Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist die Genotypisierung von CRISPR/Cas9-induzierten Insertionsdeletionsmutanten-Klonen in einer Hochdurchsatz-Weise. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Genetik zu beantworten, wie z. B. den phänotypischen Effekt des Ausschaltens eines bestimmten Gens in einem SAIL-Modell der Wahl. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es ein Screening mit minimalem bis hohem Durchsatz gibt, das multiflexibel ist.

Obwohl diese Methode Einblicke in die menschliche Krebsgenetik geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Mensch, Stamm- und Primärzelle oder Zellen nicht-menschlichen Ursprungs angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir kurze Tandem-Repeats oder STR-Typisierungsassays durchführten. Um das Verfahren zu beginnen, transfizieren Sie die ausgewählten Zellen mit einem Plasmid, das eine fluoreszierende Markierung cas9 und die Single-Guide-RNA co-exprimiert.

Trypsinisieren Sie die Zellen und wählen Sie etwa 3.500 fluoreszenzmarkierte Klone aus. Verteilen Sie die Klone in Portionen von 500, 1.000 und 2.000 Zellen auf 10-Zentimeter-Schalen in acht Millilitern Penicillin-Streptomycin-supplementiertem Wachstumsmedium. Inkubieren Sie die Zellen in einer Atmosphäre von 5 % CO2 bei 37 Grad Celsius und tauschen Sie das Medium alle fünf Tage aus, bis einzelne Zellkolonien mit bloßem Auge sichtbar sind.

Aspirieren Sie dann einzelne Kolonien in eine 200-Mikroliter-Pipette mit etwa fünf Mikrolitern Wachstumsmedium. Bringen Sie jedes Volk in eine separate Vertiefung mit 200 Mikrolitern Wachstumsmedium. Pipettieren Sie jede Mischung wiederholt auf und ab, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Inkubieren Sie die Zellen unter den zuvor beschriebenen Bedingungen, bis die Zellen eine Konfluenz von 50 bis 90 % erreichen. Entfernen Sie überschüssiges Kulturmedium aus den Vertiefungen und geben Sie 25 Mikroliter 0,05 % Trypsin-EDTA ohne Phenolrot in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 7 Minuten.

Pipettieren Sie dann die Mischungen wiederholt auf und ab, um die trypsinisierten Zellen wieder zu suspendieren. Untersuchen Sie die Vertiefungen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellen von den Vertiefungswänden gelöst haben. Um Replikate der einzelnen Klone vorzubereiten, geben Sie fünf Mikroliter jeder Zellsuspension auf eine leere 96-Well-Kulturplatte.

Gib 200 Mikroliter Wachstumsmedium in jede Vertiefung. Beladen Sie dann die Wells einer leeren 96-Well-PCR-Platte mit 10 Mikrolitern Lysepuffer. Übertragen Sie weitere fünf Mikroliter jeder Zellsuspension auf diese 96-Well-Platte.

Zentrifugieren Sie die Platte kurz, bis sich die Flüssigkeit am Boden der Vertiefungen absetzt. Fügen Sie 200 Mikroliter Wachstumsmedium zu den restlichen 15 Mikrolitern jeder Zellsuspension hinzu. Lagern Sie die ursprüngliche Suspension und die Replikate unter den Inkubationsbedingungen, um den Knockout-Status der Klone später zu überprüfen.

Nutzen Sie dann die thermischen Zyklen, um die Zellen in Lysepuffer vollständig zu lysieren. Die Lysate kurz zentrifugieren. Verdünnen Sie die Lysate mit 40 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser.

Die verdünnten Lysate vortexen und kurz zentrifugieren. Bevor Sie die Fluoreszenz-PCR durchführen, entwerfen und testen Sie die Spezifität mehrerer Paare unmarkierter Primer auf lysierten Wildtyp-Zellen. Identifizieren Sie das optimale Primerpaar und erhalten Sie die mit Fluorophoren markierten Forward-Primer und den unmarkierten Reverse-Primer.

