vitro - Erzeugung von Caseum Surrogate von THP-1 - Zellen <ol><li> Wachsen THP-1 Monozyten in RPMI 1640-Medium (2 mM L-Glutamin und 10% fötales Rinderserum) in T175 Zellkulturflaschen (80 ml / Kolbe). Inkubieren der Kolben in einer 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 3-4 Tage. </li><li> Zentrifugieren der Kultur aus einer T175-Kolben in zwei 50 ml konischen Röhrchen bei 150 × g für 5 min. Überstand verwerfen und suspendiert das Pellet in 10 ml RPMI 1640 Medien. </li><li> Pipette 5 &amp; mgr; l dieser Kultur in ein 1,5 ml-Röhrchen mit 45 &amp; mgr; l tRypan blau. Gründlich mischen durch Pipettieren. Übertragung 10 &amp; mgr; l zu einem Hämozytometer und zählen die Anzahl der lebensfähigen THP-1-Monozyten (ungefärbten) ein Lichtmikroskop (Vergrßerung 10X) verwendet wird. Berechnen Sie die Anzahl der lebenden Zellen pro ml der Kultur. Verdünne mit RPMI - Medium auf die Enddichte von 1,25 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Last 40 ml der Kultur auf einer großen Zellkulturplatte (50 x 10 6 Zellen / Platte). Werden 40 &amp; mgr; l von 100 &amp; mgr; M PMA (Phorbol-12-Azetat-myristate13 in Ethanol hergestellt) und lassen Zellen über Nacht in dem Inkubator haften. HINWEIS: Endgültige Konzentration von PMA ist 100 nM. </li><li> Verdünnte reine Ölsäure (OA) (0,89 g / ml) in Ethanol zu einer Konzentration von 0,1 M (dh 31,7 uL OA in 968,3 &amp; mgr; l Ethanol). Man verdünnt diese Lösung in frischem vorgewärmtem RPMI Medium auf eine Konzentration von 10 mM. Man verdünnt diesen OA Suspension auf 0,4 mM (endgültige Arbeitskonzentration) in RPMI-Medium vorgewärmt auf 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die vorhandenen Medien und nichtAdhärierten Zellen aus den Zellkulturplatten und fügen sanft 40 ml 0,4 mM OA zu den THP-1-Makrophagen (THP-M) hinzu. Inkubieren bei 37 ° C im Inkubator über Nacht. </li><li> Verwenden Sie ein Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung, um das Vorhandensein zahlreicher Lipidkörper-Einschlüsse in jedem THP-M visuell zu bestätigen. Entfernen Sie alle RPMI-Medium aus den Zellkulturplatten und waschen Sie die adhärenten Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Verwendung einer 50 ml serologischen Pipette. HINWEIS: Lipidkörper erscheinen als kleine, klare, sphärische Strukturen im Cytoplasma des THP-M. </li><li> Füge 40 ml 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS zu jeder Platte hinzu. 15 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Lösen Sie die schaumigen Makrophagen (FM) durch wiederholtes Pipettieren über die Oberfläche der ganzen Platte mit einer 10-mL serologischen Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 50-ml-Kegelrohr und drehen Sie sie bei 150 xg für 5 min. </li><li> Das Zellpellet wird in 10 ml PBS (dritter PBS-Wäsche) a resuspendiertNd Übertragung auf eine vorgewogene 15-ml-konische Rohre. Spinne bei 150 xg für 5 min. Den Überstand sorgfältig mit einer serologischen Pipette abspülen und entsorgen. </li><li> Betrachten Sie die FM-Pellets zu 3 Gefrier-Tau-Zyklen, um die Zellen zu lysieren und sie bei 75 ° C für 20-30 min zu inkubieren, um Proteine ​​in der Matrix zu denaturieren. Die Pellets bei -20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren. </li></ol> 