2.8: Trennen von Gemischen durch Ausfällung

1. die Ausfällung von CaCO₃

1. 5 mL 1 M CaCl₂vorbereiten.
2. 5 mL 1 M Na₂CO₃vorbereiten.
3. Dazugeben Sie in einem kleinen Zentrifugenröhrchen (1,5 mL) 750 µL CaCl₂ 750 µL Na₂CO₃.
4. Warten Sie 2 Minuten für die Reaktion auftreten. Die Lösung sollte bewölkt drehen.
5. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 10.000 × g für 5 min.
6. Den Überstand abgießen.
7. Das Pellet 1 mL kaltes Wasser hinzufügen.
8. Aufschwemmen der Pellets durch das Mischen in einem Vortex-Mixer für 10 s.
9. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 10.000 × g für 5 min.
10. Den Überstand abgießen.

(2) Niederschlag der Milchproteine

1. Gießen Sie die Milch in ein Becherglas und fügen Sie eine Bar unter Rühren hinzu.
2. Warme Milch vorsichtig bis 40 ° C in einer mitreißenden Heizplatte. Nicht über 40 ° c erhitzen
3. Bereiten Sie eine 15 % (V/V) von Essigsäure durch 7,5 mL Essigsäure mischen und verdünnen in genügend Wasser, 50 mL zu erreichen.
4. Tauchen Sie die Elektrode ein pH-Meter in warmer Milch, und überwachen Sie den pH-Wert.
5. Die Essigsäure tropfenweise die Milch fügen Sie bis ein pH-Wert von 4,6 erreicht ist hinzu.
6. Filtration von Milch
   1. Ein Stück Filterpapier Querflöte und legen Sie sie in einen Trichter.
   2. Setzen Sie den Trichter in eine Flasche und die gesäuerte Milch-Gemisch in den Trichter.
   3. Da die Lösung gegossen wird, kann das Filterpapier verstopft. Mit einem Rührstäbchen, Regen Sie die Lösung und Filterpapier gelegentlich auf die Sprünge zu helfen. Wenn es im Laufe der Lösung nicht bessert, ändern Sie das Filterpapier.
   4. Legen Sie ein neues Filterpapier auf die Benchtop und den Transfer so viel Nässe fest, um das neue Filterpapier. Dies sollte mehr Wasseraufnahme aus dem vollen.
   5. Wenn das neue Filterpapier zu nass wird, weiterhin es ändern, bis es minimale Menge von Nässe auf dem Filterpapier gibt. Drücken Sie es leicht, mehr Wasser zu absorbieren, wenn nötig.
   6. Nehmen Sie die getrockneten Feststoff und wieder auszusetzen, in etwa 70 % Ethanol. Filtern Sie die wieder Schritte 2.6.1 auf 2.6.5 Solid.
7. Zentrifugieren der Milch (als Alternative zur Filtration)
   1. Übertragen Sie 50 mL Portionen des Gemisches auf 50 mL Zentrifuge Rohre.
   2. Bei 4.500 × g für 10 min Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie des Überstandes.
   3. Das Pellet 50 mL 70 % igem Ethanol hinzufügen.
   4. Mit einem Rührstäbchen, Aufschwemmen der Pellets in das Ethanol.
   5. Zentrifugieren Sie diese Aussetzung nach Schritt 2.7.2.
8. Das Pellet in Puffer für weitere Analysen wie SDS-PAGE Aufschwemmen, ansonsten bei 4 ° c lagern