Achten Sie darauf, die Spezifität der Primer mit Vortex-Zellen zu testen, lysieren Sie mit dem hausgemachten Lysepuffer, da die Ergebnisse bei der Verwendung von gereinigter genomischer DNA variieren können. Führen Sie unter Verwendung der markierten Primer 20-Mikroliter-Fluoreszenz-PCR-Reaktionen mit drei Mikrolitern der verdünnten Lysate durch, um die Zielregionen zu amplifizieren. Beurteilen Sie die Größe und die relativen Mengen der PCR-Amplikons, indem Sie fünf Mikroliter der Amplikons auf einem 1%-Agarose-Gel auflösen.

Um mit der Probenvorbereitung zu beginnen, verwenden Sie nukleasefreies Wasser, um Amplikons von Wildtyp- und CRISPR/Cas9-Ziel-DNA auf eine ungefähre Konzentration von 2,5 Nanogramm pro Mikroliter zu verdünnen. Mischen Sie gleiche Volumina der verdünnten Wildtyp- und Ziel-DNA-Proben. Bestücken Sie die Vertiefungen einer 96-Well-PCR-Platte mit neun Mikrolitern einer 29-zu-1-Mischung aus deionisiertem Formamid und Farbstoff mit markiertem Größenstandard und einem Mikroliter der gemischten Amplikons.

Verschließen Sie die Platte fest und erhitzen Sie die Proben mit einem PCR-Thermocycler drei Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Unmittelbar nach dem Erhitzen den Teller drei Minuten auf Eis abkühlen lassen. Führen Sie eine Kapillargelelektrophorese mit einem genetischen Analysator durch.

Nachdem die Elektrophorese abgeschlossen ist, importieren Sie die Daten in die Analysesoftware und zeichnen Sie die Daten auf. Überprüfen Sie die Qualität des Größenstandards, indem Sie die Daten im entsprechenden Färbekanal überprüfen. Exportieren Sie dann die Farbkanalwerte für die Wildtype-Steuerelemente ohne Ziel und die Zielklonen im txt-Format.

Importieren Sie aus dieser Datei die Farbstoffidentitäten, die Namen der Probendateien, die Fragmentgrößen und die Spitzenhöhenwerte in eine Tabellenkalkulationssoftware. Berechnen Sie die Differenz in der Fragmentgröße zwischen dem Zielklon und dem Wildtyp-Steuerelement ohne Ziel in jeder Stichprobe. Identifizieren Sie die Klone mit Indel-Mutationen, die keine Vielfachen von drei Basenpaaren sind.

Erweitern Sie die ausgewählten Klone aus den gespeicherten Replikaten seriell. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung und eine westliche Blutanalyse durch, um die Klongenotypen zu bestimmen und den Knockout-Status der Klone zu überprüfen. Die hepatozelluläre Karzinomzelllinie HEPG2 wurde mit einem CRISPR/Cas9-Konstrukt gegen das Nap1L1-Gen gerichtet.

Die un-gezielten Wildtyp-Allele und die CRISPR/Cas9-gerichteten Allele wurden PCR-amplifiziert unter Verwendung von Primern, die mit grünen bzw. blauen Fluorophoren markiert waren. Durch die Verwendung eines spezifisch optimierten Fluoreszenz-PCR-Protokolls konnten die Amplikons der Zielklone in guter Ausbeute gewonnen werden. Es wurde keine Interferenz zwischen den grünen und blauen Fluoreszenzfarbstoffen in Proben einzelner Klone beobachtet.

Die Analyse der Fragmentgrößen, die mittels Kapillargelelektrophorese bestimmt wurde, ergab die Deletion von einem und 10 Basenpaaren aus den beiden hier gezeigten Klonen. Die Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung stimmten mit der Kapillargelelektrophorese-Analyse überein. Westliche Blutanalysen bestätigten, dass die ausgewählten Klone kein NAP1L1 exprimierten.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Proben sorgfältig zu markieren, da es sich um viele Proben handelt, und auch die Belichtungszeit Ihres Fluorophor-Markierungsamplikons zu minimieren, da sie lichtempfindlich sind. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die quantitative RT-PCR, die westliche Blutanalyse und die Sanger-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche Gene von Interesse sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CRISPR/Cas9-induzierte mutierte Klone mit Hilfe von Fluoreszenz-PCR, gekoppelt an Kapillargelelektrophorese, im Hochdurchsatz genotypisiert.