3. Rapid Equilibrierung Dialyse (RED) Assay <ol><li> 10 mM Stammlösungen aller Testverbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereiten. Verdünnen Sie zu 500 μM Arbeitslösungen in DMSO vor jedem Assay. </li><li> Wiegen Sie die Röhre mit dem Fallum Surrogat Pellet. Subtrahiere das Gewicht des leeren Rohres, um das Gewicht des Pellets allein abzuleiten. Füge 2-3 Metallperlen pro Röhrchen hinzu und unter Verwendung eines Gewebehomogenisators bei 1.200 Hüben / min für 1 min den Fallum oder die Surrogatmatrix in PBS (1: 9 w / v) zu stören, um 10x verdünnte Suspension jeder Matrix zu erreichen. </li><li> Spike 6,5 μl der 500ΜM-Lösung der Testverbindung in 643,5 &amp; mgr; l des Homogenats, um die Endkonzentration von 5 &amp; mgr; M (&amp; le; 1% DMSO) zu erreichen und zu verwirbeln. </li><li> Legen Sie die ROT-Einsätze in die Grundplatte. Füge 200 μl der drogenspiked Matrix in die Spenderkammer (roter Ring) jedes RED-Inserts und 350 μl PBS in jede Empfängerkammer ein. Vorbereiten von 3 Einsätzen für jede Testverbindung (dreifache Proben). Siegelplatte mit einer Klebeplatte abdichten und bei 37 ° C auf dem Thermomixer bei 200 U / min (1 xg) für 4 h inkubieren. </li><li> Nach der Inkubation mischen Sie den Inhalt der Spender- und Empfängerkammern vorsichtig 2-3 mal auf und ab. 20 μl Aliquote von Homogenat aus den Spenderkammern pipettieren und 20 μl sauberes PBS in ein 1,5 mL Röhrchen (1: 1) zugeben. In ähnlicher Weise pipettieren Sie 20 μl Aliquots von PBS-Proben aus den Empfängerkammern und fügen Sie 20 μl sauberes Homogenat (Matrix-Matching) hinzu. 8 HINWEIS: Matrix-Matching eliminiert die neFür 2 separate Kalibrierkurven (in Homogenat und PBS) für die quantitative Analyse. Der Inhalt der Spenderkammer kann im Laufe der Zeit sedimentieren. Den Inhalt vor dem Entfernen von Aliquoten vorsichtig mischen. </li></ol> 4. LC-MS Quantifizierung und Datenanalyse <ol><li> Fügen Sie 160 μl 1: 1 Methanol: Acetonitril mit 500 ng / ml Diclofenac oder 10 ng / ml Verapamil (interner Standard) zu jedem Röhrchen hinzu und verwirbeln Sie, um Proteine ​​auszufällen. Zentrifugieren bei 10.000 xg für 5 min, um den Niederschlag zu sedimentieren und die Überstände in 96-Well-Tiefbrunnen-Platten zur Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LCMS) zu überführen. 7 </li><li> Erstellen Sie Kalibrierkurven von 1-1.000 nM für jede Testverbindung, während Sie die gleiche Matrixzusammensetzung wie die obigen Proben halten. Quantifizieren Sie die Konzentration der Testverbindung in Proben aus den Spender- und Empfängerkammern nach einer LC-MS-Methode. </li><li> Berechnen Sie den ungebundenen Bruch ( f u ) of die Droge in verdünnter Matrix unter Verwendung von Gleichung 1. Berechne des f u in unverdünnter Matrixgleichung unter Verwendung von 2 (D = Verdünnungsfaktor von 10). 14 <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Überprüfen Sie die Wiederherstellung (Massenbilanz) jeder Verbindung unter Verwendung von Gleichung 3 zu identifizieren Verbindungen mit Stabilität / Stoffwechsel / nicht-spezifische Bindungsprobleme. HINWEIS: Wiederherstellung fällt typischerweise zwischen 70% und 130%. 15 <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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</ol>

Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Pulmonary nekrotische Läsionen und Hohlräumen bei Tuberkulose-infizierten Patienten enthalten Subpopulationen von Bakterien, die zur medikamentösen Behandlung recalcitrant sind. Die käsigen Kerne dieser Strukturen sind besonders verantwortlich, diese persisters in einer extrazellulären Umgebung für die Beherbergung. 16 günstige Verteilung von antibakteriellen Mitteln in diese entfernten Standorte wird angenommen , dass eine wichtige Determinante der Tuberkulose Wirksamkeit von Medikamenten sein. ...

Die Behandlung der pulmonalen Tuberkulose-Krankheit erfordert eine effektive Verteilung der Medikamente in verschiedene Arten von Läsionen. Nekrotische Läsionen und Hohlräume enthalten käsige Zentren, die Subpopulationen von drogenverträglichen oder &quot;persistenten&quot; Bakterien beherbergen. 1 , 2 Die Kavitationserkrankung ist mit minderwertigen Heilungsraten und schlechter Prognose verbunden. 3 , 4 Frühere Studien haben gezeigt, dass mit Hilfe von quantitativen und bildgebenden Techniken die Fähigkeit, in den Fall zu dringen, signifikant von einer Medikamentenklasse zur anderen variiert. 5 , 6 Diese Methoden erfordern jedoch die Verwendung von Tierinfektionsmodellen, die langsam und langwierig sind. Ein in vitro- Assay, der die Arzneimittelbindung an ex vivo caseum misst, wurde entworfen. Diese Bindung wurde gefunden, um umgekehrt mit der Arzneimittelpenetration in käsigen Granulomen zu korrelieren und ist daherAls prädiktives Werkzeug verwendet. 7 Gleichgewichtsdialyse gilt als der Goldstandardansatz für Plasmaprotein-Bindungsstudien. Die RED-Vorrichtung (Rapid Equilibrium Dialyse) bietet ein schnelles, einfach zu bedienendes und zuverlässiges System zur Durchführung solcher Assays. 8 Das Gerät besteht aus zwei Komponenten: Einweg-Einweg-Einsätze bestehend aus 2 Kammern, die durch einen vertikalen Zylinder mit halbdurchlässiger Membran getrennt sind; Und wiederverwendbare Basisplatten, die bis zu 48 Einsätze zu einem Zeitpunkt aufnehmen können. Die Dialysemembran hat einen 8 kDa-Molekulargewichts-Cutoff (MWCO), der sich ideal für Arzneimittel-Makromolekül-Bindungsstudien eignet. Das hohe Flächen-zu-Volumen-Verhältnis des Membranabteils ermöglicht eine schnelle Dialyse und Äquilibrierung. Sowohl die Einsätze als auch die Basisplatte wurden für eine minimale unspezifische Bindung validiert. Die Kombination der RED-Vorrichtung mit bioanalytischen Techniken liefert genaue Schätzungen der ungebundenen Fraktionen von Arzneimitteln in pLASMA. 8, 9 Obwohl ursprünglich Plasmaproteinbindung zu messen, das RED-Gerät wird in mehreren Gewebebindungsstudien verwendet worden, unter Verwendung von Homogenaten. 10, 11 in diesem Protokoll messen wir Medikament caseum Bindung, die nekrotische Ablagerungen von den nekrotischen Läsionen und der Hohlräume tuberculosis infizierten Kaninchen ausgeschnitten. Die azelluläre und nicht-vaskuläre Natur des käsigen Materials macht es leicht in eine homogene Suspension zu homogenisieren, die mit dem Assay kompatibel ist. Da caseum ist mühsam herzustellen und schwer zu bekommen, wird das Protokoll auch für die Verwendung mit einer Surrogat-Matrix validiert, die von schaumigen Makrophagen hergestellt wird. THP-1 Monozyten abgeleiteten Makrophagen werden mit Ölsäure induziert, um mehrere Lipidkörper ansammeln, die sie geben ihre ‚schäumenden‘ Aussehen. Diese Lipid-beladenen Zellen werden geerntet undverarbeitet, um eine Matrix zu erzeugen, die wir als Ersatz verwenden, um caseum. Diese Studie hat gezeigt , dass die Drogen Bindung an diese Surrogat Matrix korreliert gut mit zu caseum Bindung, effektiv den in vivo nachahmt Prozess, die Arzneimittelpenetration in dem käsigen Kern von Granulomen und Hohlräumen verhindert.

