Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Kardiomyozyten, die aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, zu dissoziieren und auf Mehrelektrodenarrays zu plattieren, um die Dauer und die Frequenz ihres typischen elektrischen Signals, auch Feldpotential genannt, zu messen und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf diesem Gebiet zu beantworten, z. B. welche elektrophysiologischen Unterschiede zwischen mutationstragenden Kardiomyozyten und Kontrollen bestehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Wirkstoffscreening an menschlichen Kardiomyozyten ermöglicht, die aus Patientenzellen gewonnen wurden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Denn die Dissoziations- und Beschichtungsschritte sind für eine erfolgreiche elektrische Signalaufzeichnung unerlässlich. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Identifizierung von elektrischen Signalen guter oder schlechter Qualität nicht trivial ist und die Analyse des freien Potentials Erfahrung erfordert.

Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie die sauberen Chips in eine sterile Standard-Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern. Geben Sie als Nächstes acht Milliliter steriles destilliertes Wasser in die Petrischale, um eine befeuchtete Kammer zu bilden, die verhindert, dass das kleine Volumen des Kulturmediums auf dem Chip gezogen wird, wenn es in den Inkubator gelegt wird. Verwenden Sie dann speziell angefertigte Polytetrafluorethylen-Ringe, um die Beschichtung der Kardiomyozyten in der Mitte des Chips sicherzustellen, wo sich das Elektrodenarray befindet.

In der Kulturhaube die Ringe vom Ethanol entfernen. Legen Sie sie in eine sterile Petrischale ohne Deckel und lassen Sie die Ringe in der Haube trocknen. Platzieren Sie dann mit einer flammensterilisierten Pinzette einen Trockenring in einem MEA-Chip.

Beschichten Sie die Elektroden, indem Sie 50 Mikroliter Fibronektin mit 40 Mikrogramm pro Milliliter in den Ring geben. Decken Sie danach die Petrischale mit dem Deckel ab und geben Sie die Schale mit dem MEA-Chip vorsichtig in einen Inkubator. Übertragen Sie anschließend die Schale mit dem MEA-Chip in die Zellkulturhaube.

Vor der Verwendung des MEA-Chips sind 50 Mikroliter Fibronektin mit einer P200-Pipette oder einem Vakuumsystem in der Haube zu aspirieren, ohne den PTFE-Ring zu verschieben. Stellen Sie sicher, dass keine festen Gegenstände die Elektroden berühren, indem Sie die Spitze abgewinkelt halten. Fügen Sie dann vorsichtig 950 Mikroliter LI-BPEL-Medium hinzu und achten Sie darauf, dass es gleichmäßig verteilt ist und der Ring nicht schwimmt.

Stellen Sie die Schale anschließend wieder in den Inkubator. Dies ist die Anfangskultur der schlagenden Kardiomyozyten. Aspirieren Sie das Medium in einer Gewebekulturhaube aus der Kulturvertiefung des hPSC-CMs.

Geben Sie ein bis zwei Milliliter PBS ohne Kalzium und Magnesium in jede Vertiefung, um die Kultur zu waschen und das PBS zu aspirieren. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter des Dissoziationsenzyms in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Probe 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Nach fünf Minuten geben Sie einen Milliliter LI-BPEL in jede Vertiefung, um das Enzym zu verdünnen. Entfernen Sie die Monoschicht der hPSC-CMs, indem Sie sie vorsichtig mit einer P1000-Pipette zerkratzen. Sammeln Sie dann die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie anschließend die Vertiefung mit einem Milliliter LI-BPEL, um alle verbleibenden Zellen und Zellklumpen aufzufangen. Fügen Sie weitere zwei bis drei Milliliter LI-BPEL hinzu, um ein Endvolumen von etwa fünf bis sechs Millimetern zu erreichen, und pipettieren Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig drei- bis fünfmal auf und ab, um Zellklumpen zu dissoziieren. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 mal g.

Entfernen Sie danach den Überstand, ohne das Zellpellet zu entfernen. Anschließend wird das Zellpellet in 250 Mikrolitern LI-BPEL wieder suspendiert. Verteilen Sie anschließend 50 Mikroliter Zellsuspension pro MEA, indem Sie die Zellsuspension direkt in die Mitte des PTFE-Rings auf dem Elektrodenarray pipettieren.

Übertragen Sie die MEAs vorsichtig bei 37 Grad Celsius in den Inkubator und lassen Sie die Zellen über Nacht anheften. Entfernen Sie den Ring einen Tag nach dem Plattieren vorsichtig in einer sterilen Umgebung mit einer sterilen Pinzette. Spülen Sie den Ring mit 80 Prozent Ethanol aus.