(3) Rekristallisation des KCl

1. Gewicht von 50 g KCl in einen Erlenmeyerkolben und 100 mL Wasser hinzufügen
2. Erhitzen Sie die Mischung, bis Wasser kocht. Sicherstellen Sie, dass alle KCl Pulver aufgelöst hat. Einige Verunreinigungen dürfen nicht in Wasser auflösen.
3. Erhitzen Sie einen anderen (leeren) Erlenmeyerkolben zusammen mit der Mischung und halten Sie sehr warm.
4. Setzen Sie einen Trichter mit Filterpapier in die warme, leere Flasche.
5. Gießen Sie die Lösung durch das Filterpapier, ungelöste Verunreinigungen zu entfernen. Der Auffangkolben wird warmgehalten, um sicherzustellen, dass keine Temperaturschwankungen während der Filtration, die sonst auftreten, die ein grober Niederschlag bilden wird. In diesem Fall erneut erhitzen Sie die Mischung, bis der Niederschlag löst sich.
6. Nehmen Sie die Flasche mit der Lösung vom Herd.
7. Bewahren Sie es an einem kühlen Ort im Raum und lassen Sie ihn abkühlen langsam für etwa 30 Minuten, oder bis es keine mehr warm an.
8. Sobald auf Raumtemperatur abgekühlt ist, legen Sie die Flasche in ein Eisbad, weiter senken die Temperatur. Alternativ kann man die Flasche in den Kühlschrank oder einem temperierten Raum bei 4 ° c verlassen
9. Kristalle können durch Filtern wie in Schritt 3.4-3.5 geerntet werden (verwenden Sie eine Flasche und Trichter bei Raumtemperatur).

Die Fällung ist eine Technik, mit der ein Gemisch auf der Grundlage der Löslichkeit seiner Bestandteile getrennt wird. Die Löslichkeit einer Verbindung hängt von der Ionenstärke der Lösung, ihrem pH-Wert und ihrer Temperatur ab. Die Manipulation dieser Faktoren kann dazu führen, dass eine Verbindung zu einem unlöslichen Feststoff wird und aus der Lösung fällt. Dies wird als Niederschlag bezeichnet.

Der unlösliche Feststoff, der Niederschlag, bildet zunächst eine Suspension, was bedeutet, dass er in Lösung gut dispergiert ist. Der Niederschlag agglomeriert typischerweise und wird dann durch Sedimentation, Zentrifugation oder Filtration von der Flüssigkeit getrennt. In diesem Video werden verschiedene Methoden zur Trennung von Verbindungen durch Fällung vorgestellt und ein Verfahren im Labor demonstriert.

Eine gelöste Verbindung kann durch Einbringen eines Gegenions aus der Lösung ausgefällt werden. So kann z.B. Silber bei der Reaktion zwischen Silbernitrat und Natriumchlorid aus der Lösung ausgefällt werden. Das Nitration wird durch ein Gegenion, das Chlorid, ersetzt, wodurch festes Silberchlorid entsteht.

Auch die Erhöhung der Salzkonzentration einer Lösung kann zu Ausfällungen führen. Diese Technik, die als Aussalzen bezeichnet wird, ist für die Isolierung von Proteinen üblich. Bei hoher Salzkonzentration werden Wassermoleküle stärker vom gelösten Salz angezogen, so dass weniger übrig bleibt, um das Protein zu stabilisieren. Dadurch aggregieren sich die Eiweißmoleküle und bilden einen Feststoff.

Niederschlag kann auch durch eine Änderung des pH-Werts verursacht werden. Bei hohem und niedrigem pH-Wert wird das Protein geladen und von der polaren Lösung angezogen. Ab einem bestimmten Punkt wird die Nettoladung einer Verbindung zu Null. Dies ist der isoelektrische Punkt oder pI. Die Verbindung ist nicht in der Lage, mit der polaren Lösung zu interagieren, wodurch sie aggregiert und ausfällt.

Die Temperatur beeinflusst auch die Löslichkeit, da eine höhere Temperatur die Löslichkeit von Feststoffen erhöht. Durch Sinken der Temperatur können gelöste Verbindungen wieder erstarren. Die Geschwindigkeit der Feststoffbildung bestimmt die relative Reinheit.

In den folgenden Experimenten wird die Fällung des Proteins Kasein aus Milch unter Verwendung des pH-Werts und die weitere Trennung durch Filtrations- und Zentrifugationsmethoden demonstriert.