<table><tbody><tr><td>Neuseeländische weiße Kaninchen</td><td></td><td></td> Covance-HN878 <td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamin) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazin) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (Pentobarbital-Natrium und Phenytoin-Natrium) Lösung&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monozytäre Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2; TC-behandelter Kolben (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medien ohne Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Rinderserum, gammabestrahlt&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-Glutamin, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC-Schale, 145 mm x 20 mm, belüftet</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Ölsäure&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Gerät Wiederverwendbare Basisplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Geräteeinsätze, 50/Karton&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Werkzeug zum Entfernen von Einsatzeinsätzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Siegel für selbstklebende Platten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamilhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenisator Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Beradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; C-Chip-Einweg-Hämazytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechte Lichtmikroskopie</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binäres Flüssigkeitschromatographie-System</td><td>Agilent</td><td>1260</td> Mehrkomponenten-Massenspektrometer <td></td></tr><tr><td></td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

ein<em&gt; in vitro</em&gt; caseum-bindungsassay, der die drug penetration in tuberkulose-läsionen vorhersagt

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Die Tilgung der Tuberkulose-Krankheit erfordert Medikamentenregimen, die die Mehrfachschichten komplexer Lungenläsionen durchdringen können. Die Arzneimittelverteilung in den käsigen Adern von Hohlräumen und Läsionen ist besonders wichtig, weil sie Subpopulationen von drogenverträglichen Bakterien, die auch allgemein als persisten bezeichnet werden, beherbergen. Bestehende Methoden zur Messung der Arzneimittelpenetration bei Tuberkulose-Läsionen beinhalten kostspielige und zeitaufwändige in vivo- pharmakokinetische Studien, gekoppelt an bioanalytische oder bildgebende Verfahren. Die In-vitro- Messung der Arzneimittelbindung an Fallmakromoleküle wurde als Alternative zu solchen Techniken vorgeschlagen, da diese Bindung die passive Diffusion von Arzneimittelmolekülen durch den Fall beeinträchtigt. Die schnelle Gleichgewichtsdialyse ist ein schnelles und zuverlässiges System zur Durchführung von Plasmaprotein- und Gewebebindungsstudien. In diesem Protokoll haben wir eine schnelle Gleichgewichts-Dialyse (RED) -Gerät verwendet, um die Arzneimittelbindung an Homogenate von caseum zu untersuchen, das excis istAus den Läsionen und Hohlräumen von Tuberkulose-infizierten Kaninchen. Das Protokoll beschreibt auch, wie man eine Surrogatmatrix aus lipidbeladenen THP-1-Makrophagen erzeugt, um anstelle von caseum zu verwenden. Dieser Fall / Surrogat-Bindungstest ist ein wichtiges Instrument in der Tuberkulose-Wirkstoffforschung und kann angepasst werden, um die Arzneimittelverteilung bei Läsionen oder Abszessen, die durch andere Krankheiten verursacht werden, zu untersuchen.

Mit diesem Protokoll haben wir Hunderte von Tuberkulose Medikament Entwicklung Verbindungen für ihre vorhergesagte Effizienz bei Eindringen Fallum getestet. Abbildung 1 zeigt die Grundkonzepte des ROTEN Assays. Die Dialysemembran der RED-Inserts ermöglicht es, dass ungebundene kleine Moleküle vom Spenderbrunnen zum Empfänger gut diffundieren und schließlich ein Gleichgewicht zwischen beiden Kompartimenten erreichen. Kleine Moleküle, die an Makromoleküle wie Proteine ​​od...

