Name: Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Lernen Sie eine nicht-invasive Impression-Cytologie-Technik zur Gewinnung und Immunphänotypisierung von Zellen der okulären Oberfläche. Diese Methode ermöglicht die Analyse von T-Zell-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie.

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Die Autoren bedanken sich bei Nandini Nallappan und Sharon Yeo für die Unterstützung der technischen Schritte. Die Studie wurde von einem Start-Up Grant an KGC von Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University und von einem Senior Clinician Scientist Award von der Singapore Ministerium für Gesundheit National Medical Research Council (NMRC) an LT (NMRC / CSA / 045/2012) und durch einen Zuschuss aus dem NMRC und verwaltet vom National Health Innovation Center an KGC und LT (NHIC-12D-1409007).

Alle okulären Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von der Dry Eye Clinic in der Singapore National Eye Center von SingHealth Centralized Institutional Review Board und der Nanyang Technological University Institutional Review Board, Singapur genehmigt gesammelt. HINWEIS: Die Probanden wurden klinischen Tests unterzogen, um das Ausmaß der Entzündung und die Schwere der Tränenfunktionsstörung zu beurteilen, bevor IC durchgeführt wurde. Klinische Tests beinhalteten die nicht-invasive Tränen-Auffrischungszeit (NI-TBUT) 14 und die Konjunktival-Rötung (Hyperämie) 15 , 16 mit einem diagnostischen Instrument, Schirmer-Test 17 , Standard Patient Evaluation of Eye Dryness (SPEED) Fragebogen 18 und Hornhaut Färbung 19 1. Sammlung von Okularproben durch IC <ol><li> Nach der Bestimmung des klinischen Status, anästhesierenDie Augen des Teilnehmers durch Anwendung von 1 - 2 Tropfen der topischen Anästhesie, Proparacainhydrochlorid, auf die überlegene bulbäre Konjunktiva und minderwertige Fornix. Warten Sie für 4 - 5 min für die stechende Empfindung des Anästhetikums zu tragen. </li><li> Sammeln Sie Proben von sowohl nasalen als auch zeitlichen bulbären Konjunktiva mit zwei Impressionszytologiegeräten. HINWEIS: Ein Gerät wird für die Sammlung von zwei Impressionsmustern verwendet. Hier wurden zwei Geräte für die Sammlung von vier Impressionsmembranen verwendet. <ol><li> Positioniere das Eindruckzytologiegerät tangential auf die Bindehaut. Drücken Sie den Druckknopf vorsichtig und halten Sie ihn für 2 - 3 s. HINWEIS: Das Gerät kommt mit der Membran. Der Druck wird nach dem Drücken der Taste automatisch freigegeben. Es dauert nur wenige Sekunden, um den Druck freizugeben und das Gerät zu entfernen. </li></ol></li><li> Die Membran wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 1 ml Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) + 10% fötales Rinderserum enthält(FBS) + 1% Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)) durch ein Skalpell. </li><li> Isoliere Zellen von der Membran des Gerätes durch kontinuierliches Schaben für etwa 1 min mit einer 10 μl Pipettenspitze. HINWEIS: Das Schaben ist abgeschlossen, wenn die Oberfläche der Membran uneben wird. Die Zellzahlen aus jeder Membran sind variabel (100 - 500 Zellen / Membran). Verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 2 - 3 Stunden der Sammlung. </li></ol> 2. Immunphänotypisierungszellen durch Durchflusszytometrie <ol><li> Die Zellen bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, um das Medium zu entfernen. Das Zellpellet wird mit 50 μl Durchflusszytometrie-Färbepuffer (phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) + 0,05% Rinderserumalbumin (BSA) resuspendiert. </li><li> (PEC) -H7 (APC-H7) (SK3), CCR7-Phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE-Cyanin 7 (PE- &amp; sub1; &amp; sub0;), Cy7) -A und lebend / tote Zellmarke 7-ADD) bei Raumtemperatur für 20 - 30 min in derdunkel. Verwenden Sie Antikörper direkt aus dem Bestand nach dem Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Für die Antikörperkonzentration werden 2,5 μl CD3-BV510, 1,25 μl CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD und 10 μl CCR7-PE verwendet. Verwenden Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs), um die verschiedenen Konzentrationen von Antikörpern zu titrieren. Für die Titration nehmen Sie die im Protokoll des Herstellers erwähnte Antikörperkonzentration und verwenden ein halbes und ein Viertel der empfohlenen Konzentration. Verwenden Sie die minimale Konzentration von Antikörpern, um das Überlaufen auf andere Fluorochrom-Kanäle zu vermeiden. Es wurden klare Signale mit den erwähnten Konzentrationen von Antikörpern beobachtet. Die Kompensation wurde durchgeführt, indem PBMCs zunächst nach dem in Williams et al . 20 Zum Testen wurden PBMCs mit demselben Satz von Antikörpern inkubiert, die hier verwendet wurden und durch Vergleich einzelner und mehrfacher Antikörperflecken kompensiert wurden. </li><li> Nach der Inkubation periOd, fügen Sie 1 ml Färbepuffer zum Röhrchen hinzu, mischen Sie gut und zentrifugieren Sie bei 450 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Zellen in 200 μl Färbepuffer resuspendieren. </li><li> Führen Sie Proben auf einer Durchflusszytometrie Maschine. <ol><li> Bevor Sie die Daten erfassen, kalibrieren Sie die Durchflusszytometer-Kanalspannungen mit Zytometer-Setup und Tracking (CS &amp; T) Perlen, um die Datenerfassung an verschiedenen Tagen nach den Anweisungen des Herstellers zu normalisieren. <ol><li> Öffnen Sie die Durchflusszytometrie Datenerfassungssoftware, klicken Sie auf &quot;Setup &amp; QC&quot; -Taste, wählen Sie die richtige CS &amp; T Perle Losnummer, laden Sie die Perlen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche &quot;Start&quot;. </li></ol></li><li> Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen vorsichtig klopfen, bevor Sie Proben auf die Maschine legen. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware und klicken Sie auf &quot;Vorschau&quot;. Wenn die Schwellenrate stabil ist, klicken Sie auf &quot;Acquire&quot;. Überwachen Sie den Sample Level und klicken Sie auf &quot;Stop&quot;, wenn die Samples ausgehen. HINWEIS: Erwerb von 10.000 Veranstaltungen pro Probe. </lI&gt; <li> Nach dem Erwerb von 10.000 Ereignissen generiere ein SSC-A- und FSC-A-Punkt-Plot im Arbeitsblatt. <ol><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Polygon-Tor&quot; und ziehen Sie ein Tor (dies ist P1) über alle Ereignisse mit einem FSC-A-Wert&gt; 5 x 10 4 , um Schutt auszuschließen. Klicken Sie auf &quot;Create dot plot&quot; -Taste, um ein neues Punkt-Diagramm zu erstellen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Punkt-Blot, wählen Sie &quot;Eigenschaften&quot;, um das Fenster &quot;Plot-Editor&quot; zu öffnen und dann &quot;P1&quot; zu wählen. Klicken Sie auf die FSC-A auf der X-Achse des P1-Punkt-Plots, ändern Sie sie auf CD3-BV510. Zeichnen Sie ein &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39;, um die CD3 + Population zu wählen und nennen Sie &#39;&#39; P2 &#39;&#39;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Create dot plot&quot; -Taste, um ein neues Punkt-Plot zu erzeugen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dot-Blot, wählen Sie &quot;Eigenschaften&quot;, um das Fenster &quot;Plot-Editor&quot; zu öffnen. Klicken Sie auf die FSC-A auf der x-Achse des P2-Punkt-Plots und ändern Sie sie auf 7-AAD. Zeichne ein &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39; für 