Name: Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Lernen Sie eine Hochdurchsatz-Genotypisierungsmethode für CRISPR/Cas9-Knockout-Mutanten mittels Fluoreszenz-PCR und Kapillar-Gelelektrophorese. Diese kostengünstige Technik ermöglicht effiziente genetische Analysen.

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Die Autoren möchten sich Frau Tan Shi Min, Frau Helen Ong, und Dr. Zhao Yi für die Hilfe bei der Kapillar-Elektrophorese-Experimente danken. Diese Arbeit wurde von NMRC / IRG gewährt NMRC / 1314/2011 und MOE ACRF Tier-2-Fonds Zuschuss MOE2011-T2-1-051 unterstützt.

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<li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861(2012).</li>
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<li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157(2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das Ausschlagen eines spezifischen Gens in einem Modell-Zelllinie der Wahl ist zur Routine geworden, die Rolle für die Aufklärung, dass das Gen in diesem bestimmten zellulären Kontext spielt. In der Tat sind einige genomweite Bildschirme zur Zeit zur Verfügung , die die CRISPR / Cas9 System verwenden nahezu alle bekannten menschlichen Genen in das Genom 14 zielen, 15, 16. Mit diesen großflächigen Bildschirmen (oder sogar kleinr...

Reverse genetische Ansätze erlaubt haben Wissenschaftler die Auswirkungen von spezifischen Veränderungen im Genom auf der Zelle oder ganzen Organismus aufzuklären. Zum Beispiel kann die Expression eines bestimmten Gens durch Knock-Down 1, 2 (teilweise Reduktion) oder Gen - Knockout - 3, 4 (vollständige Ablation), um den Effekt zu bestimmen , abgeschwächt wird , dass diese auf der Funktion der Zelle oder auf der Entwicklung des Organismus. Gen-Knockout-Versuche haben sich einfacher, da die Einführung von sequenzspezifischen programmierbaren Nukleasen, wie beispielsweise Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs) und Transkriptions-Aktivator-like-Effektor Nukleasen (TALENS). die relativ neue Charakterisierung des gruppierte jedoch regelmäßig kurze Palindrom-Wiederholung (CRISPR) / Cas9 System hat es extrem einfach für jedes Labor auf der ganzen Welt durchzuführen gen setztee-Knockout-Experimente. Im Wesentlichen besteht die CRISPR / Cas9 System aus zwei wesentlichen Komponenten eines einzigen Führungs-RNA (sgRNA), die über die Basis Komplementarität zu einer bestimmten Sequenz in dem Genom und binden erkennt, und eine Endonuclease Cas9 genannt. Die Folgen der spezifischen Bindung und Wirkung des sgRNA-Cas9 Komplexes auf genomische DNA ist die Doppelstrang-Spaltung von DNA. Dies wiederum löst den DNA-Schadensantwort-Mechanismus in der Zelle, die anschließend über die nicht-homologen end-joining (NHEJ) oder homologe Rekombination (HR) Wege repariert wird. Da der NHEJ Reparaturmechanismus (aber nicht der HR-Mechanismus) häufig in der zufälligen Insertion oder Deletion von Nukleotiden an der Stelle der Reparatur führt, was zu einer Insertion / Deletion (indel) Mutationen, kann es der Leserahmen eines Exons führen zu verschieben. Dies kann in den Knockout des Gens durch vorzeitige Termination der Translation und Nonsense-vermittelten Zerfalls 5, 6 ergeben sich dann,7. Trotz der Bequemlichkeit durch die Einführung des CRISPR / Cas9 Systems liefert in Klopfen ein Gens aus der Genotypisierung von Klonen von Zielzellen bleibt ein Engpass, insbesondere in einem Hochdurchsatz - 8 Einstellung 9. Bestehende Techniken entweder leide große inhärente Einschränkungen oder sind finanziell kostspielig. Zum Beispiel kann der Vermesser oder T7E1 Assay, der ein enzymatischer Assay, das Fehlpaarungen in DNA erkennt Duplexen 10 ist nicht in der Lage zwischen Wildtyp- Klone und homozygoten Mutanten (Klone , deren Allele mutiert sind identisch), da diese Klone haben identische Allele und damit zu unterscheiden stellt keine Fehlpaarungen in ihrer DNA - Sequenz 11. Darüber hinaus ist die Verwendung von Sanger-Sequenzierung, die der Goldstandard in der Genotypisierung mutierten Klone betrachtet wird, in einem Hochdurchsatzaufbau ist nicht wünschenswert, aufgrund seiner hohen Kosten. Hier präsentieren wir eine detailed Protokoll der fluoreszierenden PCR-Kapillar-Gelelektrophorese-Technik, die die Grenzen der anderen vorhandenen Genotypisierung Techniken umgehen kann, und ist besonders nützlich, um einen Hochdurchsatz-Bildschirm von Nuklease-vermittelte Knockout-Klone in der Durchführung. Dieses Verfahren ist technisch einfach durchzuführen und spart Zeit und Kosten.