Hier beschreiben wir eine schnelle Gleichgewichtsdialyse (RED) Methode zur Messung der Arzneimittelbindung an den Fall aus pulmonalen Tuberkuloseläsionen und Hohlräumen. Das Protokoll wird auch mit einer schaumigen Makrophagen-abgeleiteten Matrix verwendet, die ein wirksames Surrogat zum Fall ist.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Bindung von Wirkstoffen an Caseum aus tuberkulösen Läsionen vorherzusagen. Diese Methode kann dabei helfen, die Wirksamkeit der Penetration von Antimykotika in das Caseus-Zentrum nekrotischer Läsionen zu bestimmen, ohne auf Tierversuche oder kostspielige bildgebende Verfahren angewiesen zu sein. Obwohl diese Methode Einblicke in die direkte Erforschung der Tuberkulose ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere Erkrankungen anwendbar, die durch die Bildung von Läsionen oder Abszessen gekennzeichnet sind, bei denen die Wirkstoffpenetration begrenzt ist.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Einheitlichkeit bei der Durchführung des Protokolls die Reproduzierbarkeit der Daten zwischen Experimenten sicherstellt. Heute werde ich das Zellkulturverfahren und die Herstellung der Ersatzmatrix demonstrieren. Hsin-pin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus unserem Labor, wird den korrekten Test vorführen.Züchten Sie THP-1-Monozyten in T-175-Zellkulturgefäßen, die 80 mL RPMI 1640-Medium mit 2 Millimolar L-Glutamin und 10 Prozent fetalem Kälberserum enthalten. Inkubieren Sie die Gefäße bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für drei bis vier Tage. Sobald die Zellen etwa 70 Prozent konfluent sind, teilen Sie sie auf zwei 50-mL-Konizflaschen auf und zentrifugieren Sie sie bei 150 × g für fünf Minuten.Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und das Pellet in 10 mL RPMI 1640-Medium suspendieren. Pipettieren Sie fünf Mikroliter dieser Kultur in ein 1,5-mL-Röhrchen, das 45 Mikroliter Trypanblau enthält. Gründlich durch Pipettieren mischen.Übertragen Sie 10 Mikroliter auf ein Hämozytometer. Zählen Sie mithilfe eines Lichtmikroskops bei 10facher Vergrößerung die Anzahl lebensfähiger THP-1-Monozyten. Nach Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen pro Milliliter Kulturansatz verdünnen Sie diese mit RPMI-Medium auf eine Enddichte von 1,25 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.Fügen Sie 40 µL 100 µM PMA dem Reagenzglas hinzu. Überführen Sie die Kultur anschließend in eine 140 × 20 mm große Zellkulturplatte. Lassen Sie die Zellen über Nacht im Inkubator ankleben.Als Nächstes verdünnen Sie reine Iliacsäure in Ethanol auf eine Konzentration von 0,1 Molar. Hier werden 31,7 Mikroliter Iliacsäure in 968,3 Mikrolitern Ethanol gelöst. Verdünnen Sie die Lösung in frischem, vorgewärmtem RPMI-Medium auf eine Konzentration von 10 Millimolar.Verdünnen Sie die Iliacsäure-Suspension auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 0,4 Millimolar in RPMI-Medium, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Die Verdünnung der Iliacsäure in vorgewärmtem RPMI-Medium ist entscheidend, um eine ausreichende Löslichkeit der Fettsäure in wässriger Lösung sicherzustellen. Entfernen Sie mit einer Pipette das vorhandene Medium und die nicht-angewachsenen Zellen aus der Zellkulturplatte mit THP-1-Makrophagen und geben Sie vorsichtig 40 mL einer 0,1-Millimolar-Iliacsäure-Lösung hinzu.Übernacht bei 37 Grad Celsius im Inkubator inkubieren. Am nächsten Tag mit einem Lichtmikroskop bei 40facher Vergrößerung visuell die Anwesenheit zahlreicher Lipidkörper-Inklusionen in THP-Makrophagen bestätigen. Lipidkörper erscheinen als kleine, klare, kugelförmige Strukturen im Zytoplasma.Entfernen Sie das gesamte RPMI-Medium von der Zellkulturplatte und waschen Sie die anhaftenden Zellen vorsichtig zweimal mit PBS unter Verwendung einer 50-mL-Serologiepipette. Geben Sie 40 mL einer 5 Millimolar EDTA in PBS-Lösung zur Platte hinzu. