Vorbereitung und In Vitro Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Technik einzuführen, die die Zellmodifikation mit microRNA und gleichzeitig die Zellmagnetisierung gewährleistet. Diese Methode kann zentrale Herausforderungen im Bereich der regenerativen Medizin angehen. Wie zum Beispiel die Gentechnik von Zellen vor der Transplantation.

Neben der effizienten Zellmodifikation mit microRNA ermöglichten sie dies auch mit Eisenoxid. Dies kann verwendet werden, um die Zellretention in der interessierenden Seite durch Magnetfeldanwendung zu verbessern. Die Zelltherapie ist sehr vielversprechend für die Behandlung von Herzerkrankungen, die Hypozellretention und das Überleben der Zellen muss dringend verbessert werden.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer humanen Endothelzellkultur der Nabelschnurvene zur Vorbereitung von Transfektionskomplexen, wie im Textprotokoll beschrieben. 48 Stunden vor der Transfektion säen Sie die HUVECs auf Kunststoff-Zellkultur-Well-Platten geeigneter Größe. Mit einer Ausgangszelldichte von ca. 13.000 Zellen pro Quadratzentimeter Wachstumsfläche.

Bereiten Sie als Nächstes frische miR/Polyethyleneimen/superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel vor. Verdünnen Sie zunächst 2,5 Pikosolen microRNA pro Quadratzentimeter Zellwachstumsoberfläche und fünf Prozent Glukoselösung, um eine Endkonzentration von 0,125 Pikosolen microRNA pro Mikroliter zu erhalten. Als nächstes verdünnen Sie das PEI in einem gleichen Volumen von fünf Prozent Glukoselösung.

Geben Sie das verdünnte PEI in die microRNA-Lösung und wirbeln Sie die erhaltene Mischung 30 Sekunden lang. Dann inkubieren Sie das miR/PEI-Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Beschallen Sie die MNPs mindestens 20 Minuten lang im Beschallungswasserbad bei Raumtemperatur.

Geben Sie dann die entsprechende Menge MNP-Lösung in das fertige miR/PEI-Gemisch. Nach 30 Sekunden Vortexen 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie dann das vorbereitete miR/PEI/MNP-Gemisch tropfenweise direkt in das Kulturmedium auf den Zellen.

Ersetzen Sie diese Mischung sechs Stunden nach der Transfektion durch frisches Kulturmedium. Nach Analyse der Vektorsicherheit, wie im Textprotokoll beschrieben, bestätigen und charakterisieren Sie die intrazelluläre Lokalisation von Transfektionskomplexen durch konfokale und superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie. Säen Sie dazu die HUVECs wie bisher auf gelatinebeschichtete Glasabdeckgläser, die in den Vertiefungen von 24-Well-Kulturplatten platziert werden.

Transfizieren Sie die Zellen mit 3-farbig markierten miR/PEI/MNP und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre, die fünf Prozent Kohlendioxid enthält. Waschen Sie die Deckgläser zuerst mit zwei Prozent Rinderserumalbumin und phosphatgepufferter Kochsalzlösung und dann nur mit PBS. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 15 Minuten lang in vier Prozent Paraformaldehyd oder PFA bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Waschen Sie mit PBS und färben Sie die Zellkerne dann mit DAPI gemäß den Standardprotokollen. Waschen Sie dann die Zellen dreimal 15 Minuten mit PBS auf dem Shaker, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Legen Sie die vorbereiteten Deckgläser mit geeignetem Eindeckmedium auf Objektträger und lassen Sie die Objektträger mindestens eine Stunde trocknen, bevor Sie sie für die Mikroskopie verwenden.

Nehmen Sie Bilder mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv in den SIM-Einstellungen im Textprotokoll auf. Für das Zell-Targeting und simulierte dynamische Bedingungen in vitro transfizieren Sie die HUVECs zunächst wie bisher in eine 24-Well-Platte. Nachdem Sie sie 24 Stunden lang inkubiert haben, waschen Sie die Zellen.

Fügen Sie dann einen x Trips in EDTA hinzu, verdünnt in PBS, und inkubieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen sammeln. Die gesammelten Zellen werden bei 300 mal G 10 Minuten lang zentrifugiert. Mischen Sie das aus einer Vertiefung gewonnene Zellpellet mit einem Milliliter frischem Nährmedium.

Und übertragen Sie die Zellen in eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte. Befestigen Sie einen kleinen Magneten lokal mit Klebeband. Legen Sie die Kulturplatte auf den Schüttler und inkubieren Sie die Zellsuspension 12 Stunden lang bei 150 U/min, um dynamische Bedingungen zu simulieren.

