Neuartige Assay für kalte Nozizeption in Drosophila Larvae

Das übergeordnete Ziel dieses Assays für schädliche Kälte ist es, Veränderungen beim Nachweis von harmloser zu schädlicher Kälte quantifizieren und beurteilen zu können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Nozizeption zu beantworten, einschließlich der Erleichterung der Identifizierung neuartiger, konservierter, kalter Nozizeptionsgene und Modulatoren von Schmerzreaktionen bei Krankheiten und/oder Verletzungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine präzise Manipulation des schädlichen Kältestimulus und die Quantifizierung der durch Kälte hervorgerufenen Reaktionen über eine Vielzahl von Umwelt- und genetischen Kontexten ermöglicht.

Im Allgemeinen müssen Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, die konsequente Anwendung der Sonde üben, bevor sie mit einem Experiment beginnen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir herausfanden, dass Drosophila-Larven auf schädliche Hitze reagieren, und wir wurden neugierig, ob sie das Gleiche mit schädlicher Kälte tun. Züchten Sie Bestände oder genetische Kreuzungen von Drosophila in einem 25 Grad Celsius heißen Inkubator.

Beachten Sie, dass bei der Kultivierung einer Kreuzung 20 bis 25 jungfräuliche Weibchen und 15 bis 20 Männchen pro Fläschchen mit normalem Maismehlfliegenmedium und -kultur für etwa 48 Stunden verwendet werden sollten, bevor Sie die Fliegen in ein neues Fläschchen mit Futter umfüllen. Fünf Tage nach dem Start der Kultur sammelten Sie dritte Larven des gewünschten Genotyps, indem Sie vorsichtig einen Wasserstrahl in das matschige Futter und die Larven spritzten. Gießen Sie dann den Inhalt in eine mittelgroße, saubere Petrischale.

Sortieren Sie anschließend die Larven vorsichtig nach Größe und schließen Sie mit einer Pinzette aus, dass größere, wandernde Larven des dritten Stadiums oder kleine, kränkliche Larven getestet werden. Entsorgen Sie Larven, die unerwünschte genetische Marker oder Balancer enthalten. Lassen Sie ein anderes Labormitglied die Behälter beschriften, in denen sortierte Larven platziert werden, um den Experimentator für den Versuchszustand oder den Genotyp der Larven blind zu halten.

Verwenden Sie eine Scoopula, um eine kleine Menge frischer Lebensmittel in eine sauber etikettierte Petrischalen zu geben, die zur Hälfte mit Wasser bei Raumtemperatur gefüllt ist. Verwenden Sie abschließend eine Pinzette, um die sortierten Larven vorsichtig auf das Futter zu bringen, um Hunger oder Austrocknung zu verhindern, wenn der Test voraussichtlich länger als 20 Minuten dauern wird. Schalten Sie zunächst die Kältesondeneinheit ein und lassen Sie sie einige Minuten auf die gewünschte Temperatur abkühlen.

Wischen Sie überschüssige Feuchtigkeit auf der Sonde mit einem Labortuch ab. Wenn Sie die Sonde nicht sofort verwenden, setzen Sie eine Isolierkappe auf, um die Spitze zu isolieren und sauber zu halten und Schäden zu vermeiden. Legen Sie als Nächstes eine Larve aus dem mittleren Drittel auf ein dünnes Stück dunkles, bewegliches Vinyl, um die Kontrastvisualisierung und Ausrichtung der Sonde zu erleichtern.

Lege dann dieses Stück Vinyl mit der Larve unter ein Hellfeldmikroskop. Stellen Sie das Mikroskop und die Lichteinheit auf mittlere Helligkeit ein, um einen Kontrast zu erzielen und ein zu schnelles Austrocknen der Larve zu verhindern. Stellen Sie mit einem feuchten Pinsel sicher, dass die Larve vom Petrischalenwasser feucht ist, damit sie nicht am Vinyl kleben bleibt, und entfernen Sie überschüssiges Wasser, das sie umgibt, mit einem KimWipe.

Schieben Sie die Sonde mit der Hand in einem 90-Grad-Winkel zur anteroposterioren Körperachse in Richtung der Larve und bewegen Sie die Larve mit dem Vinyl in die richtige Position. Richten Sie die Spitze der Sonde so aus, dass sie sanft über die mittlere dorsale Oberfläche der Larve liegt, wobei die Sonde in einem Winkel von etwa 45 Grad zum Mikroskoptisch liegt. Starten Sie bei Sondenkontakt einen Timer.

Üben Sie genügend Druck nach unten aus, um die Oberfläche der Kutikula der Larve leicht einzudrücken, während Sie immer noch eine Vorwärts- oder Rückwärtsbewegung zulassen. Halten Sie die Sonde anschließend bis zu 10 Sekunden lang an Ort und Stelle oder bis eine durch Kälte hervorgerufene Verhaltensreaktion beobachtet wird, je nachdem, was zuerst eintritt. Entfernen Sie dann die Sonde.

Zeichnen Sie die beobachtete Verhaltensreaktion und die Latenz der Antwort auf. Achten Sie auf Non-Responder oder Larven, die nicht innerhalb von 10 Sekunden reagieren. Zum Schluss die Larve entsorgen und die nächste vorbereiten.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Testlarven erreicht ist. Nach dem Kontakt mit der Kältesonde deuten die Ergebnisse dieses Experiments darauf hin, dass die Larven mit den folgenden kälteevozierten Verhaltensweisen reagieren: Sie knirschen ihre vorderen und hinteren Segmente in einer Kontraktion zur Körpermitte hin, CT, heben ihre vorderen und hinteren Segmente in die Luft, um eine U-Form zu bilden, US, wobei nur die hinteren Segmente in die Luft gehoben werden, ÖFFENTLICHKEITSARBEIT. Darüber hinaus erreichen unterschiedliche Verhaltensweisen in unterschiedlichen Kältebereichen ihren Höhepunkt, so dass PR und US bei drei bis acht Grad Celsius ihren Höhepunkt erreichen, während CT bei neun bis 14 Grad Celsius ihren Höhepunkt erreicht. Beim Vergleich der Latenzen der verschiedenen Kälteverhaltensweisen zeigen diese Daten, dass sich die CT-Reaktionen signifikant von PR und US bei drei Grad Celsius und 10 Grad Celsius und von US bei 20 Grad Celsius unterschieden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 30 bis 40 Minuten für einen Satz von 30 Larven abgeschlossen werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich der abnormalen Fortbewegung, des Feuchtigkeitsgehalts der Larve sowie des Drucks und der Platzierung der Kältesonde auf der Larve bewusst zu sein. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine unsachgemäße Anwendung der Kältesonde zu unterschiedlichen Dosis-Wirkungs-Kurven oder einem Mangel an Kältereaktionsverhalten führen kann.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Fluoreszenzlicht-Bildgebung, Genexpressionsanalyse und Verhaltensassays verwendet werden. Alle werden bestimmen, wie sich Kälteeinwirkung auf die zelluläre Aktivität, Morphologie, Genexpression oder andere Verhaltensweisen auswirkt. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der kalten Nozizeption den Weg, um die genetischen, umweltbedingten und krankheitsbedingten Auswirkungen bei Drosophila zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Tool und den Assay für kalte Sonden verwenden, um kälteevozierte Reaktionen zu analysieren und die zellulären und genetischen Mechanismen der kalten Nozizeption zu verstehen.