Um diesen Vorgang zu starten, geben Sie 250 ml Milch in ein Becherglas mit einem Rührstab. Erwärmen Sie die Milch vorsichtig auf 40 ? C auf eine Rührplatte legen. Tauchen Sie ein pH-Messgerät in die warme Milch und überwachen Sie den pH-Wert. Essigsäure tropfenweise zur Milch geben, bis der pH-Wert den isoelektrischen Punkt des Kasein (4,6) erreicht. Unlösliche Milchproteine oder Quark fallen am isoelektrischen Punkt aus der Lösung aus. Entfernen Sie den Käsebruch durch Filtration aus der Lösung. Wenn das Filterpapier verstopft ist, mischen Sie es mit einem Spatel, damit die Lösung durchläuft. Wenn dies die Filtration nicht verbessert, wechseln Sie das Filterpapier. Übertragen Sie den nassen Feststoff aus dem verstopften Filterpapier auf neues Filterpapier. Dadurch sollte mehr Flüssigkeit oder Molke aus dem Feststoff aufgenommen werden. Wechseln Sie das Filterpapier weiter, bis es nur noch minimal nass ist. Leichtes Drücken auf die Feststoffe kann dazu beitragen, dass das Filterpapier mehr Molke aufnimmt.

Suspendieren Sie die getrockneten Milchfeststoffe wieder in 70%igem Ethanol, um die Phospholipide aus dem Käsebruch auszuwaschen, und wiederholen Sie dann den Filtrationsvorgang. Alternativ zur Filtration können Proteinfeststoffe auch durch Zentrifugation abgetrennt werden. 50 ml Portionen der Milchmischung zentrifugieren und den Überstand dekantieren. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 50 ml 70%igem Ethanol, um die Phospholipide aus dem Käsebruch zu entfernen, und wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang.

Die Milchproteinfeststoffe können dann gelagert oder zur weiteren Analyse in einer anderen Lösung, wie z. B. SDS-PAGE, resuspendiert werden. Weitere Informationen finden Sie in unserem Video zu dieser Technik. Die SDS-PAGE-Analyse zeigt, dass die Ausfällung die Entfernung der meisten Verunreinigungen aus der Molke ermöglichte. Das gesamte Kasein wurde im Pellet gefunden, während im Überstand nichts gefunden wurde.

Die Fällung ist eine häufig verwendete Technik, die zur Trennung einer Vielzahl von Gemischen oder Lösungen angewendet werden kann.

Verbindungen können aus einer Lösung unter Verwendung eines Gegenions ausgefällt werden, wie in diesem Beispiel der Ausfällung von Calciumcarbonat.

Calciumchlorid und Natriumcarbonat sind beide in der wässrigen Phase löslich.

Beim Mischen bilden das Kalzium und das Karbonat einen unlöslichen Feststoff, der durch Zentrifugation abgetrennt werden kann. Weitere Informationen zu diesem Thema finden Sie in unserem Schulungsvideo zu Löslichkeitsregeln.

Die Fällung kann bei der Aufbereitung von nanoskaligen Feststoffen eingesetzt werden, die in einer Vielzahl von Anwendungen in der Nanotechnologie zu finden sind. In diesem Beispiel wurden nanoskalige Seeds verwendet, um das Wachstum von Nanokristallen zu kontrollieren.

Die Vorläufer wurden erhitzt, mit Trioctylphosphinselenid reagiert und dann schnell abgekühlt. Der abgekühlten Lösung wurde Methanol zugesetzt, um die Feststoffe auszufällen. Die Kristalle wurden dann durch Zentrifugation zurückgewonnen und die Kristallstruktur mit Röntgenbeugung analysiert.

Die Fällung kann auch bei der Herstellung von polymeren Liganden für Anwendungen zur Wirkstoffverabreichung verwendet werden. In diesem Beispiel wird ein Ligand synthetisiert und an Platin konjugiert, um ihn als Krebstherapie zu verwenden. Zunächst wurde der Ligand mit Hilfe einer Amidkupplungsreaktion synthetisiert. Es fiel im Laufe der Reaktion aus. Anschließend wurde es durch Filtration zurückgewonnen.

Anschließend wurde der Feststoff durch Rekristallisation gereinigt und erneut filtriert. Der Ligand wurde dann mit der Platinverbindung komplexiert, getrocknet und dann durch fraktionierte Fällung aus Wasser mit Aceton gereinigt. Die Platin-Kopplung wurde mit Hilfe der Kernspinresonanzspektroskopie bestätigt. Die Verbindungen könnten dann auf ihre Wirksamkeit und Nebenwirkungen als Krebsmittel untersucht werden.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Trennung von Gemischen durch Fällung gesehen. Sie sollten nun die verschiedenen Methoden der Fällung verstehen und wissen, wie Sie diese Experimente im Labor durchführen können.

Danke fürs Zuschauen!