Waschen Sie dann die Zellen und fixieren Sie sie mit vier Prozent PFA. Färben Sie die Zellkerne mit DAPI. Erfassen Sie die Zellanhaftung mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie mit 405 und 504 Zehn-Nanometer-Anregungslasern im Z-Stack-Modus, um die Rohdaten zu erhalten.

Verwenden Sie die Bildverarbeitung mit maximaler Intensität, um Bilder für die Analyse zu erstellen. Für die quantitative Analyse von magnetisch ansprechenden und nicht responsiven Zellen transfizieren Sie die HUVECs zunächst in einer 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang, bevor Sie die Zellen wie zuvor beschrieben waschen und sammeln.

Suspendieren Sie das aus jeder Vertiefung erhaltene Zellpellet mit 500 Mikrolitern erwärmtem sterilen Zellsortierpuffer. Tragen Sie die Zellsuspension auf eine magnetische Sortiersäule auf, die mit dem mitgelieferten Magneten befestigt ist. Waschen Sie dann die Säulen auf dem Magneten dreimal mit frischem Zellsortierpuffer.

Erfassen Sie den Durchfluss als magnetisch nicht reagierende Fraktion. Entfernen Sie die Säulen vom Magneten und sammeln Sie sofort die magnetisch ansprechende Zellfraktion, indem Sie mit einem Kolben frischen Zellsortierpuffer in die Säule schieben. Sowohl Mag- als auch Mag+-Fraktionen werden 10 Minuten lang bei 300-facher G zentrifugiert.

Nach der erneuten Suspendierung des Zellpellets in PBS werden die Zellen gezählt und die Zellviabilität mit einem Trypanblau-Ausschlussassay bewertet. Aus Nabelschnüren isoliert, zeichnen sich HUVECs durch die Expression des Endothelmarkers CD31 und durch die Bildung von Röhren auf einer Basalmembranmatrix aus. HUVECs, die mit miR/PEI/MNP transfiziert wurden, nehmen alle markierte miR auf.

Und ihr Überleben bleibt 24 Stunden nach der Transfektion unbeeinflusst. Darüber hinaus zeigt die superauflösende Mikroskopie eine paranukleäre Lokalisation von 3-farbig markierten Transfektionskomplexen. Die PEI-Toxizität wird durch die verminderte Funktionalität von miR/PEI-transfizierten Zellen bestätigt.

Wichtig ist, dass MNP die Zelleigenschaften wiederherstellt. miR/PEI/MNP-modifizierte Zellen unterscheiden sich nicht von unbehandelten Zellen in Bezug auf die Röhrenbildung. Darüber hinaus halten diese Zellen die interzelluläre Gap-Junctional-Kommunikation aufrecht, wie die Fluoreszenzwiederherstellung nach dem Photobleaching zeigt.

Sobald eine Suspension von miR/PEI/MNP-modifizierten Zellen in die Vertiefungen einer Kulturplatte ausgesät wird, die auf dem rotierenden Schüttler platziert wird, neigen die Zellen dazu, zu migrieren und sich im Bereich der lokalen Magnetanwendung anzuheften. Repräsentative Bilder zeigen das Zellwachstum in dem Bereich mit Magnetanwendung. Ohne Magnetanwendung.

Und in der Mitte der Kulturvertiefung, wo der Flüssigkeitsfluss die Zellen konzentrierte. Einmal gemeistert, kann die Zelltransfektion in zwei Stunden durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie einen sehr guten Eindruck davon haben, wie man Endothelzellen einschließlich der Magnetisierung transient, aber hocheffizient modifizieren kann.

Und auch, wie man das Zellprodukt abschließend charakterisiert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die angegebenen Zahlen für die Zellaussaatmengen von Komponenten für die Vorbereitung von Transfektionskomplexen, die Inkubationszeit und den Waschschritt nach der Transfektion zu befolgen. Wir sind sehr optimistisch, dass dieser Ansatz gut auf andere Zelltypen übertragbar sein wird, um andere betroffene Organe zu behandeln.

Nach diesem Verfahren können in vivo Studien mit modifizierten magnetisierten Zellen durchgeführt werden. Sie könnten zusätzliche Fragen beantworten, ob die Eisenbeladung von Zellen effizient ist, um ihren Verbleib in der interessierenden Seite zu gewährleisten. Und auch, um die Grenzen des Nachweises mit MRT in vivo zu definieren.