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.Danach die schaumigen Makrophagen mit einer 10-mL-Serologiepipette ablösen, indem die Flüssigkeit mehrmals über die gesamte Plattenoberfläche auf- und abpipettiert wird. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 50-mL-Konischglas und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang mit 150 × g.Nach dem Zentrifugieren resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL PBS und überführen sie in ein vorher gewogenes kegelförmiges 15-mL-Röhrchen. Zentrifugieren Sie erneut bei 150 × g für fünf Minuten. Aspirieren Sie dann vorsichtig den Überstand mit einer serologischen Pipette und entsorgen Sie ihn.Unterziehen Sie die schaumigen Makrophagen-Paletten drei Zyklen mit Wechsel zwischen Trockeneis und Inkubation bei 37 Grad Celsius auf einem Wärmespeicherblock, um die Zellen zu lysieren. Anschließend inkubieren Sie sie bei 75 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten, um die Proteine in der Matrix zu denaturieren.Bewahren Sie die Paletten bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie benötigt werden. Die in diesem Abschnitt des Videos gezeigten Rapid Equilibrium Devices oder der RED-Test können entweder mit der zuvor hergestellten Surrogatmatrix oder mit Material aus tuberkulösen Läsionen infizierter Kaninchen durchgeführt werden. Hier zeigen wir den Test, wie er mit der Surrogatmatrix durchgeführt wird.Stellen Sie 10 Millimolar-Stammlösungen aller Testverbindungen her. Hier wird Moxyfloxacin in DMSO gelöst. Verdünnen Sie diese vor jedem Versuch in DMSO auf 500 Mikromolar-Arbeitslösungen.Wiegen Sie das Röhrchen mit dem entfernten Käse oder dem Ersatzpräparat. Subtrahieren Sie das Gewicht des leeren Röhrchens, um das alleinige Gewicht des Käses oder des Ersatzpräparats zu ermitteln. Geben Sie zwei bis drei Metallkügelchen pro Röhrchen hinzu und fügen Sie dann PBS im Verhältnis von 1:9 (Gewicht zu Volumen) hinzu. Homogenisieren Sie den Käse oder die Ersatzmatrix mithilfe eines Vortexgeräts eine Minute lang.Geben Sie 6,5 µL der hergestellten Testverbindung zu 643,5 µL des Homogenats. Um die Endkonzentration von fünf µM zu erreichen, wirbeln Sie die Probe. Als Nächstes setzen Sie die roten Einsätze in die Basisplatte ein.Bereiten Sie die Einsätze für jeden Test mit jeder Verbindung im Dreifachansatz vor. Geben Sie 200 Mikroliter der mit der Droge versetzten Matrix in die rote Donorkammer jedes roten Einsatzes. Anschließend geben Sie 350 Mikroliter PBS in jede Rezeptorkammer.Bringen Sie eine Klebeversiegelung auf die Platte auf und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Thermomischer bei 200 Umdrehungen pro Minute. Nach der Inkubation vorsichtig den Inhalt der Donor- und Rezipientenkammern durch zweimaliges bis dreimaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Überführen Sie 20 Mikroliter Homogenat aus jeder der Donorkammern in 20 Mikroliter frische PBS in ein 1,5-mL-Röhrchen.Ähnlich werden 20 µL Aliquots von PBS-Proben aus den Empfängerkammern in 20 µL frischen Homogenat überführt. Die Matrixanpassung macht es überflüssig, für die quantitative Analyse zwei getrennte Eichkurven für Homogenat und PBS zu erstellen. Der Inhalt der Spenderkammer setzt sich im Laufe der Zeit ab. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Pipettieren, bevor Aliquote entnommen werden. Geben Sie 160 Mikroliter eines 1:1-Gemischs aus Methanol und Acetonitril, das 500 Nanogramm pro Milliliter Diclofenac oder 10 Nanogramm pro Milliliter Verapamil als interne Standardsubstanz enthält, zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Vortexen Sie die Probe, um die Proteine auszufällen.Zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für fünf Minuten, um das Präzipitat zu sedimentieren, und überführen Sie anschließend die Überstände in 96-Well-Tiefbrunnenplatten zur Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie, LCMS. Erstellen Sie Kalibrierkurven von einem bis 1000 