Rekombinante Protein Expression, Kristallisation und biophysikalische Studien von a Bacillus -konservierte Nucleotid-Pyrophosphorylase, BcMazG

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, rekombinante Proteine aus nicht-pathogenen Bakterien herzustellen, um biophysikalisch-chemische Studien wie das Protein, Röntgenkristallographie oder enzymatische Kinetik zu ermöglichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu beantworten, wie rekombinante Proteine von Interesse unter Verwendung nicht-pathogener Bakterien für die vorläufige biophysikalische Charakterisierung hergestellt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die biophysikalische Charakterisierung von Proteinen von Interesse in jedem Labor durchgeführt werden kann, das mit gängigen Instrumenten wie Zellkulturinkubatoren und Spektralphotometern ausgestattet ist.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Ligationsreaktion vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Pipettieren Sie drei Mikroliter der vorbereiteten Ligationsreaktion in ein Röhrchen mit 50 Mikrolitern chemisch kompetenter E.coli DH5-alpha-Zellen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette.

Die Lösung 30 Minuten lang auf Eis stellen. Anschließend einen Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 Grad Celsius. Fügen Sie danach einen Milliliter LB-Medium hinzu und züchten Sie die Zellen unter kräftigem Schütteln bei 250 Umdrehungen pro Minute, bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten.

Verteilen Sie 100 Mikroliter transformierter Zellen auf eine LB-Schneckenplatte, die mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin ergänzt wird. Inkubieren Sie 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie mit einer sterilen Spitze die Kolonien von der Platte.

Züchten Sie die Zellen in drei Millilitern supplementiertem LB-Medium unter kräftigem Schütteln bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 18 Grad Celsius für 18 Stunden. Bereiten Sie dann die Plasma-DNA vor und bestätigen Sie die Nukleotidsequenz, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der Retransformation des E.coli BL21-Stammes wählen Sie eine Kolonie mit einer sterilen Spitze aus und inokulieren Sie 10 Milliliter LB-Medium mit 150 Mikrogramm Kanamycin pro Milliliter.

Inkubieren Sie 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln mit 250 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie als Nächstes die 10 Milliliter der Übernachtkultur auf einen Liter LB und Kanamycin-Medium. Wachsen Sie bei 37 Grad Celsius, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,7 erreicht.

Tauchen Sie die Kultur dann 15 Minuten lang in eiskaltes Wasser. Geben Sie IPTG in die Kultur, so dass die Endkonzentration ein Millimolar beträgt. Inkubieren Sie bei 18 Grad Celsius für weitere 16 bis 18 Stunden.

Danach zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 5.000 mal G. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern PBS, die 10 millimolare Imidazol enthalten.

Als nächstes lysieren Sie die Zellen zweimal auf Eis, wie im Textprotokoll beschrieben. Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 25.000 Mal G, um das Zelllysat zu reinigen. Mischen Sie dann drei Milliliter Nickelkügelchen und 47 Milliliter PBS mit 10 Millimolarem Imidazol in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen.

Schwerkraftströmung: der zusätzliche Puffer zum Absetzen der äquilibrierten Kügelchen in einer 2,5 x 10 Zentimeter großen Glaschromatographiesäule. Übertragen Sie den Überstand mit einer Pipette auf die Säule. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem sich drehenden Rad mit 20 Umdrehungen pro Minute.

Lassen Sie danach den Überstand durch die Schwerkraft abfließen. Waschen Sie die Nickelkügelchen dreimal mit 100 Millilitern PBS mit 10 Millimolar Imidazol pro Wäsche. Tragen Sie dann fünf Milliliter PBS mit 250 millimolarem Imidazol auf, um das Protein RBC 1531 zu eluieren.

Analysieren Sie 15 Mikroliter der Elution über SDS Page, wie im Textprotokoll beschrieben. Pipettieren Sie die gesammelten Fraktionen in ein Dialyseröhrchen. Legen Sie das Röhrchen über Nacht in ein Becherglas mit vier Litern Thrombinspaltungspuffer, der vier Grad Celsius beträgt.

Am nächsten Tag übertragen Sie die Fraktionen mit einer Pipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Messen Sie die Extinktion bei 280 Nanometern, um die Proteinkonzentration abzuschätzen, wie im Textprotokoll beschrieben. Übertragen Sie als nächstes 50 Mikroliter des Proteins RBC 1531 in mehrere Röhrchen.

Geben Sie eine unterschiedliche Menge Thrombin in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Nachdem Sie die geringste benötigte Menge an Thrombin bestimmt haben, geben Sie 10 Milligramm Protein und 60 Einheiten Thrombin in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Drei Stunden lang bei 20 Grad Celsius inkubieren.

Übertragen Sie anschließend das durch Thrombin verdaute Protein in ein Zentrifugalfilterröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 3.000 G bei vier Grad Celsius, um das Volumen auf weniger als fünf Milliliter zu reduzieren. Danach wird das konzentrierte Protein auf eine vorbereitete Größenausschlusschromatographiesäule aufgetragen.

