Name: Errichtung eines klinischen Biorepositorys (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie klinisches Personal kutane Tumorproben für biomedizinische Forschung verarbeitet und lagert, ohne den klinischen Arbeitsablauf zu stören. Dieses Protokoll ermöglicht die Nutzung sonst verwerfbarer Gewebeproben.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel von der Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, verliehen an EEH und Midwestern University Office of Research und Sponsored Programme Intramural Grant, an KJL vergeben unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von angeschlossenen Laboratorien und angeschlossenen Dermatologie zur Verfügung gestellt. Wir danken Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel und Ali Zaidi für ihre technische Unterstützung.

Alle Experimente an menschlichen Gewebeproben wurden von Western IRB (WIRB-Protokoll Nr. 20142461) genehmigt. Das einzige Kriterium für die Sammlung von Geweben für diese Verfahren ist eine Biopsie-bewährte Diagnose von SCC. Es wurden keine Ausschlusskriterien im ursprünglichen IRB-Protokoll skizziert, aber Proben von Patienten mit bekannter blutübertragbarer Krankheit wurden nicht verwendet. Informierte Zustimmung wurde vor der Sammlung von Hautgewebe, Blut und Speichel erhalten. Midwestern Institutional Review Board genehmigte die Validierungsarbeit mit klinikbasierten Biorepository-Proben an der Midwestern University (AZ # 807). 1. Kutane Tumor-Gewebe-Verarbeitung HINWEIS: Dies wird von einem Mohs Histotechnologen durchgeführt. <ol><li> Verarbeitung von frischem Plattenepithelkarzinom (SCC) Gewebe für RNA und Explant Culture <ol><li> Nachdem das Gewebe vom Mohs-Chirurgen herausgeschnitten worden ist, ernten Sie 10 bis 50 mg (≥ 10 mm 3 </sup&gt;) Gewebeprobe aus der Mitte der apikalen Seite des Gewebes während der Entspannung (was der Prozess der Manipulation des Gewebes ist, um es zu erlauben, flach auf dem Objektträger zu liegen) vor der zusätzlichen Verarbeitung. HINWEIS: Dies ist nur möglich, wenn der Tumor groß genug ist, um eine Probe von 10-50 mg (≥10 mm 2 ) vor der histologischen Beurteilung, die Teil des Mohs-Verfahrens ist, zu entfernen. Wenn der Tumor nicht groß genug ist, um ein Minimum von 2 mm 3 zu entfernen, gehen Sie nicht mit der Verarbeitung für RNA vor (Schritt 5 überspringen). </li><li> Übertragen Sie das lebensfähige Gewebe auf ein markiertes 1,5 mL Röhrchen, das Kulturmedium enthält (1: 1 Mischung von DMEM: Ham F-12, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) mit Pinzetten und stellen Sie sicher, dass die Gewebe wird vollständig in das Medium eingetaucht. Lagern Sie diese Röhre bei 4 ° C vor der zusätzlichen Verarbeitung. </li><li> Verwenden Sie das Gewebe für die RNA-Isolierung und Expressionsanalyse (siehe Schritt 5) und / oder die etablierungEnt einer Kulturpflanze (siehe Schritt 6) innerhalb von 24 Stunden. </li><li> Legen Sie den Rest der Tumorprobe, die vom Patienten entfernt wurde (Schritt 1.1.1), auf einem Kryostat-Gewebehalter (oder &quot;Chuck&quot;). Das Gewebe in eine optimale Schneidetemperatur (OCT) -Verbindung einbinden, das Gewebe innerhalb des Halters einfrieren, um die Fertigstellung der Mohs-Histologie und die Vorbereitung zusätzlicher histologischer Dias für die experimentelle Analyse zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Vorbereitung von histologischen Folien <ol><li> Schneiden Sie Gewebeabschnitte 7 μm dick mit einem Kryostaten und erstellen Sie zwei (oder mehrere) Objektträger für jede Tumorprobe. Stellen Sie sicher, dass jede Folie bis zu drei Abschnitte des gesamten Tumors enthält. HINWEIS: Einer der beiden Folien wird mit H &amp; E vom Mohs-Histotechniker gefärbt und die zusätzlichen Folien können mit IF-, IHC- oder FISH-Analyse verarbeitet werden. </li><li> Legen Sie die Folien in Aceton für 1-2 s, um das Gewebe zu fixieren. Setzen Sie diese Rutschen zur Seite. Nicht h &amp; eFlecken oder Deckel die Folie für zukünftige Immunfluoreszenz (IF), Immunhistochemie (IHC) oder Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Analyse, abhängig von der experimentellen Protokoll verwendet werden. </li></ol></li><li> Verarbeitung von Post-Mohs-Gewebe <ol><li> Sobald die Mohs-Verarbeitung abgeschlossen ist (Schritte 1.1-1.2), arbeiten Sie in der Kryostatkammer und entlasten die Probe aus dem Kryo-Einbettungsmedium und legen das Gewebe in ein markiertes Kryo-Röhrchen. </li><li> Legen Sie die markierte Ampulle in flüssigen Stickstoff, bevor das Gewebe aufgetaut hat. Wenn Proben für die Protein- und / oder DNA-Analyse verwendet werden sollen, können sie innerhalb weniger Minuten in einen flüssigen Stickstoff oder ein Gefäß mit -80 ° C überführt