Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Das übergeordnete Ziel der Isolierung von Lipidtröpfchen für die quantitative Massenspektrometrie besteht darin, die Funktion dieser Organellen zu verstehen, beispielsweise bei der Replikation von Krankheitserregern wie dem Hepatitis-C-Virus. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Infektionskrankheiten beantworten, etwa warum sich Krankheitserreger an die Tröpfchen binden, um sich zu replizieren. Die Isolierung von Lipidtröpfchen kann innerhalb von sechs bis sieben Stunden durchgeführt werden.

Während dieses Verfahrens ist es wichtig, eine Kontamination mit Keratin zu vermeiden. Entnehmen Sie zunächst 50 Milliliter aus jeder Flasche DMEM-Medium und geben Sie 50 Milliliter dialysiertes fetalen Kälberserum hinzu. Lösen Sie danach 50 Milligramm Kohlenstoff-13-markiertes Lysin und 50 Milligramm Kohlenstoff-13-markiertes Arginin in einem Milliliter Medium auf.

Gründlich mischen und die Aminosäuren dem DMEM plus FCS-Medium hinzufügen. Anschließend PenStrep und Glutamin-Ersatz hinzufügen. Das Medium sterilfiltrieren, indem ein 0,45-Mikron-Filter verwendet wird, und die Flasche als schweres SILAC-Medium beschriften.

Zur Herstellung des leichten Mediums diese Schritte unter Verwendung von 50 Milligramm Arginin und 50 Milligramm Lysin wiederholen. Die Flasche als leichtes SILAC-Medium beschriften. Die Zellen mit Trypsin behandeln und auf zwei Mulden einer sechs-Mulden-Kulturplatte aufteilen.

Ein Well sollte zwei Milliliter des schweren SILAC-Mediums enthalten und der andere zwei Milliliter des leichten SILAC-Mediums. Kultivieren Sie die Zellen für mindestens sechs Passagen. Nach sechs Passagen sollte die Einbindung der schweren Aminosäuren über 95 % betragen. Gewinnen Sie eine Million Zellen der mit schweren und leichten Markierungen versehenen Zellpopulationen, um die Einbindungseffizienz zu analysieren.

Nach dem Waschen der Zellen in 1X PBS pelletieren Sie diese durch Zentrifugation fünf Minuten bei 160 × g und vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in 150 µL MS-Puffer. Anschließend inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis.

Anschließend die Zellen durch Beschallung bei vier Grad Celsius lysieren. Das Zelltrümmer durch Zentrifugation 10 Minuten bei 11.000 × g und vier Grad Celsius entfernen. Das Überstand in ein neues Gefäß überführen und die Proteinkonzentration mit einem detergentkompatiblen Protein-Assay bestimmen.

Anschließend mischen Sie 75 Mikrogramm Protein mit dem sechsfachen Volumen Probenpuffer. Nach dem Erhitzen bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten trennen Sie die Proteine mittels SDS-PAGE in SDS-Lauffuffer bei 180 Volt für etwa eine Stunde. Nach der Coomassie-Färbung schneiden Sie das gleiche Proteinband aus und analysieren die Inkorporations-Effizienz mittels MS-Analyse.

Infizieren Sie die leichte Zellpopulation mit dem Hepatitis-C-Berichtervirus, indem Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit faserigen Vorräten inkubieren. Vermehren Sie die mit HCV infizierten leichten Zellen und die nicht infizierten schweren Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Falls ein HCV-Stamm verwendet wird, der ein Blasticidin-Resistenzgen trägt, geben Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin S zum leichten Medium hinzu, um für HCV-positive Zellen zu selektieren.

Ein Tag vor der Isolierung der Lipidtröpfchen die Zellen mit PBS waschen, trypsinfizieren und in dem entsprechenden leichten oder schweren Medium resuspendieren. Die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer zählen. Anschließend sieben Millionen Zellen jeder Population in einer 150 Quadratzentimeter großen Zellkulturschale aussäen.

Bereiten Sie mindestens fünf Schalen pro leichten und schweren Zellpopulation vor. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht in 30 Milliliter Medium pro Schale. Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium und waschen die Zellen mit 1X PBS.

Lösen Sie die Zellen in 1X PBS unter Verwendung eines Zellabstreifers ab. Nach dem Zählen beider Zellpopulationen wie zuvor werden gleiche Zellzahlen in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten bei 160 × g und vier Grad Celsius, um sie zu pelletieren.

Entfernen Sie das PBS und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Sucrosepuffer. Überführen Sie die Zellsuspension in einen eng sitzenden Ounce-Homogenisator und lysieren Sie die Zellen mit 200 Stößen auf Eis. Anschließend überführen Sie das Lysat in eine 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhre und zentrifugieren Sie die Kerne und Zelltrümmer 10 Minuten bei 1.000 × g und vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation eine Portion von 25 Mikrolitern der postnuklearen Fraktion oder PNS als Input-Kontrolle bei minus 20 Grad Celsius lagern. Den Rest der PNS-Fraktion auf den Boden des Zentrifugenröhrchens geben und mit etwa drei Millilitern des Lipidtröpfchen-Waschpuffers überlagern. Zwei Stunden bei 100.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren.