7-AAD-Population und wähle &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 hier ist CD3 +Lebende Zellen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Create dot plot&quot; -Taste, um ein neues Punkt-Plot zu erzeugen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dot-Blot, wählen Sie &quot;Eigenschaften&quot;, um das Fenster &quot;Plot-Editor&quot; zu öffnen. Klicken Sie auf CD3-BV510 auf x-Achse und CD4-APCH7 auf y-Achse des P3-Punkt-Plots. Zeichnen Sie Rechteck-Gates auf der oberen und unteren Seite des Quadranten und wählen Sie &#39;&#39; P4 &#39;&#39; bzw. &#39;&#39; P5 &#39;&#39;. P4 ist live CD3 + CD4 + und P5 ist Live CD3 + CD4 - T Zellen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Create dot plot&quot; -Taste, um ein neues Punkt-Plot zu erzeugen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dot-Blot, wählen Sie &quot;Eigenschaften&quot;, um das Fenster &quot;Plot-Editor&quot; zu öffnen. Klicken Sie auf die CD45RO PE-Cy7 auf der x-Achse und CCR7-PE auf der y-Achse der P4- und P5-Plots. Zeichnen Sie &#39;&#39; Quad Gate &#39;&#39; auf diesem Punkt Plot. HINWEIS: Obere linke Seite, obere rechte Seite, untere rechte Seite und untere linke Quadranten hier sind naiv, zentraler Speicher (T CM ), eFfector-Speicher (T EM ), endlich differenzierte Effektor-Speicher (T EMRA ) T-Zellen. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Dies ist eine einfache, schnelle und weniger invasive Technik, die in den ambulanten Kliniken für eine relativ schnelle Immunprofile verwendet werden kann, im Gegensatz zu den herkömmlichen Techniken wie Schaben, Tupfen, Pipettieren oder Absorbieren von Filterpapier 1 , 2 . Eine Variante dieser Technik wird bereits in Forschungseinrichtungen verwendet 22 . Die künftige Anwendung der vorgeschlagenen Methodik ist die Patientenschichtung in klinischen Studien mit Augenkrankheiten, insbesondere solchen, die eine Immunophenotypisierung erfordern. Eine große Herausforderung bei dieser Technik sind die relativ wenigen Immunzellen, die nach der Eindrucksammlung und dem Schaben wiedergewonnen wurden. Die Gesamtzahl der CD3 + T-Zellen, die aus vier Impressionen pro Individuum gewonnen wurden, variierte von ~ 500 - 1.000 Zellen. Die okulären Proben wurden vor der Durchflusszytometrieanalyse für eine minimale Anzahl von Zeiten gewaschen, um einen weiteren Verlust der Zelle zu vermeidenS. Kritische Schritte und Herausforderungen, die innerhalb des Protokolls bleiben, sind eine effiziente Sammlung von Okularproben und ein korrektes Abkratzen der Membran, um höhere Zellzahlen zu erreichen. Trotzdem ist es unwahrscheinlich, dass diese Einschränkung auf einen bestimmten Immungyp-Phänotyp hindehnt. Die hier durchgeführte Fehlersuche zur Maximierung der Ausbeute an Zellen bestand darin, die Anzahl der Waschschritte nach und vor der Inkubation von Antikörpern zu reduzieren. Es gibt andere Einschränkungen für die Verwendung von IC. Bei Patienten mit stark verhüllter oder fibrosierter Okularoberfläche, wie im Steven-Johnson-Syndrom, kann die zelluläre Ausbeute sogar noch geringer sein als in dieser Studie. Der Anteil der Immunzellen kann sich ändern, wenn die Proben anstatt analysiert werden am selben Tag gespeichert werden. Es ist schwer vorherzusagen, ob bestimmte Zelltypen resistenter gegenüber der Lagerung sind als andere. Frühere Studien berichteten über erhöhte Spiegel der HLA-DR-Expression in den Bindehaut-Epithelzellen 23 , so dass es sich um eine Inter-Um die Korrelation zwischen HLA-DR und den Ebenen der spezifischen Immunzellen zu bewerten. Immunzellen können auch mit dem Expressionsniveau von Chemokinen assoziiert sein. Diese Fragen sollten in zukünftigen Studien behandelt werden.