<table><tbody><tr><td>HEPG2-Zellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP</td><td>Plasmid Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5 %), kein Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122 HyClone-Wasser</td><td></td></tr><tr><td>, Molekularbiologie-Qualität</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30538,02</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA-Insert-Oligonukleotid (Sense)</td><td>AITbiotech</td><td>None Sequenz</td><td>: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR</td></tr> <tr><td>sgRNA Insert-Oligonukleotid (Anti-Sense)</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>Sequenz: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'</td></tr> <tr><td>Unmarkierter PCR-Amplifikations-Forward-Primer</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>Sequenz: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; Dieser Primer wird auch zur Sequenzierung von PCR-amplifizierten Allelen verwendet</td></tr><tr><td>6-FAM-markierter fluoreszierender PCR-Forward-Primer</td><td>AITbiotech</td><td>None Sequenz</td><td>: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX-markierter</td></tr> <tr><td>fluoreszierender PCR-Forward-Primer</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>Sequenz: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'</td></tr> <tr><td>Unmarkierter PCR-Reverse-Primer</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>Sequenz: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq</td></tr> <tr><td>PCR Core Kit</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di Formamid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ Farbstoffgröße Standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optische 96-Well-Reaktionsplatte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3500xL Genetic Analysator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4405633</td><td></td></tr><tr><td>3500 Serie 2 Programm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5 Programm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Kit</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 Antikörper ( N-term)</td><td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Matrix Protein p84 Antikörper [5E10]</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Kaninchen</td><td>IgG Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Schafe Anti-Maus IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

mit hilfe eines fluoreszenz-pcr-kapillar-gel-elektrophorese-technik crispr zum genotyp / cas9 vermittelte knock-out mutanten in einem hochdurchsatz-format

