Name: Vorbereitung und In Vitro Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Erfahren Sie die nicht-virale microRNA-Lieferung an Endothelzellen mittels PEI/MNP-Vektor für die Zelltherapie. Diese Methode ermöglicht Magnetisierung und verbesserte Zellretention in der regenerativen Medizin.

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Wir möchten, dass beim Erwerb von TEM-Aufnahmen von gefilterten superparamagnetische Nanopartikel und bei der Durchführung ihrer Röntgenanalyse G. Fulda (Elektronenmikroskopie Zentrum, Universität Rostock, Deutschland) für die technische Unterstützung. Die Arbeit an der RTC Rostock durchgeführt wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A, FKZ 316159 und VIP + 03VP00241) und dem Staat Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF / IV-WM-B34- unterstützt 0030/10 und ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) und von der DFG (DA 1296-1), die Damp-Foundation und der deutschen Herz Foundation (F / 01/12). Frank Wiekhorst wurde von dem EU FP7 Forschungsprogramm &quot;Nanomag&quot; FP7-NMP-2013-LARGE-7 unterstützt.

Wir haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.

Die Herstellung von gentechnisch veränderten Zellen, beladen mit superparamagnetische Nanopartikel für ihre weiteren magnetisch gesteuerte Führung wird in dem aktuellen Protokoll dargestellt. Die erfolgreiche Anwendung dieser Strategie ermöglicht die Auflösung einiger Schwierigkeiten der Zelltherapie, wie geringe Retention und schlechte Einpflanzung in dem verletzten Bereich 2, 3, 4, durch ein anzielbare Zellprodukt zur Transpl...

Gen- und Zelltherapie sind leistungsfähige Werkzeuge, die das Potenzial haben, um die aktuellen Herausforderungen in CVD-Behandlung zu lösen. Trotz der Tatsache , dass diese beiden Ansätze derzeit in klinischen Studien getestet werden, sind sie noch nicht bereit für eine breite klinische Anwendung 1. Bemerkenswert ist, ein gemeinsames Konzept für die Herausforderungen der Gen- und Zelltherapie zu bekämpfen ist multifunktional Genabgabevektoren geeignet für die klinische Anwendung zu entwickeln. Der Mangel an sicheren und effizienten Genabgabesysteme ist das Hauptanliegen der Gentherapie. Zur gleichen Zeit, die gentechnische Veränderung von Zellprodukten vor der Transplantation konnte die schweren Herausforderungen der Zelltherapie, wie geringe Effizienz (zB im Herzfeld, nur ca. 5% der funktionellen Verbesserung erreichte nach Stammzelltransplantation überwunden 1 ) und schlechte Retention / Verpflanzung an der Stelle der Verletzung (dh fällt Zellbindung unter von 5 bis 10% innerhalb von Minuten bis Stunden post-Anwendung, unabhängig vom Applikationsweg 2, 3, 4). Bisher überschreiten virale Vektoren stark nicht-virale Systeme in Bezug auf Effizienz, die in ihrer breiteren Anwendung in klinischen Studien (~ 67%) 5 geführt hat. Allerdings trägt virales Vehikel ernsthafte Risiken, wie Immunogenität (und die nachfolgende Entzündungsreaktion mit schweren Komplikationen), Onkogenizität und Einschränkungen in der Größe des durch genetische Material 6. Aufgrund dieser Sicherheitsbedenken und die hohen Kosten der Produktion viraler Vektor, ist die Verwendung von nicht-viralen Systemen bevorzugt in bestimmten Fällen 7, 8. Es ist besonders geeignet für Erkrankungen , die transient genetische Korrektur, wie beispielsweise die Expression von Wachstumsfaktoren erfordern Steuerung der Angiogenese (zB für die CVD - Behandlung) oder die delivery von Impfstoffen. In unserer Gruppe wurde ein Abgabesystem durch die Kombination von verzweigtem 25 kDa-Polyethylenimin (PEI) und superparamagnetische Eisenoxid - Nanopartikel (MNP) miteinander verbunden ist durch Biotin-Streptavidin - Wechselwirkung 9 ausgelegt. Dieser Vektor ist ein mögliches Instrument für die gentechnische Veränderung von Zellen, so dass für ihre gleichzeitige Magnetisierung vor der Transplantation. Letzteres stellt eine Basis für die magnetische Orientierung / Retention, die heutzutage besonders vielversprechend, da die erweiterte Targeting Techniken erfolgreich 10 entwickelt. Zudem 12 die resultierenden magnetisch ansprechenden Zellen , die das Potential haben , nicht-invasiv durch Magnetresonanztomographie (MRI) oder Magnetic Particle Imaging 11, überwacht zu werden. Im Fall des PEI / MNP-Vektor, stellt sicher, Polyamin-Kondensations Nukleinsäure- und somit Schutz vor abbauenden Faktor<html> s, Vektor - Internalisierung in Zellen und endosomalen 5 entkommen. Die MNP ergänzen die Eigenschaften von PEI, nicht nur in Bezug auf die magnetische Orientierung, sondern auch durch die bekannte PEI Toxizität reduzieren 7, 13, 14. Zuvor in Bezug auf die Abgabeeffizienz (dh pDNA und miRNA) und Sicherheits PEI / MNP Vektor Eigenschaften wurden eingestellt durch Fibroblasten und humanen mesenchymalen Stammzellen , 15, 16 verwendet wird . In diesem Manuskript wird ein ausführliches Protokoll zur Anwendung von PEI / MNP zur Erzeugung von miRNA-modifizierten Zellen wird 17 beschrieben. Zu diesem Zweck werden HUVECs verwendet und ein etabliertes Modell für die in - vitro - Angiogenese darstellen. Sie sind schwierig zu transfizieren und sind anfällig für toxische Einflüsse 18, 19,ass = &quot;xref&quot;&gt; 20. Zusätzlich stellen wir einen Algorithmus solche Zellen in vitro zu bewerten, einschließlich ihrer Ausrichtung, die interzelluläre Kommunikation, und MRI - Erkennung.