Die Impressionszytologie (IC) wurde erstmals 1977 von Thatcher et al 1 durchgeführt . Sie benutzten eine Plastikabdruckscheibe, um konjunktivale Zellen von Patienten anstatt anderer Techniken zu sammeln, die zu diesem Zeitpunkt wie Schaben, Tupfen oder Pipettieren 1 waren . Die gegenwärtige Technik des IC verwendet ein absorbierendes Filterpapier 2, um die Bulbar und die palpebrale Bindehaut zu prägen und die oberflächlichste Schicht von Bindehautzellen zu sammeln. Diese Zellen, die ihre letzte Stufe der Differenzierung erreicht haben, werden kontinuierlich in Tränen vergossen. Drei Hauptpopulationen von Zellen finden sich in IC-Proben: Epithelzellen 4 , Becherzellen 3 , 5 und Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe viz Epithel-assoziierten Effektor-T-Zellen oder dendritischen Zellen 6 . Okulare Oberflächenzellen in IC samPles können durch Mikroskopie, Immun-Blotting und Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) 7 analysiert werden. Durchflusszytometrie wurde vor kurzem verwendet, um Immunzellen zu analysieren, die durch Schaben der IC-Membran 8 gesammelt wurden. Interessanterweise wurde IC 6 , 9 verwendet, um viele okuläre Oberflächenkrankheiten einschließlich Keratokonjunktivitis sicca, Vitamin A-Mangel, Narben-Pemphigoid, atopische Erkrankung, überlegene limbische Keratokonjunktivitis, Frühlings-Keratokonjunktivitis und epitheliale Plattenepithelmetaplasie zu bewerten. IC wurde auch verwendet, um die Auswirkungen des Tragens von Kontaktlinsen, die Erkennung von Augenmikroben zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit und Toleranz von therapeutischen Interventionen in Längsschnittstudien zu untersuchen 10 , 11 , 12 . Das medizinische Gerät (EyePrim) wird von einer Art von Poly unterstütztEthersulfon (PES) 0,2 μm Membran, die bisher für die Technik der okularen Eindruckzytologie mit Durchflusszytometrie (OSIC-Flow) validiert wurde und die Möglichkeit bietet, Längsproben zu verwenden, um die Progression der Krankheit und die Reaktion auf die Behandlung zu überwachen ( z Analyse von intraepithelialen Leukozyten, die als mutmaßliche Erkrankungsmarker für die progressive Bindehautfibrose im Schleimhautpemphigoid definiert wurden) 13 . Frühe Forscher verwendeten autoklavierte PES-Filter, die manuellen Eindruck erfordern. Infolgedessen war die Ausbeute variabel und bedienungsabhängig. Der Vorteil dieses medizinischen Gerätes ist die einfache Bedienung, der standardisierte Druck (Pa oder N / m 2 ) und ermöglicht Wiederholbarkeit, Reproduzierbarkeit und gleichbleibende zelluläre Erholung. Diese Technik ist in einer ambulanten Klinik nützlich, weil sie nicht chirurgisch, leicht durchführbar und schnell ist. Dies ist ein medizinisches Gerät der Klasse I gemäß der Richtlinie 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Es erfordert nurS topische Anästhesie während des Verfahrens, die die Aufrechterhaltung der Integrität der Augenoberfläche gewährleistet. Nach IC können Zellen sofort für die Durchflusszytometrie verarbeitet werden. Darüber hinaus ist es möglich, dass nicht-ophthalmologische Techniker und Krankenschwestern trainiert werden, um die Augenoberfläche zu probieren. Trotz der Verbesserung der IC über andere Techniken, mehrere Herausforderungen bleiben. Zum Beispiel kann es aufgrund der Fläche der Probenahme und der regionalen Unterschiede in der bulbären Konjunktiva in Abhängigkeit von der Position des IC auftreten. Eine andere Variationsquelle ist auf die Anwendung unterschiedlicher Druckmengen während des IC zurückzuführen. Andere methodische Fragen beinhalten die Standardisierung der Zellverarbeitung: Hierbei handelt es sich um Dauer und Art der Fixierung und die Bedingungen der möglichen Lagerung, die die Stabilität des Probenmaterials beeinträchtigen können. Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, eine Methode der Isolierung der Okularabdruckproben zu entwickelnT ist einfach zu bedienen, nicht-invasiv und kann auf die immunologische Charakterisierung der klinischen Proben angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD-Lösung</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lokalanästhesie</td><td>Alcain</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Natriumlösung</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>><Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Spaltlampe BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td><>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse Analysesoftware</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ein nicht-invasiver weg, um zellen aus der conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionell wird die Augenoberflächenzytologie mit Techniken wie Spachteltechnik und Pinseltechnik untersucht. Das Problem mit diesen Techniken ist, dass sie traumatische Läsionen auf der Oberfläche des Auges induzieren können, die zu Narbenbildung, Augenliddeformität, limbischen Stammzellmangel und in einigen Fällen zu großen Unannehmlichkeiten für das Subjekt führen können. Um diese klinischen Probleme zu vermeiden, wurde die Impressionszytologie (IC) entwickelt, um eine trockene Augenerkrankung und spätere Neoplasien, atopische Erkrankungen, Frühlings-Keratokonjubotitis und Keratokonjunktivitis sicca zu diagnostizieren. Typischerweise schneiden die Kliniker die Filterpapiere manuell in die erforderlichen Formen und wenden diese auf die Augenoberfläche an. Hier beschreiben wir, wie man IC mit einem handelsüblichen medizinischen Gerät durchführt. Diese Technik wird hier erklärt, gefolgt von der Immunphänotypisierung durch Durchflusszytometrie. Diese Technik erfordert weniger manuelle Handhabung und verursacht weniger Verletzung der Augenoberfläche.

IC durch diese klinische Vorrichtung erlaubt uns, okuläre Oberflächen-Immunzellen zu isolieren, während die Augenoberfläche intakt gehalten wird. Abbildung 1 beschreibt, wie das IC durchgeführt wurde. Die verschiedenen Stellen des Auges, von denen die Proben gesammelt wurden, sind markiert. Abbildung 2 zeigt das repräsentative Ergebnis der Durchflusszytometrie, gesammelt von 10 gesunden Kontrollen. Für das Gating, verwenden Sie SSC und 7-AAD, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. 7-AAD-Zellen werden als lebende Zellen identifiziert. Diese lebenden Zellen sind ferner durch CD3 + - und CD4 + -Marker charakterisiert. Weiterhin wurden die CD4 + - und CD4-Populationen jeweils als Naive, T EM , T CM und T EMRA mit den CCR7- und CD45RO-Markern charakterisiert. Unter den CD3 + T-Zellen dominieren Effektorspeicher-T-Zellen in der menschlichen Augenoberfläche. In früheren eXperimente wurde auch gezeigt, dass CD8 + Speicherzellen die Hauptpopulationen in den konjunktivalen epithelialen T-Zellen unter den gesunden Individuen sind 20 . Abbildung 3 zeigt, dass CD4 + - und CD8 + -Effektor-Speicher-T-Zellen (T EM und T EMRA ) die Haupt-Teilmenge in der menschlichen Augenoberfläche in 10 gesunden Kontrollen sind. Jede in der Figur erwähnte Population wird mit ihrem Marker-Phänotyp und Namen (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ) benachrichtigt . Die Zahlen in Rot bezeichnen den Prozentsatz der Bevölkerung. Die Daten in dieser Figur sind als Mittelwert ± SEM dargestellt <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Abbildung 1: Sammlung von IC-Proben aus der Ocular Surface durch das Impression Cytology Device. Proben wurden aus der Glühbirne gesammeltAr Region