Sammeln Sie 60 Elufraktionen mit 0,5 Millilitern pro Röhrchen. Führen Sie 15 Mikroliter jeder Fraktion auf einem 15%igen SDS-Seitengel aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Kombinieren Sie dann die Fraktionen, die das Protein RBC 1531 enthalten.

Zu Beginn werden die kombinierten Fraktionen in ein Zentrifugalfilterrohr überführt. Zentrifugieren Sie bei 3.000 G bei vier Grad Celsius, um das Protein auf etwa 18,5 Milligramm pro Milliliter zu konzentrieren. Geben Sie als Nächstes 50 Mikroliter jeder Kristallisationssieblösung in die Vertiefungen einer 96 Vertiefungen fassenden Tropfkristallisationsplatte.

Geben Sie 0,5 Mikroliter der konzentrierten Proteinlösung auf ein Sitzbett. Mischen Sie die Proteinlösung separat mit 0,5 Mikrolitern der Well-Lösung. Decken Sie die Platte mit klarer Klebefolie ab.

Inkubieren Sie bei 18 Grad Celsius und lassen Sie die Dampfdiffusion zu. Scannen Sie die Tropfen mit einem Lichtmikroskop mit 20- bis 40-facher Vergrößerung, um die Kristallbildung zwei bis drei Wochen lang täglich zu überwachen. Nach der Vorbereitung der NTP-Substrate geben Sie jedes Substrat auf eine 96-Well-Platte.

Geben Sie 20 Mikrogramm des Proteins RBC 1531 mit einer Pipette in jede Vertiefung, um es zu mischen. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Platte danach für 15 Minuten in ein 70 Grad Celsius heißes Wasserbad, um die durch RBC 1531 vermittelten katalytischen Reaktionen zu stoppen.

Geben Sie anschließend einen Mikroliter anorganische Pyrophosphatase S. cerevisiae in jede Vertiefung. Bei 20 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren. Geben Sie dann 16 Mikroliter Molybdatsäurelösung auf die Reaktionsplatte, um die Farbe zu entwickeln.

Nach 15 Minuten lesen Sie die optische Dichte bei 690 Nanometern ab. In dieser Arbeit wird das Proteinprodukt des B-ernsten BC1531-Gens auf molekularer Ebene charakterisiert. Nach der Aufreinigung mittels Nickel-Affinitätschromatographie wird ein Thrombinaufschluss durchgeführt.

0,3 Einheiten Thrombin gelten als die niedrigste Menge, die erforderlich ist, um das Affinitäts-Tag von RBC 1531 vollständig zu entfernen. Nach der Verdauung wird das tag-freie Protein mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie auf eine Reinheit von etwa 99 % aufgereinigt. Anschließend wird der oligomere Status durch Größenausschlusschromatographie geschätzt.

Da RBC 1531 bei etwa 84 Millilitern eluiert wird, wird sein Molekulargewicht auf 55 Kilodalton geschätzt. Das berechnete Molekulargewicht des Monomers beträgt etwa 13 Kilodalton. Daher assembliert RBC 1531 als Tetramer.

Das Kristallisationsscreening wird dann mit einem sitzenden Tropfendampfdiffusionsverfahren durchgeführt. Kristalle sind nach zwei Tagen mit einem molaren Natriumcitrat und 20% Polyethylenglykol 3.000 und mit 0,1 molaren Natriumcacodylat und einem molaren Natriumcitrat zu sehen. Danach wird die NTPase-Aktivität bestimmt.

Nach Zugabe von Molybdat zur RBC 1531-vermittelten Hydrolysereaktion ist keine sichtbare Farbänderung zu beobachten. Wenn jedoch Pyrophosphatase hinzugefügt wird, ändert sich die Farbe in ein tiefes Blau. Die optische Dichte bei 690 Nanometern und die NTP-Konzentration werden dann mit Hilfe der nichtlinearen Regression analysiert.

Das Enzym RBC 1531 hat eine maximale Geschwindigkeit von 0,75 und eine Michaelis-Konstante von 10 Mikromolaren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Proteinproben unverzüglich vorzubereiten und Fraktionen zu verwerfen, die Verunreinigungen enthalten, die die Proteinkristallisation behindern oder Fehler in enzymatischen Assays verursachen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Enzymologie und anderer Proteinwissenschaften, um Proteine von Interesse mit Spektralphotometern zu charakterisieren, die in den meisten Labors dekoriert sind.

Obwohl diese Methode einen Einblick in allgemeine Ideen der rekombinanten Proteinpräparation, der Kristallisationsscreenings und der enzymatischen Kinetik geben kann, kann sie auch auf die biophysikalisch-chemische Analyse anderer Proteine von unserem Interesse angewendet werden. Vergessen Sie nicht, vorsichtig zu sein, wenn Sie mit Proteinen arbeiten, da diese extrem instabil sein können. Vorsichtsmaßnahmen wie das Belassen von Proben über dem Eis und das Kühlen bei 80 Grad für die Langzeitlagerung sind wünschenswert.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man rekombinantes Protein aus nicht-pathogenen Bakterien präpariert, um Proteinkristalle für eine Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie zu erhalten, und wie man die enzymatische Aktivität mit einer kolorimetrischen Methode charakterisiert.