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Die Entwicklung von programmierbaren genom Editing-Tool hat die Verwendung von Reverse Genetik erleichtert die Rollen spezifische genomischen Sequenzen spielen in der Funktion von Zellen und ganzen Organismen zu verstehen. Diese Ursache wurde durch die kürzliche Einführung des CRISPR / Cas9 system eines vielseitiges Werkzeug, das Forscher ermöglicht zu manipulieren das Genom und Transkriptom, um unter anderem, knock out, knock down, oder Klopfen in Genen in einem gezielten enorm geholfen Weise. Für die Zwecke der Ausschlagen ein Gens, CRISPR / Cas9 vermittelte Doppelstrangbrüche, die nicht-homologe end-joining DNA-Reparaturwegs rekrutieren, um die Frameshift-verursachende Insertion oder Deletion von Nukleotiden an der Bruchstelle einzuführen. Jedoch kann eine einzelne Führungs RNA unerwünschte Nebeneffekte verursachen, und diese auszuschließen, die Verwendung von mehreren Führungs RNAs notwendig. Diese Vielzahl von Zielen, bedeutet auch, dass ein High-Volume-Screening von Klonen benötigt wird, was wiederum die Verwendung eines ef bittetreichend Hochdurchsatz-Technik, um den Knockout-Klone genotypisieren. Aktuelle Genotypisierung Techniken entweder von inhärenten Einschränkungen leiden oder hohe Kosten entstehen, damit sie nicht geeignet für Hochdurchsatz-Zwecke zu machen. Hier stellen wir detailliert das Protokoll für die Verwendung von Fluoreszenz-PCR, die genomische DNA aus einem rohen Zelllysat als Templat verwendet, und dann die Lösung der PCR-Fragmente über Kapillargelelektrophorese. Diese Technik ist genau genug, um eine Basenpaarunterschied zwischen Fragmenten zu unterscheiden, und somit ist ausreichend, in der Gegenwart oder Abwesenheit einer Rasterverschiebung in der kodierenden Sequenz des Zielgens anzeigt. Diese genaue Kenntnis schließt effektiv die Notwendigkeit für eine bestätigende Sequenzierung Schritt und ermöglicht es Benutzern, Zeit und Kosten in den Prozess zu speichern. Darüber hinaus hat diese Technik in Genotypisierung verschiedene Säugetierzellen verschiedenen Gewebe Ursprünge durch Führungs RNAs gegen zahlreiche Gene gezielt zu vielseitig erwiesen, wie hier und anderswo gezeigt.

Die fluoreszierende PCR-Kapillargelelektrophorese hier beschriebene Technik wird erwartet, zu jedem Ziel ausrichtbare Region in dem Genom in praktisch jede Zelllinie anwendbar zu sein, der fremden DNA-Lieferung zugänglich ist. Wir haben zuvor gezeigt , durch seine Anwendung 12 drei Gene in einer kolorektalen Krebszelllinie Targeting. Hier zeigen wir seine Wirksamkeit eine hepatozelluläres Karzinom-Zelllinie in Genotypisierung, HEPG2, mit einem CRISPR gezielten / C...

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, Insertions-Deletions-Mutantenklone, die durch CRISPR/Cas9 induziert wurden, hochdurchsatzfähig zu genotypisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Genetikbereich zu beantworten, beispielsweise welchen phänotypischen Effekt das Ausschalten eines bestimmten Gens in einem gewählten SAIL-Modell hat. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine nahezu beliebige Skalierung von geringem bis hin zu hohem Durchsatz möglich ist und sie multiflexibel ist.Obwohl diese Methode Einblicke in die Genetik menschlicher Krebserkrankungen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, wie zum Beispiel menschliche, Stamm- und primäre Zellen oder Zellen nichtmenschlichen Ursprungs. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir Analysen zur Typisierung kurzer tandemrepetitiver Sequenzen (STR) durchführten. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die ausgewählten Zellen mit einem Plasmid transfectieren, das gleichzeitig ein fluoreszierendes Markermolekül, Cas9, und die einzelsträngige Leit-RNA exprimiert.Vernunzen Sie die Zellen und wählen Sie etwa 3.500 fluoreszenzmarkierte Klone aus. Säen Sie die Kl

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CRISPR/Cas9 ist ein robustes System, um Störungen von Genen und genetischen Elementen zu erzeugen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung genomischer Deletionen in Säugetierzelllinien mittels CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

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Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Optimierung der CRISPR-Cas9 um eine höhere Spezifität verlustfrei auf-Aktivität zu erreichen. Wir verfolgen einen gerichteten Evolution genannt Sniper-Bildschirm, um einen Mutant Cas9 mit den gewünschten Eigenschaften zu finden. Sniper-Cas9 ist kompatibel mit gekürzten Single-Guide RNAs und Lieferung in einem Ribonucleoprotein Format, bekannte Strategien zur Erreichung höherer Besonderheiten.

Verwendung von Sniper-Cas9, Off-Target Auswirkungen von CRISPR-Cas9 ohne den Verlust der Zielaktivität durch gerichtete Evolution

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

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CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

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Erzeugung von maternalen Mutanten mit zpc:cas9 Knock-in-Zebrafisch

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Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format (Video) | JoVE Journal

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

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