Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, Insertions-Deletions-Mutantenklone, die durch CRISPR/Cas9 induziert wurden, hochdurchsatzfähig zu genotypisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Genetikbereich zu beantworten, beispielsweise welchen phänotypischen Effekt das Ausschalten eines bestimmten Gens in einem gewählten SAIL-Modell hat. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine nahezu beliebige Skalierung von geringem bis hin zu hohem Durchsatz möglich ist und sie multiflexibel ist.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Genetik menschlicher Krebserkrankungen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, wie zum Beispiel menschliche, Stamm- und primäre Zellen oder Zellen nichtmenschlichen Ursprungs. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir Analysen zur Typisierung kurzer tandemrepetitiver Sequenzen (STR) durchführten. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die ausgewählten Zellen mit einem Plasmid transfectieren, das gleichzeitig ein fluoreszierendes Markermolekül, Cas9, und die einzelsträngige Leit-RNA exprimiert.

Vernunzen Sie die Zellen und wählen Sie etwa 3.500 fluoreszenzmarkierte Klone aus. Säen Sie die Klone portionsweise mit jeweils 500, 1.000 und 2.000 Zellen auf 10-Zentimeter-Platten in acht Milliliter Wachstumsmedium, das mit Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde. Inkubieren Sie die Zellen bei 5 % CO₂ und 37 Grad Celsius und erneuern Sie das Medium alle fünf Tage, bis einzelne Zellkolonien mit bloßem Auge sichtbar sind.

Aspirieren Sie anschließend einzelne Kolonien mit etwa fünf Mikrolitern Wachstumsmedium in eine 200-Mikroliter-Pipette. Überführen Sie jede Kolonie in eine separate Vertiefung, die 200 Mikroliter Wachstumsmedium enthält. Pipettieren Sie jedes Gemisch mehrfach auf und ab, um die Zellen erneut zu suspendieren.

Die Zellen unter den zuvor beschriebenen Bedingungen inkubieren, bis sie eine Konfluenz von 50 bis 90 % erreichen. Überschüssiges Kulturmedium von den Vertiefungen entfernen und 25 Mikroliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung ohne Phenolrot zu jeder Vertiefung hinzufügen. Die Zellen 7 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Pipettieren Sie die Gemische anschließend mehrmals auf und ab, um die trypsinierten Zellen erneut in Suspension zu bringen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen sich von den Wandungen der Vertiefungen gelöst haben. Um Replikate der einzelnen Klone vorzubereiten, übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Zellsuspension in eine leere 96-Well-Kulturplatte.

Geben Sie 200 Mikroliter Wachstumsmedium in jede Vertiefung. Füllen Sie anschließend die Vertiefungen einer leeren 96-Loch-PCR-Platte mit jeweils 10 Mikrolitern Lysepuffer. Übertragen Sie weitere fünf Mikroliter jeder Zellsuspension in diese 96-Loch-Platte.

Zentrifugieren Sie die Platte kurz, bis die Flüssigkeit am Boden der Vertiefungen gesammelt ist. Geben Sie 200 Mikroliter Wachstumsmedium zu den verbleibenden 15 Mikrolitern jeder Zellsuspension hinzu. Lagern Sie die ursprüngliche Suspension und die Replikate unter den Inkubationsbedingungen, um später den Knockout-Status der Klone zu überprüfen.

Verwenden Sie anschließend den Thermocycler, um die Zellen vollständig im Lysepuffer zu lysieren. Zentrifugieren Sie die Lysate kurz. Verdünnen Sie die Lysate mit 40 Mikroliter nukleasefreiem Wasser.

Vortexen und kurz zentrifugieren Sie die verdünnten Lysate. Entwerfen und testen Sie vor der Durchführung der fluoreszierenden PCR mehrere Paare unmarkierter Primer an lysierten Wildtyp-Zellen, um deren Spezifität zu überprüfen. Identifizieren Sie das optimale Primer-Paar und beschaffen Sie den mit einem Fluorophor markierten Vorwärtsprimer sowie den unmarkierten Rückwärtsprimer.