werden, um für die zukünftige Proteinexpression und DNA-Mutationsanalyse gelagert zu werden (siehe Schritte 4-5) . HINWEIS: Wenn aus der Post-Mohs-Probe eine intakte RNA gewünscht wird, ist es unerlässlich, die Probe während der Entfernung aus dem Kryo-Einbettungsmedium gefroren zu halten. Wenn äußerste Sorgfalt nicht ausgeübt wirdIn diesem Schritt sollte die Post-Mohs-Probe für die Protein- und / oder DNA-Analyse reserviert werden. </li></ol></li><li> Verarbeitung von frischem ANT <ol><li> Zur Zeit der Mohs-Schließung, erhalten ANT vom Mohs-Chirurgen. </li><li> Entfernen Sie eine gleich große oder größere Menge an ANT, wie sie aus der SCC-Probe (siehe oben) von der apikalen Seite des normalen Gewebes geerntet wurde, und überführen sie auf ein markiertes 1,5 ml-Röhrchen, das Kulturmedium enthält (1: 1-Gemisch von DMEM: Hams F- 12, ergänzt mit 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 &amp; mgr; g / ml Streptomycin) unter Verwendung einer Pinzette. </li><li> Vollständig das Gewebe in das gleiche Kulturmedium eintauchen und bei 4 ° C bis zur nachfolgenden Verarbeitung aufbewahren (siehe Schritte 4-6). </li></ol></li></ol> 2. Blut-, Speichel- und Bukkal-Tupferverarbeitung <ol><li> Erhalten Sie ca. 10 ml Blut in EDTA Sammelröhrchen über Venenpunktion. </li><li> Übertragen Sie das Blut aus den Sammelröhrchen in ein steriles 15- oder 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie ca. 200 μl in ein 1,5 mL Kryo-Röhrchen, um Blasen zu vermeiden; Speichern Sie diese Vollblutprobe bei -80 ° C, um für zukünftige Genotypisierung und Gewebeanpassung verwendet zu werden, falls nötig. <ol><li> Das restliche Blut bei 1000 xg für 30 min drehen und den Standardverfahren folgen, um die Plasmafraktion zu sammeln. </li><li> Aliquotieren Sie das Plasma in 1-ml-Schritten in 1,5 ml Kryo-Röhrchen und lagern bei -80 ° C für den Einsatz bei zukünftigen Flüssigbiopsie-Analysen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie einen sterilen Tupfer, um eine bukkale Tupferprobe zu erhalten und den Tupfer in einem sterilen Röhrchen bei Raumtemperatur zu lagern. </li><li> Falls erforderlich, eine Speichelprobe erhalten und bei Raumtemperatur in einem sterilen Röhrchen aufbewahren. HINWEIS: Diese Proben können für zukünftige Genotypisierung und Gewebeanpassung verwendet werden, falls erforderlich. </li></ol> 3. Aufzeichnung der Proben <ol><li> Übertragen von Informationen aus der Checkliste der Patientenproben in die Biorepository-Datenbank. Patienteninformation und diag einbeziehenNosis aus der Patientendiagramm. </li><li> Drucken Sie Etiketten mit einem Barcode für jede Probe und notieren Sie jede in der Datenbank, um jede gesammelte Probe mit Patientendaten zu verknüpfen. </li><li> Notieren Sie die Verteilung der de-identifizierten Proben in der Biorepository-Datenbank vor der Übertragung der Proben in das Forschungslabor. </li></ol> 4. Protein-Isolierung und Western-Blot-Analyse <ol><li> Legen Sie jede Gewebeprobe (SCC und / oder ANT) in eine Durchstechflasche, die 500 μl Zelllysepuffer enthält, der Protease-Inhibitoren pro 100 mg Gewebe enthält, um das Gewebe zu lysieren. HINWEIS: Wir verwendeten einen Radioimmunopräzipitationstest (RIPA) -Puffer, bestehend aus 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1,0% NP-40 und 0,1% SDS. Andere Zelllysepuffer können verwendet werden. </li><li> Homogenisieren des Gewebes unter Verwendung eines Gewebehomogenisators für 5 min in 20-s-Intervallen bei 4 ° C. Spin die Proben bei 21.000 xg und 4 ° C für 20 min und sammle den überstehenden Protein in eine frische tuSein. Den Überstand unter den gleichen Bedingungen nachspülen und den Endüberstand in ein frisches Röhrchen sammeln. </li><li> Elektrophorese 30-50 μg Protein aus jeder Probe unter Verwendung eines 4-20% SDS-Polyacrylamid-Gradientengels. Färben Sie das Gel mit Coomassie Blue, um Proteinbanden zu visualisieren, falls gewünscht. </li><li> Wenn eine Western-Blot-Analyse von exprimierten Proteinen erforderlich ist, übertragen Sie die Proteine ​​aus dem Gel zu einer Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran nach Standardprotokollen. Nach der Übertragung färben Ponceau die PVDF-Membran, um Proteinbanden zu visualisieren, falls gewünscht. </li><li> Blockieren Sie die PVDF-Membran und die Sonde, um Proteine ​​von Interesse nach Standardprotokollen zu erkennen. Verwenden Sie primäre Antikörper, die spezifisch für das / die Protein (e) von Interesse sind, zusammen mit entsprechenden sekundären Antikörpern, die für die primären Antikörper spezifisch sind, in Konzentrationen, die vom Hersteller für Western-Blot-Analyse empfohlen werden. </li><li> Die untersuchte Membran unter Verwendung eines chemolumineszierenden