Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse
April 17th, 2017
Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.
Das übergeordnete Ziel der Isolierung von Lipidtröpfchen für die quantitative Massenspektrometrie ist es, die Funktion dieser Organellen zu verstehen, zum Beispiel bei der Vermehrung von Krankheitserregern wie dem Hepatitis-C-Virus. Diese Methode kann wichtige Fragen im Bereich der Infektionskrankheiten beantworten, z. B. warum Krankheitserreger zur Replikation an die Tröpfchen binden. Die Isolierung von Lipidtröpfchen kann in sechs bis sieben Stunden erfolgen.
Und während dieses Verfahrens ist es wichtig, die Kontamination mit Keratin zu vermeiden. Nehmen Sie zunächst 50 Milliliter aus jeder Flasche DMEM-Medium und fügen Sie 50 Milliliter dialysiertes fötales Kälberserum hinzu. Als nächstes lösen Sie 50 Milligramm mit Kohlenstoff 13 markiertes Lysin und 50 Milligramm mit Kohlenstoff 13 markiertes Arginin in einem Milliliter Medium auf.
Mischen Sie gründlich und geben Sie die Aminosäuren in das DMEM plus FCS-Medium. Fügen Sie dann PenStrep und Glutaminersatz hinzu. Sterilfiltrieren Sie das Medium mit einem 0,45-Mikron-Filter und kennzeichnen Sie die Flasche als schweres SILAC-Medium.
Um das leichte Medium vorzubereiten, wiederholen Sie diese Schritte mit 50 Milligramm Arginin und 50 Milligramm Lysin. Beschriften Sie die Flasche als helles SILAC-Medium. Trypsinisieren Sie die Zellen und teilen Sie sie in zwei Vertiefungen mit einer Kulturplatte mit sechs Vertiefungen.
Eine Vertiefung sollte zwei Milliliter des schweren SILAC-Mediums enthalten, die andere zwei Milliliter des leichten SILAC-Mediums. Kultivieren Sie die Zellen für mindestens sechs Durchgänge. Nach sechs Durchgängen sollte der Einbau der schweren Aminosäuren mehr als 95% betragenErnten Sie eine Million Zellen der schweren und leicht markierten Zellpopulationen, um die Wirksamkeit des Einbaus zu analysieren.
Nach dem Waschen der Zellen in 1X PBS pelletieren Sie sie durch Zentrifugation für fünf Minuten bei 160 mal g und vier Grad Celsius. Suspendieren Sie die Zellpellets wieder in 150 Mikrolitern MS-Puffer. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 30 Minuten lang auf Eis.
Dann lysieren Sie die Zellen durch Ultraschall bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Zelltrümmer durch 10-minütige Zentrifugation bei 11.000 g und vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Detergenzien-kompatiblen Proteinassay.
Mischen Sie dann 75 Mikrogramm Protein mit sechs x Probenpuffer. Nach dem Sieden bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten trennen Sie die Proteine durch SDS-PAGE in einem SDS-Laufpuffer bei 180 Bolzen für etwa eine Stunde. Nach der Coomassie-Färbung wird dieselbe Proteinbande herausgeschnitten und die Wirksamkeit des Einbaus mittels MS-Analyse analysiert.
Infizieren Sie die leichte Zellpopulation mit dem Hepatitis-C-Reportervirus, indem Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit faserigen Beständen inkubieren. Expandieren Sie HCV-infizierte Leichtzellen und nicht infizierte schwere Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn Sie einen HCV-Stamm verwenden, der ein Blasticidin-Resistenzgen trägt, fügen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin S zum leichten Medium hinzu, um nach HCV-positiven Zellen zu selektieren.
Einen Tag vor der Lipidtröpfchenisolierung waschen Sie die Zellen mit PBS, tryspinisieren Sie und resuspendieren Sie sie in dem entsprechenden leichten oder schweren Medium. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer. Dann säen Sie sieben Millionen Zellen jeder Population in einer 150 Quadratzentimeter großen Zellkulturschale aus.
Bereiten Sie mindestens fünf Gerichte pro leichter und schwerer Zellpopulation zu. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht in 30 Millilitern Medium pro Schale. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium und waschen Sie die Zellen in 1X PBS.
Trennen Sie die Zellen in 1X PBS mit einem Zellschaber. Nachdem Sie beide Zellpopulationen wie zuvor gezählt haben, ziehen Sie die gleiche Zellzahl in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für fünf Minuten bei 160 mal g und vier Grad Celsius.
Entfernen Sie das PBS und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem Milliliter Saccharosepuffer. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen eng anliegenden Unzen-Homogenisator, bevor Sie die Zellen mit 200 Hüben auf Eis lysieren. Übertragen Sie dann das Lysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen und schleudern Sie die Zellkerne und Zelltrümmer 10 Minuten lang bei 1.000 g und vier Grad Celsius herunter.