<table><tbody><tr><td>PEI 25 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>mit Sephadex G-25 Medium</td></tr><tr><td>Ninhydrin Reagenzlösung 2%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7285</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader Modell 680</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere Paramagnetische Partikel</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF Filter</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0,45 &micro; m</td></tr><tr><td>Libra 120 Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Beschleunigungsspannung 120&nbsp; kV</td></tr><tr><td>Saphir-Röntgendetektor</td><td>EDAX-Amatek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Kunststoff</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-31</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 488&nbsp;</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-31</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 miRNA Label IT Kit</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ IV Gibco</td><td>Thermo Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Endotheliales Wachstumsmedium, EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 & CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/ml, 100 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td></td></tr><tr><td>MS MACS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec &nbsp;</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nahinfrarot-Färbekit für lebende/tote Zellen</td><td>Thermo</td><td>Scientific L10119</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Farbstoffmarkierte Pre-miR-Negativkontrolle</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17120</td><td>"Cy3-miR" oder "Cyanin-miR3" im Manuskript</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA-Vorläufermoleküle - Negative Kontrolle&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17110</td><td>"scr-miR" im Manuskript</td></tr><tr><td>Anti-has-miR92a-3p synthetischer Inhibitor&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM10916</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1-System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>4%ige Lösung in PBS</td></tr><tr><td>DAPI-Kernfärbung</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA-Isolationskit</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA-Isolationskit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transkriptionskit</td><td>Thermo</td><td>Scientific 4366596</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochkapazität cDNA Reverse Transkriptionskit</td><td>Thermo Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-92a TaqMan Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>000431</td><td>ausgereifte miRNA-Sequenz: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU</td></tr><tr><td>FastGene Taq Fertigmischung</td><td>Nippon Genetics</td><td>LS27</td><td></td></tr><tr><td>ITGA5 TaqMan Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hs01547673_m1</td><td></td></tr><tr><td>RNU6B TaqMan Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>001093</td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA Endogene Kontrolle</td><td>Thermo Scientific</td><td>4333760F</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Red-Orange</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS Puffer</td><td>Miltenyi Biotec &nbsp;</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>7,1 Tesla MRT-System für Tiere</td><td>Bruker Corporation</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>aufgerüstet mit einem AngiogenesisAnalyzer (NIH)</td></tr><tr><td>MPS-Gerät</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab-Software</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ring Neodym Magnet&nbsp;</td><td>magnets4you GmbH</td><td>RM-10x04x05-G</td><td>&oslash; 10 mm; Remaneszenz beträgt ~ 1,3&nbsp; T, Koerzitivfeldstärke &ge; 955 kA/m</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave Reagenz</td><td>Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>Bandelin electronic</td><td>Typ: RK 100 SH</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung und<em&gt; in vitro</em&gt; charakterisierung von magnetized mir-modifizierten endothelzellen