wie gezeigt. <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Abbildung 2: Punktdiagramm mit Durchflusszytometrie. Live 7-AAD-Zellen wurden ausgewählt. Die CD3 + -Zellen wurden zuerst gated, und dann wurde diese Population in CD4 + und CD4 - Untergruppen gegossen. Die Proportionen von naiven (CCR7 + CD45RO - ), zentralen Speicher (CCR7 + CD45RO + ) und Effektor-Speicher (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO) wurden mit Hilfe von CCR7- und CD45RO-Markern ermittelt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FIgure 3: Immunzellen-Subtypen in CD4 + und CD8 + T Zellen der gesunden menschlichen Augenoberfläche. Verteilung von konjunktivalen CD4 + und CD8 + naiven, zentralen Speicher (T CM ) und Effektorgedächtnis (T EM und T EMRA ) Teilmengen bei gesunden menschlichen Kontrollen; Jeder Datenpunkt repräsentiert einen separaten individuellen Mittelwert ± SEM. Der Prozentsatz der Bevölkerung wird als rot unter dem Namen jeder der Populationen markiert. Der Gesamtprozentsatz der Population beträgt 98%, da die CD4 + T EMRA- Population nicht in das genannte Scatterplot aufgenommen wurde (modifiziert von Bose et al., 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die exponierte normale Okularoberfläche besteht aus Hornhaut und Bindehaut. Epithelzellen, Becherzellen und Immunzellen sind in der Bindehaut vorhanden. Hier wird eine nicht-invasive Technik der Impressionszytologie beschrieben, die eine Impressionszytologie-Vorrichtung und Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in der Bindehaut verwendet.

Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Das übergeordnete Ziel dieser Abdruckzytologie-Technik besteht darin, ausreichend Zellen zu gewinnen, um die an Augenoberflächen-Erkrankungen beteiligten Zellen immunologisch zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, offene Fragen im Bereich der Augenoberfläche zu beantworten, beispielsweise welche Immunzellen für Entzündungen der Augenoberfläche von Bedeutung sind. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie vergleichsweise wenig invasiv ist und sowohl in der Klinik als auch im Labor einfach durchzuführen ist.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie entzündlicher Erkrankungen der Augenoberfläche, da sie die Identifizierung spezifischer Populationen von Immunzellen ermöglicht. Diese Methode kann Einblicke in die Population der Immunzellen auf der Augenoberfläche liefern. Sie kann außerdem zur Untersuchung der okularen Toxikologie und der okularen Fibrose angewendet werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da ihnen Erfahrung im Umgang mit der geringen Anzahl von Zellen fehlt, die aus dem Auge gewonnen werden. Nach Bestimmung des klinischen Status des Teilnehmers ein bis zwei Tropfen topisches Anästhetikum auf die obere bulbare Konjunktiva und den unteren Fornix der Augen des Teilnehmers auftragen. Vier bis fünf Minuten warten, bis das Stechen des Anästhetikums nachlässt.Danach das Abdruckzytologiesystem tangential auf die Bindehaut an der temporalen Bulbarseite positionieren und den Druckknopf sanft für zwei bis drei Sekunden drücken und gedrückt halten. Mit einer Pinzette die gewonnene okulare Membran in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Kulturmedium geben und anschließend die Membran eine Minute lang kontinuierlich mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze abkratzen, um die restlichen Zellen vom Gerät zu gewinnen. Beim Abkratzen der Membran vorsichtig vorgehen, da übermäßiges Abkratzen zu einer Ansammlung von Zelltrümmern führen kann, während zu geringes Abkratzen eine geringe Zellausbeute zur Folge haben kann.Wenn die Oberfläche der Membran uneben wird, wiederholen