Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten zu dissociieren und sie auf Multielektrodenarrays zu platzieren, um Dauer und Frequenz ihres typischen elektrischen Signals – auch Feldpotential genannt – zu messen und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Fachgebiet zu beantworten, beispielsweise welche elektrophysiologischen Unterschiede zwischen Kardiomyozyten mit Mutationen und Kontrollen bestehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Wirkstoffprüfung an humanen Kardiomyozyten ermöglicht, die aus Patientenzellen stammen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Dissoziations- und Aufzucht-Schritte für eine erfolgreiche Aufzeichnung elektrischer Signale unerlässlich sind. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Identifizierung von elektrischen Signalen guter oder schlechter Qualität nicht trivial ist und die Analyse des freien Potentials Erfahrung erfordert.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die sauberen Chips in eine sterile Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 10 cm geben. Fügen Sie anschließend acht Milliliter sterilem destilliertem Wasser zur Petrischale hinzu, um eine befeuchtete Kammer zu erzeugen, die verhindert, dass das kleine Volumen des Kulturmediums auf dem Chip beim Platzieren im Inkubator austrocknet. Verwenden Sie dann speziell angefertigte PolyTetraFluoroEthylen-Ringe, um sicherzustellen, dass die Kardiomyozyten in der Mitte des Chips platziert werden, wo sich das Elektrodenarray befindet.

Entfernen Sie im Sterilbradschrank die Ringe aus dem Ethanol. Legen Sie sie in eine sterile Petrischale ohne Deckel und lassen Sie die Ringe im Bradschrank trocknen. Anschließend platzieren Sie einen trockenen Ring mit flammengesterilisierten Pinzetten in einen MEA-Chip.

Beschichten Sie die Elektroden, indem Sie 50 Mikroliter einer 40 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin-Lösung innerhalb des Rings hinzufügen. Danach decken Sie die Petrischale mit dem Deckel ab und überführen vorsichtig die Schale mit dem MEA-Chip in einen Inkubator. Anschließend bringen Sie die Schale mit dem MEA-Chip in die Zellkulturhaube.

Bevor Sie den MEA-Chip verwenden, aspirieren Sie 50 Mikroliter Fibronectin mit einer P200-Pipette oder einem Vakuumsystem im Abzug, ohne den PTFE-Ring zu verschieben. Stellen Sie sicher, dass keine festen Gegenstände die Elektroden berühren, indem Sie die Spitze schräg halten. Geben Sie dann vorsichtig 950 Mikroliter LI-BPEL-Medium hinzu, wobei sichergestellt werden muss, dass es gleichmäßig verteilt ist und der Ring nicht schwimmt.

Bringen Sie die Schale anschließend in den Inkubator zurück. Dies ist die Anfangskultur der schlagenden Kardiomyozyten. Aspirieren Sie in einer Zellkulturhaube das Medium aus der Kulturmulde der hPSC-KMs.

Geben Sie ein bis zwei Milliliter PBS ohne Calcium und Magnesiumium in jede Vertiefung, um die Kultur zu waschen, und aspirieren Sie das PBS. Anschließend geben Sie 500 Mikroliter des Dissoziationsenzyms in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Probe 5 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach fünf Minuten ein Milliliter LI-BPEL in jede Vertiefung geben, um das Enzym zu verdünnen. Die monolayerartige Schicht der hPSC-CMs vorsichtig mit einer P1000-Pipette abkratzen. Anschließend die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln.

Spülen Sie die Vertiefung anschließend mit einem Milliliter LI-BPEL, um alle verbleibenden Zellen und Zellklumpen zu gewinnen. Geben Sie weitere zwei bis drei Milliliter LI-BPEL hinzu, um ein Endvolumen von etwa fünf bis sechs Millilitern zu erreichen, und pipettieren Sie vorsichtig drei- bis fünfmal auf und ab mit einer Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellklumpen zu dissoziieren. Danach zentrifugieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur drei Minuten lang mit 300 × g.

Danach den Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu lösen. Anschließend das Zellpellet in 250 Mikrolitern LI-BPEL erneut suspendieren. Danach 50 Mikroliter Zellsuspension pro MEA verteilen, indem die Zellsuspension direkt in die Mitte des PTFE-Rings auf dem Elektrodenarray pipettiert wird.

Überführen Sie die MEAs vorsichtig in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und lassen Sie die Zellen über Nacht anheften. Einen Tag nach der Aussaat entfernen Sie den Ring unter sterilen Bedingungen vorsichtig mit sterilen Pinzetten. Spülen Sie den Ring mit 80 Prozent Ethanol ab.