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Bis heute sind die verfügbaren chirurgischen und pharmakologischen Behandlungen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sind begrenzt und oft palliativ. Zur gleichen Zeit, Gen- und Zelltherapien sind vielversprechende alternative Ansätze für eine CVD-Behandlung. Allerdings ist die breite klinische Anwendung der Gentherapie durch den Mangel an geeigneten Genabgabesysteme stark eingeschränkt. Die Entwicklung geeigneter Genübertragungsvektoren können, eine Lösung für die aktuellen Herausforderungen in der Zelltherapie bereitzustellen. Insbesondere bestehende Nachteile, wie begrenzte Effizienz und niedrige Zelleinlagerungen im Organe verletzt, konnte durch entsprechendes Zell - Engineering (dh genetische) vor der Transplantation überwunden werden. Das dargestellte Protokoll beschreibt die effiziente und sichere vorübergehende Modifikation von Endothelzellen ein Polyethylenimin superparamagnetischen Nanopartikel (PEI / MNP) -basierten Auslieferungsvektor verwendet wird. Außerdem werden der Algorithmus und Methoden zur Zellcharakterisierung definiert. Die erfolgreiche intracelluLAR Lieferung von microRNA (du) in menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) hat, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen, Funktionalität oder die interzelluläre Kommunikation erzielt worden. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz eine starke funktionelle Wirkung in eingeführten exogen ich verursachen unter Beweis gestellt. Wichtig ist, gewährleistet die Anwendung dieser MNP-basierte Vektorzelle Magnetisierung, mit Möglichkeiten des magnetischen Ausrichtung und nicht-invasiven MRI-Tracing begleitet. Dies kann eine Grundlage für die magnetisch geführt wird, gentechnisch hergestellten Zelltherapeutika bereitzustellen, die nicht-invasiv mit MRI überwacht werden kann.

Der Hauptzweck des vorgeschlagenen Protokolls ist magnetisch ansprechende ich-modifizierten Zellen zu erzeugen , und ihre genaue Charakterisierung (Figur 1) zu leiten. Als Ergebnis sollten effizient transfizierten Zellen, die auf magnetische Auswahl und Führung und nachweisbar mit MRI, erhalten werden. Zunächst wird die Identitäten von isolierten HUVECs wurden durch typische Färbung mit dem endothelialen Marke...

Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Technik einzuführen, die eine Zellmodifikation mittels Mikro-RNA und parallel dazu eine Zellmagnetisierung gewährleistet. Diese Methode kann wichtige Herausforderungen im Bereich der regenerativen Medizin bewältigen, beispielsweise die genetische Veränderung von Zellen vor der Transplantation.Neben einer effizienten Zellmodifikation mit Mikro-RNA ermöglichten sie diese auch mit Eisenoxid. Dies kann zur Verbesserung der Zellretention an der gewünschten Stelle durch Anlegen eines Magnetfelds genutzt werden. Die Zelltherapie ist vielversprechend für die Behandlung von Herzerkrankungen, wobei die geringe Zellretention und das Zellüberleben dringend verbessert werden müssen.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Kultur humaner Nabelvenenendothelzellen zur Herstellung von Transfektionskomplexen, wie im Textprotokoll beschrieben. 48 Stunden vor der Transfektion säen Sie die HUVECs in Kunststoff-Zellkulturplatten geeigneter Größe aus. Verwenden Sie dabei eine anfängliche Zelldichte von etwa 13.000 Zellen pro Quadratzentimeter Wachstumsfläche.Bereiten Sie anschließend frische miR/Polycylenimin/Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel frisch zu. Verdünnen Sie zunächst 2,5 Pikomol Micro-RNA pro Quadratzentimeter Zellwachstumsfläche und 5-%-Glucoselösung, um eine Endkonzentration von 0,125 Pikomol Micro-RNA pro Mikroliter zu erhalten. Verdünnen Sie danach das PEI in einem gleichen Volumen 5-%-Glucoselösung.Fügen Sie das verdünnte PEI zur microRNA-Lösung hinzu und wirbeln Sie das erhaltene Gemisch 30 Sekunden lang im Vortex. Inkubieren Sie danach das miR/PEI-Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur. Sonizieren Sie die MNP's mindestens 20 Minuten im Ultraschallbad bei Raumtemperatur.Anschießend die geeignete Menge an MNP-Lösung zur fertigen miR/PEI-Mischung geben. Nach 30 Sekunden Vortexen 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach die vorbereitete miR/PEI/MNP-Mischung tropfenweise direkt in das Kulturmedium auf die Zellen geben.Ersetzen Sie dieses Gemisch sechs Stunden nach der Transfektion durch frisches Kulturmedium. Nach der Analyse der Vektorsicherheit, wie im Textprotokoll beschrieben, bestätigen und charakterisieren Sie die intrazelluläre Lokalisation der Transfektionskomplexe mittels konfokaler Mikroskopie und Super-Auflösungs-Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung. Dazu säen Sie die HUVECs auf Gelatine-beschichteten Glasdeckgläsern aus, die zuvor in die Mulden von 24-Loch-Kulturplatten platziert wurden, wie bereits beschrieben.Transfizieren Sie die Zellen mit dreifach gefärbtem miR/PEI/MNP und inkubieren Sie sie 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit fünf Prozent Kohlendioxid. Waschen Sie die Deckgläser zuerst mit zwei Prozent Rinderserumalbumin und phosphatgepufferter Kochsalzlösung und anschließend nur mit PBS. Fixieren Sie die Zellen durch 15-minütige Inkubation in vier Prozent Paraformaldehyd oder PFA bei 37 Grad Celsius.Waschen Sie mit PBS und färben Sie anschließend die Kerne gemäß Standardprotokollen mit DAPI. Danach waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 15 Minuten auf dem Schüttler mit PBS, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen. Legen Sie die vorbereiteten Deckgläser mit einem geeigneten Einbettmedium auf Objektträger und lassen Sie die Präparate mindestens eine Stunde trocknen, bevor Sie sie für die Mikroskopie verwenden.Erwerben Sie Bilder mithilfe eines 63-fachen Öl-Immersionobjektivs in den im Textprotokoll angegebenen SIM-Einstellungen. Für die Zellzielsteuerung und die simulierte dynamische Bedingungen in vitro transfectieren Sie zunächst die HUVECs in eine 24-Loch-Platte wie zuvor. Nach einer 24-stündigen Inkubation waschen Sie die Zellen.Fügen Sie dann eine Behandlung mit Trypsin in EDTA, verdünnt in PBS, hinzu und inkubieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen sammeln. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 300 × g für 10 Minuten. Mischen Sie das Zellpellet, das aus einem Well stammt, mit einem Milliliter frischem Kulturmedium.Und überführen Sie die Zellen in eine einzelne Vertiefung einer 12-Loch-Platte. Befestigen Sie einen kleinen Magneten lokal mithilfe von Klebeband. Stellen Sie die Kulturplatte auf den Schüttler und inkubieren Sie die Zellsuspension 12 Stunden lang bei 150 U/min, um dynamische Bedingungen zu simulieren.Waschen Sie anschließend die Zellen und fixieren Sie sie mit vierprozentigem PFA. Färben Sie die Kerne mit DAPI. Erfassen Sie die Zelladhäsion mittels Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie mit 405- und 504-nm-Anregungslasern im Z-Stack-Modus, um die Rohdaten zu erhalten.Verwenden Sie die Bildverarbeitung mit Projektion der maximalen Intensität, um Bilder für die Analyse zu erstellen. Für die quantitative Analyse magnetisch responsiver und nicht-responsiver Zellen transfizieren Sie zunächst die HUVECs in einer 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden, bevor Sie sie wie zuvor beschrieben waschen und sammeln.Suspendieren