Nanomolar für jede Testverbindung, indem Sie Verdünnungen der Stammlösung der Verbindung herstellen und dabei die gleiche Matrixzusammensetzung wie bei den Proben beibehalten. Bestimmen Sie die Konzentration der Testverbindung in den Proben aus den Donor- und Rezipientenkammern mithilfe einer LCMS-Methode.Berechnen Sie den ungehinderten Anteil (freier Anteil), oder fu, des Wirkstoffs und der verdünnten Matrix, unter Verwendung der hier gezeigten Gleichung eins. Berechnen Sie anschließend den fu in der unverdünnten Matrix mithilfe der Gleichung zwei, wobei D einem Verdünnungsfaktor von 10 entspricht. Überprüfen Sie abschließend die Rückgewinnung oder Massenbilanz jeder Verbindung mithilfe der hier gezeigten Gleichung drei.Um Verbindungen mit Stabilitäts-, Metabolismus- oder unspezifischen Bindungsproblemen zu identifizieren. Beachten Sie, dass die Wiederfindung typischerweise zwischen 70 Prozent und 130 Prozent liegt. Das in diesem Video beschriebene Protokoll wurde verwendet, um Hunderte von Wirkstoffkandidaten gegen Tuberkulose hinsichtlich ihrer vorhergesagten Effizienz beim Durchdringen von Käsum zu testen.Die Dialysemembran der roten Einsätze ermöglicht es, dass ungebundene kleine Moleküle aus dem Donator-Well in den Rezeptor-Well diffundieren und schließlich ein Gleichgewicht zwischen beiden Kompartimenten erreicht wird. Kleine Moleküle, die an Makromoleküle wie Proteine oder Lipide gebunden sind, verbleiben im Donator-Well. Die quantitative Analyse der Proben aus beiden Kompartimenten erlaubt die Berechnung des ungebundenen Anteils, fu, jedes kleinen Moleküls in der Casea- oder Ersatzmatrix, wie hier gezeigt. Je höher der fu-Wert, desto umfangreicher diffundiert das Medikament in das Caseum. Die matrixunterstützte Laser-Desorptions-Ionisation, kurz MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung, wurde für sechs Wirkstoffe durchgeführt. Ionenkarten repräsentativer Lungenesionen sind hier dargestellt, wobei die Signalintensität durch die Skala links angegeben ist.Die H&#228;matoxylin- und ESN- oder HNE-F&#228;rbung benachbarter Schnitte ist unterhalb dargestellt. Die schwarz-wei&#223;en Konturlinien heben das k&#228;sige Zentrum jeder L&#246;sion hervor. Diese Daten unterst&#252;tzen die Hypothese, dass Wirkstoffmolek&#252;le aus der Grenzfl&#228;che heraus in den &#228;u&#223;eren Bereich des K&#228;ses diffundieren, entlang der zellul&#228;ren Schichten der L&#246;sion.Die Bindung an käsige Makromoleküle immobilisiert das Medikament und verhindert dessen weiteres Eindringen in das käsige Zentrum. Wie hier gezeigt, ist die aus THP-1-abgeleiteten fettgefüllten Makrophagen hergestellte Matrix ein wirksamer Ersatz für echtes Käsegewebe. Die Bindung in beiden Matrizes korreliert stark miteinander.Mit dieser Methode können mehrere Verbindungen gleichzeitig getestet werden, um Zeit und Ressourcen zu sparen. Wir bezeichnen dies als Kassetten-Testung. Seit ihrer Entwicklung wurde diese Methode in mehreren Programmen zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten für die Tuberkulose-Therapie eingesetzt.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikrobakterien und tuberkuloseinfizierten Gewebeproben äußerst gefährlich sein kann und vor der Handhabung infizierter Proben in einem BSL-2-Labor ein validiertes Gewebesterilisationsprotokoll unter Verwendung von Gammastrahlung angewendet werden sollte. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Sarathy, J. P. et al. Ein  In-vitro-Caseum-Bindungsassay, der die Penetration von Medikamenten in Tuberkuloseläsionen vorhersagt. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zur Messung der Wirkstoffbindung an das Caseum von Tuberkuloseläsionen mittels Schnellgleichgewichtsdialyse. Es beschreibt die Schritte zur Herstellung von Caseumsuspensionen, zur Durchführung der Dialyse und zur Berechnung der ungebundenen Wirkstofffraktion, um das Eindringen des Medikaments in das...