Und lagern Sie es in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das 80 Prozent frisches Ethanol enthält. Entfernen Sie anschließend vorsichtig 500 Mikroliter Medium aus dem MEA-Chip. Geben Sie 500 Mikroliter frisches LI-BPEL hinzu.

Dies sind die schlagenden Kardiomyozyten nach dem Entfernen des Rings. Anschließend die MEAs in den Inkubator bei 37 Grad Celsius überführen. Danach die elektrische Aktivität der hPSC-KMs auf MEAs beginnend einen Tag nach dem Entfernen des Rings bis zu einer Woche messen.

Starten Sie nun die Software-Suite, die mit dem MEA-System verknüpft ist. Anschließend stellen Sie in TCX-Control die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein, um die Messungen aufzuzeichnen. Danach nehmen Sie die Schale mit dem MEA-Chip aus dem Inkubator heraus.

Nehmen Sie den MEA-Chip aus der Schale und legen Sie ihn auf ein Tuch, um das restliche Wasser aufzusaugen. Wischen Sie vorsichtig die äußeren Bereiche der Platte mit einem Tuch ab und reinigen Sie sie mit einem mit 100 Prozent Ethanol angefeuchteten Wattestäbchen, um restliches Wasser oder Ablagerungen zu entfernen, die Signalrauschen verursachen könnten. Überführen Sie anschließend die MEA-Platte auf eine Aufnahmestufe mit 37 Grad Celsius, um die spontane Aktivität zu erfassen.

Öffnen Sie MC Rack und klicken Sie auf „Bearbeiten“, um die MEA-Hardware zu laden. Um ein neues Protokoll zu erstellen, verwenden Sie das Dropdown-Menü „Bearbeiten“, um verschiedene Aufzeichnungs- und Anzeigefenster zum Protokoll hinzuzufügen. Starten Sie anschließend das Protokoll im Wiedergabemodus, indem Sie auf die Wiedergabetaste klicken.

Falls die Signale sichtbare R-Peaks und deutlich erkennbare T-Peaks aufweisen, warten Sie 10 bis 15 Minuten, um die Adaptationsphase abzuschließen. Um das Experiment zu starten, klicken Sie auf „Aufzeichnen“ und anschließend auf „Wiedergabe“ und erfassen Sie 10 Minuten lang Daten unter Basisbedingungen, um den Ruhezustand zu bestimmen. Markieren Sie die Elektroden mit dem besten Signal, sodass sie später leicht identifiziert und zur Analyse exportiert werden können.

Fügen Sie zur Beurteilung der Arzneimittelwirkung zunehmende Konzentrationen des Arzneimittels alle 10 Minuten hinzu. Klicken Sie auf „Stop“, um die Aufnahme am Ende des Protokolls abzuschließen. Hier sind repräsentative Spuren, die mit einer MEA aufgezeichnet wurden und eine qualitativ hochwertige Spur zeigen, bei der RQ- und T-Peaks mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis deutlich sichtbar sind.

Eine Spur von schlechter Qualität ohne deutlich sichtbare RQ- und T-Peaks und eine verrauschte Spur mit klar sichtbaren RQ- und T-Peaks, jedoch mit geringem Signal-Rausch-Verhältnis. Hier sind repräsentative Beispiele von hochwertigen Feldpotentialspuren mit unterschiedlichen Morphologien, die während MEA-Experimenten mit hPSC-CMs aufgezeichnet werden können. Der schattierte Bereich stellt das QT-Intervall dar, das während der Analyse gemessen wurde.

Da das Feldpotential an der MEA der ersten Ableitung des Aktionspotentials ähnelt, wurde das Integral der Feldpotentialverläufe als theoretische Darstellung der T-Wellen berechnet, die nahe den vollständigen Repolarisationen des Aktionspotentials liegen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine möglichst hohe Anzahl von Elektroden zu verwenden, um zuverlässige und konsistente Signale sicherzustellen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie quantitative tibiale Zeit-PCR oder Einzelzell-Patch-Clamp verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur spezifischen Genexpression im Zusammenhang mit dem elektrischen Phänotyp oder zu spezifischen Ionenstromdichten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Stammzellen den Weg, um Herzrhythmusstörungen und die Pharmakologie in vitro mithilfe von aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane aus pluripotenten Stammzellen abgeleitete Kardiomyozyten für elektrophysiologische Messungen und Wirkstoffscreenings von MEAs abtrennt und auf diese aufbringt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Wirkstoffen äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie den Standard der guten Laborpraxis (GLP), während Sie dieses Verfahren durchführen.