Nach der Zentrifugation wird ein Aliquot von 25 Mikrolitern der postnuklearen Fraktion (PNS) bei minus 20 Grad Celsius als Eingangskontrolle gelagert. Legen Sie den Rest der PNS-Fraktion auf den Boden des Zentrifugenröhrchens und überlagern Sie es mit etwa drei Millilitern des Lipidtröpfchenwaschpuffers. Zwei Stunden lang bei 100.000 g und vier Grad Celsius zentrifugieren.
Nach der Zentrifugation wird die schwimmende Lipidtröpfchenfraktion mit einer gebogenen, stumpfen Kanüle von der Oberseite des Röhrchens entnommen. Geben Sie dann die Lipidtröpfchenfraktion in ein Zentrifugenröhrchen, überlagern Sie sie mit Lipidtröpfchenwaschpuffer und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Die Gewinnung der Lipidtröpfchen von der Spitze des Gradienten erfordert Erfahrung.
Und es ist einfacher, je größer der Bruch ist. Sie können Fettzellen zum Üben verwenden. Oder Sie können Ihre Zellen mit Oleat füttern, um die Menge an Lipidtröpfchen zu erhöhen.
Ernten Sie erneut die schwimmende Lipidtröpfchenfraktion mit einer gebogenen, stumpfen Kanüle von der Oberseite des Röhrchens. Übertragen Sie die Lipidtröpfchen in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter Lipidtröpfchen-Waschpuffer hinzu. Dann drehen Sie die Probe 20 Minuten lang bei 21.000 g und vier Grad Celsius.
Entfernen Sie den darunter liegenden Waschpuffer mit einer Pipettenspitze zum Gelladen und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal. Nach der endgültigen Entnahme des Waschpuffers werden fünf Mikroliter Lipidtröpfchenfraktionen mit 10 Mikrolitern NP 40 Lysepuffer zur Bestimmung des Proteingehalts gemischt. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang auf Eis, um das Virus zu inaktivieren, wenn Sie mit infektiösem Material arbeiten.
Zu diesem Zeitpunkt können die Lipidtröpfchenfraktionen bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Mischen Sie als nächstes das Volumen, das mindestens 35 Mikrogramm Protein entspricht, mit 4x Ladefarbstoff. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang auf Eis, um das Virus zu inaktivieren, wenn Sie mit infektiösem Material arbeiten.
Kochen Sie die Probe fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Führen Sie dann eine SDS-PAGE gefolgt von einer Coomassie-Färbung durch, um die Probe für die Flüssigchromatogrophy-Kopplung an die Tandem-Massenspektronomie vorzubereiten, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Reinheit der Lipidtröpfchen zu analysieren, verdünnen Sie die Aliquote der Lipidtröpfchenfraktionen, eins bis zwei, mit NP 40 Lysepuffer
.Die Eingangskontrollfraktionen eins bis zehn werden mit demselben Puffer verdünnt. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang auf Eis, um das Virus zu inaktivieren, wenn Sie mit infektiösem Material arbeiten. Bestimmen Sie anschließend den Proteingehalt mit einem Detergenz-kompatiblen Proteinassay.
Mischen Sie dann die gleiche Menge Protein mit 6x Probenpuffer und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang auf Eis, um das Virus zu inaktivieren, wenn Sie mit infektiösem Material arbeiten. Fahren Sie schließlich mit SDS-PAGE fort und übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran, indem Sie sie 90 Minuten lang bei 80 Volt im Tank blotten. Hier ist eine repräsentative Western-Blot-Analyse von postnukleären und Lipidtröpfchenfraktionen zu sehen.
Der Western Blot zeigt deutlich eine Anreicherung der Lipidtröpfchen-Markerproteine Perilpin zwei und Perilipin drei in den Lipidtröpfchenfraktionen und die Depletion von Markern anderer zellulärer Kompartimente. Postnukleäre und Lipidtröpfchenfraktionen können zusätzlich durch Coomassie-Blau- und Silberfärbung analysiert werden. Diese Heatmap zeigt die Anzahl der Peptide und den prozentualen Prozentsatz der Proteinabdeckung von Proteinen, die in den Lipidtröpfchenfraktionen der analysierten Zellen identifiziert wurden.
Die abschließende Heatmap zeigt, wie eine HCV-Infektion den Lipidtröpfchen pro Tag verändert. Angereicherte Lipidtröpfchen-assoziierte Proteine sind rot und abgereicherte Lipidtröpfchen-assoziierte Proteine blau gekennzeichnet. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass wir die Zellen vor der Isolierung und vor der Isolierung von Lipidtröpfchen mischen und so Fehler minimieren können, die während der Zelllyse und während der Isolierungsschritte auftreten können.