Messung der Wirkstoffbindung an Caseum aus Tuberkulose-Läsionen mit der Rapid Equilibrium-Dialysemethode

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektionen. Es wird ein in vitro Infektionsmodell mit Mtb/Makrophagen-Aggregaten erstellt, das eine in vivo Infektion nachahmt. Bei der Einführung geeigneter Antibiotika wird deren Wirksamkeit mittels Resuzarin-Assay getestet, um das Überleben von Bakterien mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen zu überwachen.

Ein Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen ein Mycobacterium tuberculosis-Infektionsmodell

Dieses Video zeigt einen In-Bouillon-Assay zur Bestimmung der Wirksamkeit von Antibiotika gegen Mycobacterium tuberculosis. Die Bakterienkultur wird mit unterschiedlichen Konzentrationen eines bakteriziden Antibiotikums inkubiert. Die bakterizide Wirksamkeit wird gemessen, indem das Vorhandensein lebensfähiger Bakterien mit einem Resazurin-Assay beurteilt wird.

Bewertung der Wirksamkeit eines Testpräparats gegen Mykobakterien in Brühe

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Das charcoal agar resazurin assay (CARA) ist eine semiquantitative Methode mit mittlerem Durchsatz zur Beurteilung der Aktivität von Testmitteln gegen Mykobakterien, die replizieren, nicht replizieren oder beides.  Der CARA ermöglicht eine schnelle Bewertung der zeit- und konzentrationsabhängigen Aktivität und identifiziert Parameter, die mit Assays für koloniebildende Einheiten (KBE) verfolgt werden sollen.

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Laser Capture Microdissection gepaart mit LC/MS-Analyse, um räumlich-Droge-Verteilungen innerhalb von Lungentuberkulose Granulome zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat breite Anwendbarkeit auf Droge-Konzentrationen in den Geweben an hohe räumliche Details zu quantifizieren.

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Die Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE) ist die Goldstandard-Technik zur Quantifizierung von Bakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis , die Wochen brauchen kann, um sichtbare Kolonien zu bilden. Hier beschreiben wir eine Mikrokbe für die KBE-Bestimmung mit erhöhter Zeiteffizienz, reduziertem Laborplatz und Reagenzienkosten sowie Skalierbarkeit auf Experimente mit mittlerem und hohem Durchsatz.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

In dieser Studie wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Screening gegen Mycobacterium abscessus mit einem kürzlich entwickelten Doppelreporterstamm entwickelt, der Fluoreszenz und Lumineszenz verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll wird für Forscher relevant sein, die neue Medikamente gegen diese arzneimittelresistenten Bakterien untersuchen wollen.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Erfahren Sie die schnelle Gleichgewichtsdialyse zur Vorhersage der Arzneimittelbindung an Caseum bei Tuberkulose-Läsionen. Diese Methode ersetzt Tierversuche und ermöglicht reproduzierbare Daten zur Penetration antimikrobieller Substanzen.

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