Nach der Zentrifugation sammeln Sie mithilfe einer gebogenen stumpfen Kanüle den schwimmenden Lipidtröpfchen-Bruchteil von der Oberseite des Röhrchens auf. Anschließend geben Sie den Lipidtröpfchen-Bruchteil in ein Zentrifugenröhrchen, überlagern ihn mit Lipidtröpfchen-Waschpuffer und wiederholen den Zentrifugationsschritt. Das Aufsammeln der Lipidtröpfchen von der Oberseite des Gradienten erfordert Erfahrung.

Und ist umso einfacher, je größer der Bruchteil ist. Sie können Fettzellen zur Übung verwenden. Oder Sie können Ihre Zellen mit Oleat füttern, um die Menge an Lipidtröpfchen zu erhöhen.

Erneut die schwimmende Lipidtröpfchen-Fraktion mit einer gebogenen stumpfen Kanüle von der Oberseite des Röhrchens gewinnen. Die Lipidtröpfchen in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 500 µL Lipidtröpfchen-Waschpuffer hinzufügen. Anschließend die Probe 20 Minuten bei 21.000 × g und 4 °C zentrifugieren.

Entfernen Sie den darunterliegenden Waschpuffer mithilfe einer Gel-Ladepipettenspitze und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal. Nach dem endgültigen Entfernen des Waschpuffers mischen Sie fünf Mikroliter Lipidtröpfchen-Fraktionen mit 10 Mikrolitern NP-40-Lysepuffer zur Bestimmung des Proteingehalts. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang auf Eis, um das Virus zu inaktivieren, falls mit infektiösem Material gearbeitet wird.

An diesem Punkt können die Lipiddroplet-Fraktionen bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Mischen Sie anschließend das Volumen, das mindestens 35 Mikrogramm Protein entspricht, mit 4x-Ladefarbstoff. Inkubieren Sie das Gemisch eine Stunde lang auf Eis, um das Virus zu inaktivieren, falls mit infektiösem Material gearbeitet wird.

Den Probenansatz bei 95 Grad Celsius fünf Minuten lang kochen. Anschließend SDS-PAGE durchführen, gefolgt von Coomassie-Färbung, um die Probe für die gekoppelte Flüssigkeitschromatographie mit tandem Massenspektrometrie gemäß dem schriftlichen Protokoll vorzubereiten. Um die Reinheit der Lipidtröpfchen zu analysieren, verdünnen Sie Aliquote der Lipidtröpfchen-Fraktionen, ein bis zwei, mit NP-40-Lysepuffer.

Verdünnen Sie die Input-Control-Fraktionen eins bis zehn mit dem gleichen Puffer. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang auf Eis, um das Virus zu inaktivieren, wenn mit infektiösem Material gearbeitet wird. Bestimmen Sie anschließend den Proteingehalt mit einem detergentenkompatiblen Protein-Assay.

Danach gleiche Mengen Protein mit 6x-Probenpuffer mischen und die Proben eine Stunde lang auf Eis inkubieren, um das Virus zu inaktivieren, falls mit infektiösem Material gearbeitet wird. Abschließend SDS-PAGE durchführen und die Proteine mittels Tank-Blotting bei 80 Volt für 90 Minuten auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen. Gezeigt ist eine repräsentative Western-Blot-Analyse von postnukleären und Lipidtröpfchen-Fraktionen.

Die Western Blot-Analyse zeigt deutlich eine Anreicherung der Lipidtröpfchen-Markerproteine Perilipin zwei und Perilipin drei in den Lipidtröpfchen-Fraktionen sowie eine Verminderung von Markern anderer zellulärer Kompartimente. Postnukleäre und Lipidtröpfchen-Fraktionen können zusätzlich durch Coomassie-Blau- und Silberfärbung analysiert werden. Diese Heatmap veranschaulicht die Anzahl der Peptide und den Prozentsatz der Proteinabdeckung der in den Lipidtröpfchen-Fraktionen der analysierten Zellen identifizierten Proteine.

Die endgültige Wärmekarte zeigt, wie sich die HCV-Infektion auf die Lipiddroplet-per-diems verändert. Angereicherte lipiddropletassoziierte Proteine sind rot markiert, und verarmte lipiddropletassoziierte Proteine sind blau markiert. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass wir die Zellen vor der Isolierung und vor der Lipiddroplet-Isolierung mischen und somit Fehler minimieren können, die während der Zelllyse und während der Isolierungsschritte auftreten können.