Substrats freisetzen und die Membran mit einem imagi aufbildenSystem. </li></ol> 5. RNA-Isolierung und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) <ol><li> Stellen Sie sofort frische Gewebeproben (SCC und / oder ANT) in ein 1,5 ml-Röhrchen, das eine RNA-Stabilisierungslösung enthält, und platzieren Sie nach dem Mohs-Gewebeproben in ein 1,5 ml-Röhrchen, das eine gefrorene Gewebeübergangslösung enthält, nach den Empfehlungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig eingetaucht ist. Diese Proben bei -80 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren. </li><li> Entfernen Sie die RNA-Proben von -80 ° C und tauen Sie auf Eis. Übertragen Sie das Gewebe auf ein neues 1,5 ml-Röhrchen, das 1 ml RNA-Extraktionspuffer (Phenol / Guanidin-Thiocyanat) pro 50-100 mg Gewebe enthält. </li><li> Lyse die Gewebe mit einem Gewebe-Homogenisator. Führen Sie sechs Zyklen der Homogenisierung durch, gefolgt von einer Periode der Probenkühlung; Jeder Zyklus besteht aus 20 s Homogenisierung bei 4 ° C und einer 40 s Kühlung. Nach der Homogenisierung die Probe 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Füge 0,2 hinzuMl Chloroform pro 1 ml RNA-Extraktionspuffer und schüttelt das Röhrchen kräftig von Hand für 15 s. Inkubieren für 2-3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Die Proben bei 12.000 xg und 4 ° C für 15 min drehen. Entfernen Sie die wässrige Phase der Probe und legen Sie sie in ein neues 1,5 mL Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 0,5 ml von 100% Isopropanol pro 1 ml des in Schritt 5.2 verwendeten RNA-Extraktionspuffers in die wässrige Phase hinzu und inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Wenn die RNA-Ausbeuten niedrig sind ( dh das Ausgangsgewebevolumen beträgt weniger als 10 mg), können die Proben über Nacht bei -80 ° C ausgefällt werden. Zusätzlich können 5 &amp; mgr; g RNase-freies Glykogen pro 500 &amp; mgr; l RNA-Extraktionspuffer während des Isopropanol-Präzipitationsschrittes zugegeben werden, um die RNA-Ausbeuten zu verbessern. </li><li> Die Probe bei 12.000 xg bei 4 ° C für 10 min drehen. Den Überstand entfernen und das Pellet mit 1 ml 75% igem Ethanol waschen. </li><li> Vortex die Probe kurz und dann drehen Sie es bei 7.500 xg und 4 °C für 5 min. Verwerfen Sie die Wäsche und lufttrocknen Sie das Pellet für 5-10 min. </li><li> Das RNA-Pellet wird in 20 μl RNase-freiem Wasser resuspendiert. <ol><li> Falls gewünscht, reinige jede RNA-Probe mit einem RNA-Cleanup-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: Kleine RNAs werden aus der Probe verloren, wenn dieser Schritt durchgeführt wird. </li></ol></li><li> Elektrophorese eine 1 &amp; mgr; g Probe unter Verwendung eines 1,2% Formaldehyd-MOPS-Agarosegels, um die Qualität der RNA zu analysieren. HINWEIS: Als Alternative analysieren Sie Proben mit einem Bioanalysator, um eine RIN-Nummer 13 zu erhalten. </li><li> Reverse-transkribieren der RNA an cDNA unter Verwendung eines reversen Transkriptionsprotokolls für die qPCR-Analyse von Ziel-mRNAs (oder miRNAs) von Interesse. </li></ol> 6. Gewebe-Explant-Kulturen <ol><li> Sterilisieren des ausgeschnittenen Gewebes vor der Kultur durch Eintauchen des Gewebes in 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie das Gewebe auf eine Folie oder Schale und fügen Sie genug Kultur Medium (1: 1 Mischung aus DMEM: Ham &amp; #39; s F-12, ergänzt mit 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin), um das Gewebe zu bedecken (um das Gewebe vor dem Trocknen zu verhindern). Das Gewebe sorgfältig in Fragmente (&lt;1 mm 3 ) mit einem Skalpellblatt schneiden. </li><li> Übertragen Sie die Gewebefragmente auf eine 35-mm-Gewebekulturschale und fügen Sie etwa 20 μl fötales Rinderserum (FBS) auf jedes Fragment hinzu. </li><li> Lassen Sie das Gericht in einer Kulturhaube für 20-30 min oder bis fast trocken. </li><li> Fügen Sie 1 ml Kulturmedium (1: 1 Mischung aus DMEM: Schinken F-12, ergänzt mit 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) zu jeder Schale und inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 . Subkultur oder Sub-Klon die Kulturen, wenn nötig. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Nach dem Wissen des Autors ist dieses Protokoll das erste seiner Art, das sich auf die klinische Beschaffung von Hautgewebeproben sowohl in einem kostengünstigen als auch in einem schnellen Ansatz konzentriert. Patienten, die sich einer Mohs-Mikrochirurgie unterziehen, sind typischerweise während bestimmter Zeitblöcke geplant, und die Sammlung ist auf diese Zeiträume beschränkt. Die Probenahme beinhaltet die Anstrengung des medizinischen Assistenten, der an der Patientenversorgung beteiligt ist, der Mohs-Histotechnologe...