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Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung von Lipidtröpfchen, um deren Rolle bei der Replikation von Krankheitserregern wie dem Hepatitis-C-Virus (HCV) zu untersuchen. Der Isolierungsprozess ist entscheidend für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und Lipidtröpfchen unter verschiedenen Bedingungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Infektiologie
Hintergrund
- Lipidtröpfchen sind Organellen, die an der Replikation mehrerer Krankheitserreger beteiligt sind.
- Das Hepatitis-C-Virus (HCV) ist für seine Replikation auf Lipidtröpfchen angewiesen.
- Das Verständnis der Dynamik von Lipidtröpfchen kann Einblicke in Mechanismen von Infektionskrankheiten liefern.
- Kontaminationen während der Isolierungsverfahren müssen vermieden werden, um genaue Ergebnisse zu erzielen.
Zweck der Studie
- Isolierung von Lipidtröpfchen für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse.
- Untersuchung der Rolle von Lipidtröpfchen bei der Replikation von Krankheitserregern.
- Beantwortung wichtiger Fragen im Bereich der Infektionskrankheiten.
Verwendete Methoden
- Die Isolierung von Lipidtröpfchen kann in sechs bis sieben Stunden abgeschlossen werden.
- Die Vorbereitung beinhaltet das Mischen von DMEM-Medium mit dialysiertem fetalem Kalbsserum.
- Im Isolierungsprozess werden Carbon 13 markiertes Lysin und Arginin verwendet.
- Es wird darauf geachtet, eine Kontamination mit Keratin während des Verfahrens zu vermeiden.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Proteinen, die mit Lipidtröpfchen assoziiert sind.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können das Verständnis der HCV-Replikationsmechanismen verbessern.
- Potenzielle Anwendungen bei der Untersuchung anderer Krankheitserreger, die Lipidtröpfchen nutzen.
- Etablierung eines Protokolls, das für verschiedene experimentelle Bedingungen angepasst werden kann.
Schlussfolgerungen
- Die Isolierungsmethode ist effektiv für die Untersuchung von Lipidtröpfchen-assoziierten Proteinen.
- Das Verständnis der Dynamik von Lipidtröpfchen ist entscheidend für die Forschung zu Infektionskrankheiten.
- Dieser Ansatz kann zu neuen therapeutischen Strategien gegen HCV und ähnliche Krankheitserreger führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding lipid droplet proteome dynamics enables target validation in infectious disease research by identifying host factors that pathogens exploit for replication. This method supports mechanistic de-risking through quantitative mass spectrometry, providing predictive confidence in target selection for antiviral strategies. The approach applies to early discovery stages where pathway clarification and biological validation inform portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying protein recruitment to or depletion from lipid droplets during pathogen infection.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for isolating lipid droplets to assess host-pathogen interactions under controlled conditions.
- Strategic Value: Supports target confidence by identifying pro- or antiviral host factors that modulate lipid droplet-associated proteomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative proteomic data from enriched lipid droplet fractions for downstream screening applications.
- Operational Value: Establishes reproducible isolation and washing steps to minimize variability in protein yield and purity.
- Strategic Value: Enables assay standardization for comparing lipid droplet composition across experimental conditions such as infection or drug treatment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker discovery by linking lipid droplet-associated protein changes to pathogenic mechanisms.
- Operational Value: Supports preclinical model validation through consistent isolation protocols applicable to various cell types and culture conditions.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying host factors that could be modulated therapeutically.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing quantitative insights into organelle-specific proteome remodeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing how pathogens like HCV alter lipid droplet composition.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible lipid droplet fractions enriched for associated proteins via ultracentrifugation and washing steps.
- Analytics: Enables quantitative comparison of protein abundance using SILAC labeling and LC-ESI-MS/MS to detect condition-specific changes.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by identifying dysregulated proteins that may serve as biomarkers or therapeutic targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation protocol adaptable to diverse pathogens, stress conditions, or compound treatments beyond HCV.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in host-pathogen interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized lysis, centrifugation, and washing procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative data on lipid droplet-associated proteins that influence replication efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their functional association with lipid droplets during infection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in SILAC labeling, ultracentrifugation, and mass spectrometry-based proteomics.
- Depends on access to ultracentrifuges, homogenizers, and compatible detergents for protein assays.
- Necessitates cross-team standardization of lipid droplet isolation and washing protocols to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different cell types or pathogen models.
- Includes practical limitations such as the need for technical expertise in harvesting floating lipid droplet fractions and avoiding keratin contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Preparation of Media for Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC)
1:34
SILAC-labeling and Amino Acid Incorporation Control
3:15
Lipid Droplet Isolation of SILAC-labeled Huh7.5 Cells
7:59
Analysis of Lipid Droplets Purity
8:53
Results: Qualitative and Quantitative Analysis of the Lipid Droplets
9:57
Conclusion