Stellen Sie sicher, die Spezifität der Primer unter Verwendung von Vortex-Zellen zu testen und lysieren Sie mit dem selbst hergestellten Lysepuffer, da die Ergebnisse bei Verwendung von gereinigter genomischer DNA abweichen können. Führen Sie mit den markierten Primern 20-Mikroliter-Fluoreszenz-PCR-Reaktionen mit drei Mikrolitern der verdünnten Lysate durch, um die Zielbereiche zu amplifizieren. Bewerten Sie die Größe und relativen Mengen der PCR-Amplifikate, indem Sie fünf Mikroliter der Amplifikate auf einem 1%-Agarosegel auftrennen.

Um die Probenvorbereitung zu beginnen, verdünnen Sie Amplikone aus Wildtyp- und CRISPR/Cas9-gezielte DNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine ungefähre Konzentration von 2,5 Nanogramm pro Mikroliter. Mischen Sie gleiche Volumina der verdünnten Wildtyp- und gezielten DNA-Proben. Geben Sie in die Vertiefungen einer 96-Loch-PCR-Platte jeweils neun Mikroliter einer 29 zu 1-Mischung aus deionisiertem Formamid und farbstoffmarkiertem Größenstandard sowie ein Mikroliter der gemischten Amplikone.

Das Plate fest verschließen und die Proben mit einem PCR-Thermocycler bei 95 Grad Celsius drei Minuten lang erhitzen. Unmittelbar nach dem Erhitzen das Plate drei Minuten auf Eis abkühlen lassen. Die kapillare Gelelektrophorese mit einem Genanalysator durchführen.

Nach Abschluss der Elektrophorese die Daten in eine Analyse-Software importieren und darstellen. Überprüfen Sie die Qualität des Größenstandards, indem Sie die Daten im entsprechenden Farbstoffkanal überprüfen. Anschließend exportieren Sie die Werte des Farbstoffkanals für die nicht gezielten Wildtyp-Kontrollen und die gezielten Klone im txt-Format.

Aus dieser Datei die Farbstoff-Identitäten, Probendateinamen, Fragmentgrößen und Peakhöhenwerte in eine Tabellenkalkulationssoftware importieren. Berechnen Sie den Unterschied in der Fragmentgröße zwischen dem gezielten Klon und der ungezielten Wildtyp-Kontrolle in jeder Probe. Identifizieren Sie die Klone mit Indel-Mutationen, die keine Vielfachen von drei Basenpaaren sind.

Vergrößern Sie die ausgewählten Klone schrittweise aus den gespeicherten Replikaten. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung und eine westliche Blot-Analyse durch, um die Genotypen der Klone zu bestimmen und den Knockout-Status der Klone zu verifizieren. Die hepatozelluläre Karzinomzelllinie HEPG2 wurde mit einem CRISPR/Cas9-Konstrukt gegen das Nap1L1-Gen gezielt bearbeitet.

Die nicht gezielten Wildtyp-Allele und die CRISPR/Cas9-gezielten Allele wurden mittels Primer, die mit grünen bzw. blauen Fluoreszenzfarbstoffen markiert waren, per PCR amplifiziert. Durch Verwendung eines spezifisch optimierten fluoreszenzbasierten PCR-Protokolls wurden die Amplifikate der gezielten Klone in guter Ausbeute erhalten. Es wurde keine Interferenz zwischen den grünen und blauen Fluoreszenzfarbstoffen in Proben einzelner Klone beobachtet.

Die Analyse der Fragmentgrößen, bestimmt mittels kapillarer Gelelektrophorese, zeigte eine Deletion von einer bzw. zehn Basenpaaren in den hier gezeigten beiden Klonen. Die Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung stimmten mit der Analyse der kapillaren Gelelektrophorese überein. Eine Blutuntersuchung bestätigte, dass die ausgewählten Klone NAP1L1 nicht exprimierten.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Proben sorgfältig zu kennzeichnen, da viele Proben beteiligt sind, und außerdem die Belichtungszeit der mit Fluorophor markierten Amplifikate zu minimieren, da diese lichtempfindlich sind. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie quantitative Echtzeit-PCR, Western-Blot-Analyse und die Sanger-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Gene von Interesse sind oder vollständig ausgeschaltet wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CRISPR/Cas9-induzierte mutante Klone hochdurchsatzfähig mittels fluoreszenter PCR gekoppelt an kapillare Gelelektrophorese genotypisieren kann.