Krebs- und Biomarkerforschung beruht auf einer Versorgung mit hochwertigen menschlichen Gewebeproben, und begrenztes Angebot hat die Forschung behindert 1 , 2 . Viele dermatologische Studien sind durch die unzureichende Versorgung, die variable Qualität und die Kosten im Zusammenhang mit der Verwendung von menschlichem Gewebe begrenzt. Die Kosten für die Gründung einer großen, dedizierten Biobank wurde auf etwa zwei Millionen Dollar 3 geschätzt, und diese Kosten legen die Verwendung von menschlichem Gewebe aus der Reichweite vieler Forscher. Darüber hinaus stellt der Prozess der Erzeugung und Speicherung von Forschungsproben das Risiko dar, klinische Operationen zu beeinträchtigen und die Patientenversorgung zu verzögern, wenn sie nicht sorgfältig durchgeführt wird. Es wurde ein kostengünstiges, klinikbasiertes Biorepository etabliert, das sich auf Hautkrebsproben nach empfohlenen Best Practices und Probenvalidierung 4 , 5 , 6 konzentriert. <pEnglisch: www.tab.fzk.de/en/projekt/zusammenf...ng/ab117.htm Dieses Protokoll wurde in einer Dermatologie-Klinik entwickelt, die ein großes Volumen an Mohs-mikrographischen Operationen durchführt, um Plattenepithelkarzinome (SCC), Basalzellkarzinom (BCC) und Melanom-Hautkrebs zu entfernen. Freiwillige Spender können von dieser Patientenpopulation rekrutiert werden. Es ist wichtig, das Biorepository an der Stelle der Sammlung zu etablieren, um schnell Gewebe und Blut von assoziierten Patienten ohne Verzögerung der Behandlung zu erfassen. Das Sammeln von Proben aus der gleichen Klinik minimiert Variationen in der Sammlungstechniken und minimiert Variationen in der Qualität der Proben, was für die nachgeschalteten Anwendungen problematisch sein kann 7 , 8 . Das Ziel der Mohs mikrographischen Chirurgie Technik ist, um sicherzustellen, dass alle Krebs Gewebe entfernt wird, während die Erhaltung so viel gesundes Gewebe wie möglich. Das Verfahren beinhaltet die fortschreitende Entfernung von dünnen Schichten von Tumorgewebe. Jede aufeinanderfolgende Schicht ist seineTologisch untersucht (nach der Kryosektion des Tumorgewebes und Durchführung von H &amp; E-Färbung) durch einen Dermatologen, um festzustellen, ob alle Krebsgewebe entfernt worden sind. Die Exzision und Untersuchung der nachfolgenden Gewebeschichten erfolgt, während der Patient im Büro bleibt. Diese Technik gilt als die beste Behandlungsoption für SCC 9 . An diesem Punkt wird die Wunde geschlossen und zur Verbesserung der Heilung und des kosmetischen Erscheinungsbildes wird neben normalem Gewebe (ANT) häufig herausgeschnitten. So ist dieses chirurgische Verfahren zur Entfernung eines Tumors ideal geeignet, um histologisch charakterisiertes Gewebe für zukünftige Studien zu sammeln. Das Beschaffungsverfahren zur Gewinnung von Tumorgewebe, angrenzend an normalem Gewebe, Speichel und Blutproben wurde so entworfen, dass es minimale Auswirkungen auf die normalen Personalaufgaben hat (Abbildung 1 ). Medizinische Assistenten führen das Blut zieht bei der Vorbereitung des Patienten für das Verfahren. Nach Beendigung des Mohs-Verfahrens ist das M<html> Ohs Histotechnologe bereitet zusätzliche histologische Folien der Probe vor und überträgt das Gewebe auf das Biorepository. Die Kosten für die Errichtung des Biorepositorys beinhalten den Kauf von Kryokonservierungsgefriergeräten, die Schaffung eines bescheidenen klinischen Laborraums und die Entwicklung eines Inventarverfolgungsprogramms. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig1.jpg" /> Abbildung 1: Reihenfolge der Probenahme und verantwortungsbewusstes Personal Nach dem Check-in des Patienten und dem Erreichen der Zustimmung des Patienten sammelt der medizinische Assistent einen bukkalen Tupfer und führt einen Blutentnahme durch. Der Dermatologe und der medizinische Assistent überholen dann den Tumor und schließen die Wunde, während welcher Zeit SCC- und ANT-Proben gesammelt werden. Ein engagierter Labortechniker verarbeitet das Blut und deckt die SCC- und ANT-Proben für die Gewebekultur, die Konservierung und den Eintritt in das Biorepository ab.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die Vielfalt der gesammelten Proben ermöglicht eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen (Abbildung 2 ). Proben, die vom Patienten gesammelt wurden, sind bukkale Tupfer (Speichel kann auch gesammelt werden, wenn nötig), Vollblut und ausgeschnittenes Gewebe. Die bukkalen Tupfer und eine Probe aus dem Vollblut werden ohne Verarbeitung für die Genotypisierung und Gewebeanpassung gerettet. Vollblut wird in weiße Blutkörperchen (WBC) und Plasmafraktionen für zukünftige Analysen getrennt. Nach der Mohs-Verarbeitung wird der gefrorene Tumor direkt in flüssigen Stickstoff gegeben und auf einen Gefrierschrank von -80 ° C übertragen. Frisches, lebensfähiges Tumorgewebe und ANT-Proben werden unter Verwendung von Modifikationen der vorherigen Techniken 10 , 11 kultiviert und dann kryokonserviert. Während der Erhebung wird die Anzahl der einzelnen Sample-Typen auf einer Kalkulationstabelle vor dem Eintritt aufgezeichnet<html> Das Inventar-Tracking-Programm zur Erleichterung der genauen Verarbeitung ( Tabelle 1 ). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig2.jpg" /> Abbildung 2: Überblick über die Klinik-basierte Biorepository Probenahme und -verarbeitung. Ein bukkaler Tupfer und eine Blutprobe werden vom Patienten gesammelt und für die nachgeschaltete Genotypisierung und Gewebeanpassung gespeichert. Vollblut wird für die Isolierung der weißen Blutkörperchen (WBC) und die CTC-Analyse sowie für die Plasmasammlung und die Flüssigbiopsieanalyse weiterverarbeitet. Gewebe, das während des Mohs-Verfahrens ausgeschnitten wird, wird für diagnostische Zwecke histologisch verarbeitet, wonach die histologischen Folien experimentell für weitere immunhistochemische Analysen eingesetzt werden können. Unter der Voraussetzung, dass die exzidierte Gewebeprobe groß genug ist, wird ein Teil des frischen Gewebes entfernt und für die Protein- und RNA-Isolierung geschnitten und für die Herstellung von kultivierten Zelllinien.55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Abholtermin: </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Patient 1 </td><td> Patient 2 </td><td> Patient 3 </td><td> Patient 4 </td><td> Patient 5 </td></tr><tr><td> Initialen und Geburtsdatum </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Augenfarbe </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispielstyp </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispiel Ort </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Speichel </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> WLoch Blut </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plasma </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tumor lebensfähig </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gewebe Normal lebensfähig </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tumor Mohs Flüssiger Stickstoff </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tissue Normal Liquid Stickstoff </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rutschen </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Checkliste zum Aufnehmen von Sample-Sammlungen. Daten, die mit jeder gesammelten Probe verfolgt und aufgezeichnet wurden, beinhalten Patienteninitialen, Geburtsdatum und Augenfarbe (für die Hauttypisierung) sowie die locatiAuf Probenentfernung Die Anzahl der Speichelproben, die Blutentnahmevolumina und die Anzahl der lebensfähigen und konservierten Gewebeproben, die gesammelt wurden, werden auch als Referenzen für Zuweisungen zu späteren Verwendungen aufgezeichnet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55583/Table1.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> Um die Probenahmeverfahren zu validieren, wurde jeder Sample-Typ in nachgeschalteten Anwendungen getestet. Unter Verwendung von Modifikationen von früheren Techniken 12 wurden Tumor und ANT erfolgreich in der Protein- und RNA-Isolierung verwendet und können möglicherweise für die DNA-Isolierung verwendet werden. Lebensfähige Explantate aus den Gewebeschnitten wurden durch Mikroskopie ausgewertet, während gespeicherte histologische Objektträger für die Immunhistochemie und Immunfluoreszenz verwendet wurden. Durch das hier beschriebene Protokoll ist es möglich, dieses Modell auf andere Dermatologiekliniken, andere Tumortypen (wie Melanom) zu erweitern,, Und andere chirurgische Spezialitäten und Praktiken, um menschliche Gewebe Proben für vielfältige Forschung in menschlichen Krebs zu liefern. Leichte Modifikationen dieses Protokolls sind wahrscheinlich für andere Praktiken notwendig, aber grundsätzlich ist dieses Protokoll auf jede chirurgische Praxis anwendbar, die routinemäßig Patientenproben, die im Laufe der Patientenbehandlung gesammelt wurden, verwischt.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Kunststoff-Blutentnahmeröhrchen mit K3EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft Doppelschneidklingen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-949-411</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Allzweckzange mit mittlerem Punkt</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>Premium Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville KGM Keratinozyten-Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9791321</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften Gewebe TEK OCT Compound</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-363-579</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1950 Kryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743909</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Mikroskop Objektträger</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Rapid-Chrom H& E Färbekit für den Schnellschliff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>99-900-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Kryoröhrchen für die Langzeitlagerung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03-337-7X</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Boca Scientific BuccalT-Swab&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9679349</td><td></td></tr><tr><td>Cell Signaling Technology 10x RIPA Puffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-195-822</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease und Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI78443</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R Mikrozentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-401-203</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Morter Akku-Homogenisator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-141-3</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Free Pellet Stößel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>121-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Forma SteriCycle CO2 Inkubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-998-089</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SH30071.02</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-634-028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 1 M Hepes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-630-130</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Zellkultur 35 mm mit Vent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1256591</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-CFH-Antikörperklon OX-24</td><td>Abnova</td><td>MAB12583</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p40 (p63 delta) Antikörper</td><td>Abnova</td><td>ABX-144A</td><td></td></tr><tr><td>Anti MUC-1 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-7313</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Schnecke + Schnecke (phospho S246)</td><td>Abcam Abcam</td><td>Ab63568</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phallodin</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmittel mit DAPI</td><td>Molekularsonden&nbsp;</td><td>P36941</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager Z1 Mikroskop mit Axiocam Kamera</td><td>Zeiss</td><td>4300009901</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 Phasenkontrast mit DP72 Kamera</td><td>Olympus</td><td>IX511F3</td><td></td></tr></tbody></table>