Sie das Zellpellet, das aus jedem Well gewonnen wurde, erneut in 500 Mikrolitern erwärmtem sterilen Zellsortierpuffer. Geben Sie die Zellsuspension auf eine magnetische Sortiersäule, die durch den beigefügten Magneten fixiert ist. Spülen Sie die Säulen dann dreimal am Magneten mit frischem Zellsortierpuffer aus.Sammeln Sie das Durchflussvolumen als die magnetisch nicht ansprechbare Fraktion. Entfernen Sie die Säulen vom Magneten und sammeln Sie unverzüglich die magnetisch ansprechbare Zellfraktion, indem Sie frischen Zellsortierpuffer mit einem Kolben durch die Säule drücken. Zentrifugieren Sie sowohl die Mag- als auch die Mag+-Fraktion bei 300 × g für 10 Minuten.Nachdem das Zellpellet in PBS resuspendiert wurde, zählen Sie die Zellen und bewerten die Zellviabilität mittels Trypanblau-Ausschluss-Assay. Aus Nabelschnüren isoliert, zeichnen sich HUVECs durch die Expression des endothelialen Markers CD31 sowie durch die Bildung von Röhren auf einer Basalmembranmatrix aus. HUVECs, die mit miR/PEI/MNP transfiziert wurden, nehmen alle markierte miR auf.Und ihr Überleben bleibt 24 Stunden nach der Transfektion unverändert. Zusätzlich zeigt die Super-Auflösungsmikroskopie eine paranukleäre Lokalisation von dreifach gefärbten Transfektionskomplexen. Die Toxizität von PEI wird durch die verminderte Funktionalität von miR/PEI-transfizierten Zellen bestätigt.Wichtig ist, dass MNP die Zelleigenschaften wiederherstellt. Hinsichtlich der Röhrenbildung unterscheiden sich die mit miR/PEI/MNP modifizierten Zellen nicht von unbehandelten Zellen. Darüber hinaus behalten diese Zellen die interzelluläre gap-junctionale Kommunikation bei, wie durch die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching gezeigt wurde.Sobald eine Suspension von miR/PEI/MNP-modifizierten Zellen in die Vertiefungen einer Kulturplatte ausgesät wird, die auf einem rotierenden Schüttler steht, neigen die Zellen dazu, in den Bereich der lokalen Magnetanwendung zu wandern und sich dort anzulagern. Abbildungen zeigen repräsentatives Zellwachstum in dem Bereich mit Magnetanwendung. Ohne Magnetanwendung.Und in der Mitte der Kulturmulde, wo die Flüssigkeitsströmung die Zellen konzentrierte. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die Zelltransfektion innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine sehr gute Vorstellung davon haben, wie endotheliale Zellen vorübergehend, aber hochgradig effizient, einschließlich der Magnetisierung, modifiziert werden können.Sowie auch, wie das Zellprodukt endgültig charakterisiert werden kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die angegebenen Zahlen für die Ansiedlungsmengen der Zellen, die Bestandteile zur Herstellung der Transfektionskomplexe, die Inkubationszeit und den Waschschritt nach der Transfektion einzuhalten. Wir sind sehr zuversichtlich, dass dieser Ansatz gut auf andere Zelltypen übertragbar sein wird, um andere betroffene Organe zu behandeln.Mithilfe dieses Verfahrens können In-vivo-Studien mit modifizierten magnetisierten Zellen durchgeführt werden. Diese könnten weitere Fragen beantworten, ob die Eisenanreicherung von Zellen effizient genug ist, um ihre Retention auf der gewünschten Seite sicherzustellen, und auch die Nachweisgrenzen der MRT in vivo definieren.

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Medicine

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Dieses Video zeigt eine Technik zur Aufreinigung von CD31+ endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) aus einer Kultur mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS). Die Zellsuspension wird mit einem Fluorophor-konjugierten Antikörper behandelt, der an CD31 auf den EPCs bindet. Um die Markierung von CD31+ EPCs abzuschließen, müssen ein Antikörperkomplex, der an die Fluorophore bindet, und ein polymerbeschichtetes magnetisches Nanopartikel, das an den Antikörperkomplex bindet, hinzugefügt...

Aufreinigung von CD31+ endothelialen Vorläuferzellen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung

Primäre Zellkultur ist eine nützliche Technik für die Analyse von spezifischen Populationen von Zellen, insbesondere von transgenen Maus-Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien. Hierin werden embryonalen Ventrikel seziert und distanziert, und Antikörper-konjugierten Perlen erkennen und trennen die Endothelzellen für die weitere Analyse.

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Dieses Protokoll wurde erstellt, um unsere Methode zur Isolierung von koronaren Endothelzellen von Mäusen zum Zwecke der Bildgebung oder zur Durchführung molekularbiologischer Experimente zu teilen.

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Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

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Ein magnetabscheidungsunterstütztes Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsverfahren für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Vesikeln

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Vorbereitung und

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