Und lagern Sie es in einer 50-Milliliter-Tube mit 80 Prozent frischem Ethanol. Entfernen Sie anschließend vorsichtig 500 Mikroliter Medium aus dem MEA-Chip. Und fügen Sie 500 Mikroliter frisches LI-BPEL hinzu.

Dies sind die schlagenden Kardiomyozyten nach der Ringentfernung. Anschließend werden die MEAs bei 37 Grad Celsius in den Inkubator überführt. Messen Sie dann die elektrische Aktivität von hPSC-CMs auf MEAs ab einem Tag nach der Ringentfernung und bis zu einer Woche.

Starten Sie nun die Software-Suite, die mit dem MEA-Setup verknüpft ist. Stellen Sie anschließend die Temperatur in TCX-Control auf 37 Grad Celsius ein, um die Messungen aufzuzeichnen. Nehmen Sie danach die Schale mit dem MEA-Chip aus dem Inkubator.

Nehmen Sie den MEA-Chip aus der Schale und legen Sie ihn auf ein Taschentuch, um das Restwasser aufzunehmen. Wischen Sie den äußeren Kontext der Platte vorsichtig mit einem Taschentuch ab und reinigen Sie sie mit einem mit 100 Prozent Ethanol angefeuchteten Wattestäbchen, um Wasserreste oder Ablagerungen zu entfernen, die Signalgeräusche verursachen könnten. Übertragen Sie dann die MEA-Platte auf einen 37 Grad Celsius heißen Aufnahmekopftisch, um spontane Aktivität zu erkennen.

Öffnen Sie MC Rack und klicken Sie auf Bearbeiten, um die MEA-Hardware zu laden. Um ein neues Protokoll zu erstellen, verwenden Sie das Dropdown-Menü Bearbeiten, um dem Protokoll verschiedene Rekorder und Anzeigefenster hinzuzufügen. Starten Sie anschließend das Protokoll im Play-Modus, indem Sie auf den Play-Button klicken.

Wenn die Signale deutlich sichtbare R-Peaks und T-Peaks aufweisen, warten Sie 10 bis 15 Minuten, um die Anpassungsphase abzuschließen. Um das Experiment zu starten, klicken Sie auf Aufzeichnen und dann 10 Minuten lang unter den Ausgangsbedingungen wiedergeben und Daten abrufen, um den stabilen Zustand zu bestimmen. Beschriften Sie die Elektroden mit dem besten Signal, damit sie leicht identifiziert und später zur Analyse exportiert werden können.

Für eine Bewertung des Arzneimittelansprechens fügen Sie alle 10 Minuten steigende Konzentrationen des Arzneimittels hinzu. Klicken Sie auf Stopp, um die Aufzeichnung am Ende des Protokolls zu beenden. Hier sind die repräsentativen Leiterbahnen, die mit einem MEA aufgenommen wurden, und zeigen eine gute Kurve mit deutlich sichtbaren RQ- und T-Peaks und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis.

Eine Kurve von schlechter Qualität ohne deutlich sichtbare RQ- und T-Spitzen Und eine verrauschte Kurve mit deutlich sichtbaren RQ- und T-Spitzen, aber mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis. Und hier sind die repräsentativen Beispiele für qualitativ hochwertige Feldpotentialspuren mit unterschiedlichen Morphologien, die während von MEA-Experimenten mit hPSC-CMs aufgezeichnet werden können. Der schattierte Bereich stellt das QT-Intervall dar, das während der Analyse gemessen wurde.

Da das Feldpotential an der MEA der ersten Ableitung des Aktionspotentials ähnelt, wurde das Integral der Feldpotentialspuren als theoretische Demonstration der T-Wellen berechnet, die nahe an den vollständigen Repolarisationen des Aktionspotentials liegen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die höchste Anzahl von Elektroden zu wählen, um zuverlässige und konsistente Signale zu gewährleisten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die quanto-tibiale Zeit-PCR oder die Einzelzell-Patch-Clamp verwendet werden, um zusätzliche Fragen wie die spezifische Genexpression in Bezug auf den elektrischen Phänotyp oder spezifische Ionenstromdichten zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Stammzellen, um Herzrhythmusstörungen und In-vitro-Pharmakologie mit Kardiomyozyten zu erforschen, die aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie humane pluripotente Stammzellabgeleitete Kardiomyozyten auf den MEAs für elektrophysiologische Messungen und das Wirkstoffscreening dissoziiert und plattiert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Medikamenten äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Standard-GLP getroffen werden sollten.