errichtung eines klinischen biorepositorys

Establishment of a Clinic-based Biorepository

Die Inzidenz von Hautkrebs ( z. B. Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom und Melanom) hat in den vergangenen Jahren zugenommen. Es wird erwartet, dass es eine parallele Nachfrage nach kutanen Tumorproben für biomedizinische Forschungsstudien gibt. Die Verfügbarkeit der Gewebe ist jedoch aufgrund der Kosten für die Etablierung eines Biorepositorys und des Mangels an Protokollen, die für die Erlangung von klinischen Proben zur Verfügung stehen, die die klinischen Operationen nicht beeinträchtigen, begrenzt. Es wurde ein Protokoll erstellt, um kutane Tumor und assoziierte Blut- und Speichelproben zu sammeln und zu verarbeiten, die minimale Auswirkungen auf routinemäßige klinische Verfahren am Tag einer Mohs-Chirurgie haben. Tumorproben werden gesammelt und verarbeitet von Patienten, die sich ihrer ersten Schicht der Mohs-Chirurgie für biopsie-bewährte Hautmalignitäten durch den Mohs-Histotechnologen unterziehen. Angrenzendes normales Gewebe wird zum Zeitpunkt des chirurgischen Verschlusses gesammelt. Zusätzliche Proben, die gesammelt werden können, sind Vollblut und bukkale Tupfer. Durch die Verwendung von Gewebeproben, die normalerweise verworfen werden, wurde ein Biorepository erzeugt, das mehrere wesentliche Vorteile bietet, indem es in der Klinik gegenüber der Laborumgebung basiert. Dazu gehören eine breite Palette von gesammelten Proben; Zugang zu erkannten Patientenakten, einschließlich Pathologieberichten; Und, für den typischen Spender, Zugang zu zusätzlichen Proben bei Folgebesuchen.

Tumor und ANT wurden erfolgreich in der Proteinisolation eingesetzt und durch Western Blotting getestet. Wie in Abbildung 3 gezeigt , können kutane Plattenepithelkarzinommarker (Muc1 14 , FHL-1 15 und p40 16 , 17 ) bei Patientenproben nachgewiesen und in unserem klinikbasierten Biorepository gespeichert werden. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Kutane Tumoren werden oft nach Mohs mikrographischen Chirurgie verworfen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das es dem klinischen Hilfspersonal ermöglicht, kutane Tumor- ( zB Plattenepithelkarzinom-, Basalzellkarzinom- und Melanom-) Proben für nachgeschaltete Laboranwendungen effektiv zu verarbeiten und zu speichern, ohne die klinischen Operationen zu beeinträchtigen.

Errichtung eines klinischen Biorepositorys

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, klinisches Unterstützungspersonal in einer dermatologischen Praxis in die Lage zu versetzen, Proben kutaner Tumore effektiv für nachfolgende Laboranwendungen aufzubereiten und zu lagern, ohne den regulären klinischen Betrieb zu stören. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um medizinischem Fachpersonal und Mohs-Histotechnikern die Sammlung und Lagerung von Proben kutaner Tumore für zukünftige biomedizinische Forschungsprojekte im Rahmen ihres täglichen klinischen Betriebs zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass entferntes Gewebe, das normalerweise verworfen und vernichtet wird, stattdessen für Forschungszwecke gesammelt und konserviert wird, und zwar mithilfe von Verfahren, die den regulären klinischen Betrieb nur minimal beeinträchtigen.Die Vielfalt der gesammelten Proben ermöglicht Korrelationen zwischen Protein- und RNA-Biomarkern in den Gewebe- und Plasma­proben sowie den Patienten­ergebnis­daten. Im Prinzip ist dieses Protokoll, nach geringfügigen Modifikationen, auf jede chirurgische Tätigkeit anwendbar, bei der routinemäßig Patientenproben verworfen werden, die im Verlauf der Patientenbehandlung gewonnen wurden. Die Durchführung des Verfahrens wird Stefani Fawks, eine Mohs-Histotechnikerin, und Dr. Mitchell Manway, ein Forschungsassistent in unserer Praxis, demonstrieren.Beginnen Sie damit, das vom Mohs-Chirurgen erhaltene Gewebe zu verwenden, und schneiden Sie mit einem Skalpell eine Probe von 10 bis 50 Milligramm aus der Mitte der apikalen Seite des Gewebes aus. Überführen Sie das vitale Gewebe mithilfe einer Pinzette in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Röhrchen, das vorab mit Kulturmedium gefüllt wurde. Achten Sie darauf, dass das Gewebe vollständig in das Medium eingetaucht ist.Stellen Sie die Probe in einen Kühlschrank und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, nicht länger als 24 Stunden, bevor die weitere Verarbeitung erfolgt. Gewinnen Sie mindestens ein 10 Kubikmillimeter großes Gewebestück von der apikalen Seite des exzidierten Gewebes, sofern die Tumorprobe groß genug ist und eine solche Entnahme die routinemäßige Mohs-Verarbeitung nicht beeinträchtigt. Danach bringen Sie die verbleibende, nicht verarbeitete Tumorprobe auf einem Kryostat-Gewebeträger an.Das Gewebe in einer optimalen Schneidetemperatur-Verbindung (OCT) einbetten und innerhalb des Halterungsbehälters einfrieren, um histologische Schnitte vorzubereiten. Mithilfe eines Kryostaten schneiden Sie das Gewebe in sieben Mikrometer dicke Schnitte und legen bis zu drei Schnitte pro Objektträger auf. Nach dem Schneiden wird das Gewebe fixiert, indem die Objektträger für ein bis zwei Sekunden in Aceton getaucht werden.Anschließend die Objektträger an der Luft trocknen lassen. Während die verbleibende Probe in einer Kryostat-Kammer aufbewahrt wird, das Gewebe vorsichtig aus dem Kryo-Einbettmedium lösen und in ein beschriftetes kryogenes Röhrchen überführen. Das beschriftete Röhrchen unverzüglich in flüssigen Stickstoff überführen.Die Übertragung des Gewebes in ein Kryoröhrchen nach der Mohs-Verarbeitung muss in der minus 20 Grad Celsius kalten Kryostatkammer durchgeführt werden. Wenn dieser Schritt ordnungsgemäß durchgeführt wird und das Gewebe eingefroren bleibt, ermöglicht dies die erfolgreiche Isolierung von RNA aus post-Mohs-Gewebeproben. Danach wird benachbartes gesundes Gewebe vom Mohs-Chirurgen entnommen.Entnehmen Sie eine Probe von der apikalen Seite des angrenzenden normalen Gewebes. Überführen Sie die entnommene Probe anschließend mit einer Pinzette in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Röhrchen, das mit Kulturmedium gefüllt ist. Tauchen Sie das Gewebe in dasselbe Kulturmedium ein.Geben Sie es in einen geeigneten Probenbeutel und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, bis zur weiteren Verarbeitung. Sammeln Sie etwa 10 Milliliter venöses Blut in EDTA-beschichteten Sammelröhrchen. Vereinigen Sie die Blutproben in einem sterilen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Überführen Sie anschließend etwa ein Milliliter der Blutprobe in ein 1,5-Milliliter-Kryoröhrchen, wobei Blasen vermieden werden sollten. Lagern Sie diese Vollblutprobe bei minus 80 Grad Celsius, bis zu späteren Genotypisierungs- und Gewebetests. Zentrifugieren Sie danach die verbleibende Blutprobe bei 1000 × g für 30 Minuten, um Blutplasma zu gewinnen.Nach dem Zentrifugieren das Plasma sammeln und in Aliquots zu je einem Milliliter in 1,5-Milliliter-kryogenen Röhrchen aufteilen. Die Proben bei minus 80 Grad Celsius lagern, um sie in zukünftigen Flüssigbiopsie-Analysen zu verwenden. Die Daten aus der Checkliste der Patientenproben zusammen mit den Patienteninformationen und der Diagnose, die aus dem Patientenbogen entnommen wurden, in die Biorepository-Datenbank eingeben.Notieren Sie abschließend die Lokalisation der anonymisierten Proben in der Biorepository-Datenbank und bringen Sie die Proben in das Forschungslabor. Unmittelbar danach überführen Sie die Gewebeproben in 1,5-Milliliter-Röhrchen, die vorab mit geeigneten Extraktionslösungen befüllt wurden, und stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig eingetaucht ist. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie weiterverarbeitet werden.Hier werden die Bilder repräsentativer Western Blots für bekannte Marker des Plattenepithelkarzinoms – Mucin eins, FHL-eins und p40 – dargestellt, die für benachbartes normales Gewebe und eine Tumorprobe erhalten wurden. Die Qualität der aus Mohs-Proben isolierten RNA wurde zunächst mittels Gelelektrophorese beurteilt, gefolgt von einer Analyse der RNA-Integrität. Die für normale und Tumorproben erzielten RNA-Integritätszahlen zeigen, dass hochwertige und intakte RNA gewonnen wurde.Die Zytometrieprofile der Banden wurden als Fluoreszenzeinheiten über der Nukleotidanzahl für repräsentative RNA-Proben aus Tumor- und Normalgewebe von Patienten dargestellt. Ein Explantat aus Plattenepithelkarzinomgewebe wurde mittels Phasenkontrastmikroskopie abgebildet und erwies sich als gemischte Kultur aus Keratinozyten und Fibroblasten, die unterteilt oder für die zukünftige Zelllinienentwicklung verwendet werden könnte. Schließlich wurde in Gewebeschnitten von Plattenepithelkarzinomen eine positive Färbung für den Marker des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs nachgewiesen.Wenn die Methode einmal beherrscht ist, verlängert sich der übliche Arbeitsablauf des Klinikpersonals um weniger als 30 Minuten, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Der größte Teil der Schritte wird vom bestehenden klinischen Personal durchgeführt, nachdem die Patientenversorgung abgeschlossen ist. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, eine genaue Dokumentation zu führen und die Proben mit der Krankengeschichte und Diagnose des Patienten zu verknüpfen.Da diese Informationen häufig für nachgeschaltete Anwendungen benötigt werden. Diese Technik wird den Weg für Forscher im Bereich der Dermatologie zur Entwicklung von Liquid Biopsies und Biomarkern bei Plattenepithelkarzinomen und Melanomen ebnen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein klinikbasiertes Biorepository für kutane Krebsproben, die im Rahmen der täglichen Praxis gewonnen werden, etabliert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir beschreiben eine Methode zur Etablierung menschlicher Enteroide aus Dünndarmkrypten und Kolonoide aus Dickdarmkrypten, die sowohl aus chirurgischem Gewebe als auch aus Biopsien entnommen wurden. In diesem methodischen Artikel stellen wir die Kulturmodalitäten vor, die für das erfolgreiche Wachstum und die Erhaltung von humanen Enteroiden und Kolonoiden unerlässlich sind.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

Diese Methode beinhaltet die Nutzung klinischer diagnostischer Daten für Prostatakrebspatienten, um Probenahmeverfahren zu leiten, wenn Biobanking-Gewebe nach radikaler Prostatektomie. Dadurch werden Probleme mit zuvor veröffentlichten Methoden rund um effizienz und Verfügbarkeit von frischem Gewebe für ein breiteres Spektrum nachgelagerter Anwendungen gelöst.

Verwendung von Magnetresonanztomographie- und Biopsiedaten zur Anleitung von Probenahmeverfahren für Prostatakrebs Biobanking

In der folgenden Arbeit beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Schritte, die für die Errichtung einer großen Biobank von Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs notwendig sind.

Schaffung und Pflege einer lebenden Biobank - Wie wir es tun

Biobanken sind wichtige Ressourcen für die biomedizinische Forschung und die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit am European Institute of Oncology ist ein Modell auf diesem Gebiet. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Standardarbeitsanweisungen von Biobanken für das Management verschiedener Arten von humanbiologischen Proben.

Biobank für translationale Medizin: Standardarbeitsanweisungen für optimales Probenmanagement

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erleichterung der Entnahme von Proben aus radikalen Prostatektomieproben. Ziel ist es, Gewebeproben aus den Proben nach anatomisch-pathologischen Kriterien zu kartieren, zu charakterisieren und zu mikro-präparieren, bevor sie in einer Biobank gelagert werden.

Verbesserung der Zuverlässigkeit von Prostatatumor-Biobanken durch verbesserte Probenahmetechnik und histologische Charakterisierung

Dieses Protokoll stellt eine integrierte Biorepository-Plattform für die standardisierte Sammlung, Annotation und Biobank von hochwertigen humanen Kammerwasser- und Glaskörper-Flüssigbiopsien für molekulare Downstream-Analysen, einschließlich Proteomik, Metabolomik und Glykomik, dar.

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Dieses Protokoll bietet einen systematischen Rahmen für die Etablierung von Eierstockkrebs-Organoiden aus verschiedenen Krankheitsstadien und adressiert die Herausforderungen der patientenspezifischen Variabilität, um die Ausbeute zu erhöhen und eine robuste langfristige Expansion für nachfolgende Anwendungen zu ermöglichen. Es umfasst detaillierte Schritte für die Gewebeverarbeitung, die Aussaat, die Anpassung der Medienanforderungen und die Immunfluoreszenzfärbung.

Strategie für das Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden: Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Patienten über histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg

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