Sie eine zweite Probenentnahme vom selben Auge auf der Nasenseite des Auges, wie gerade gezeigt. Ziehen Sie die Zellen mit der ersten okularen Probensuspension und entnehmen Sie zwei Proben vom anderen Auge des Teilnehmers. Innerhalb von zwei bis drei Stunden nach der Probenentnahme zentrifugieren Sie die okularen Zellen und resuspendieren das Pellet in 50 µL Flow-Zytometrie-Färbepuffer, bestehend aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung, angereichert mit 0,05 % Rinderserumalbumin.Als Nächstes färben Sie die Zellen mit einem Panel der gewünschten Antikörper 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Färbe-Puffer und resuspendieren das Pellet in 200 Mikrolitern frischem Färbe-Puffer. Kalibrieren Sie die Kanalvoltagen des Durchflusszytometers im Zytometer-Einrichtungsfenster und richten Sie eine Probe mit Kalibrierperlen ein, um die Datenerfassung gemäß den Herstelleranweisungen zu normalisieren.Danach im Flow-Zytometrie-Datenerfassungssoftware Setup QC auswählen und die korrekte Charge der Cytometer-Setup- und Tracking-Beads wählen. Die Beads laden und den Start-Knopf betätigen. Anschließend die Zellsuspension durch vorsichtiges Antippen erneut suspendieren und das Röhrchen in das Gerät einlegen.Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware und klicken Sie auf „Vorschau“. Wenn die Schwellwertgeschwindigkeit stabil ist, klicken Sie auf „Erfassen“. Überwachen Sie den Probenpegel und klicken Sie auf „Stopp“, wenn die Probe aufgebraucht ist.Nachdem 10.000 Ereignisse erfasst wurden, erzeugen Sie ein Punktdiagramm aus Vorwärts- und Seitenstreulicht-Area-Signalen und verwenden Sie das Polygon-Tor-Tool, um ein Populations-Tor über alle Ereignisse zu zeichnen, deren Vorwärtsstreuungs-Area-Wert größer als das Fünffache von 10 hoch 4 ist, um so die Trümmer auszuschließen. Klicken Sie auf „Punktdiagramm erstellen“, um ein neues Punktdiagramm zu generieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und wählen Sie „Eigenschaften“, um das Plot-Editor-Fenster zu öffnen.Wählen Sie P1 aus und klicken Sie auf den Forward-Scatter-Bereich auf der x-Achse, um die angezeigte Achse auf CD3 zu ändern. Öffnen Sie ein neues Punktediagramm für die P2-Population und ändern Sie die x-Achse auf 7-AAD. Zeichnen Sie ein Tor um die 7-AAD-negative Population, um die vitalen, CD3-positiven Zellen auszuwählen.Benennen Sie dieses Tor mit P3 und öffnen Sie ein neues Punktdiagramm. Wählen Sie im Fenster Plot-Editor für die x-Achse CD3 und für die y-Achse CD4. Verwenden Sie nun die Populationen P4 und P5, um zwei neue Punktdiagramme zu öffnen, und stellen Sie die x-Achsen so ein, dass sie die CD45RO-positiven Zellen anzeigen, und die y-Achsen, sodass sie die CCR7-positiven Zellen in jedem Diagramm anzeigen.Erstellen Sie anschließend ein P6-Tor um die CD3-positiven, CD4-positiven, CCR7-positiven, CD45RO-positiven Zellen sowie die Tore P7, P8 und P9 um die CD3-positiven, CD4-negativen, CCR7-positiven, CD45RO-positiven Zellen, die CD45RO-negativen, CCR7-negativen, CD4-negativen, CD3-positiven Zellen und die CD45RO-positiven, CCR7-negativen, CD4-negativen, CD3-positiven Zellen, jeweils. Die CD4-positiven und CD4-negativen Populationen können als CD45RO-positive, CCR7-positive zentrale Gedächtnis-T-Zellen sowie als CD45RO-positive, CCR7-negative Effektor-Gedächtnis-T-Zellen charakterisiert werden.Und CD45RO-negativ, CCR7-negativ, T-terminal differenzierte Effektor-Gedächtniszellen entsprechend ihrer CCR7- und CD45RO-Markerexpression. Von diesen Subpopulationen sind die CD4-positiven und CD8-positiven Effektor-Gedächtnis-T-Zellen die Hauptsubpopulation der T-Zellen, die typischerweise auf der Okularoberfläche gesunder Menschen beobachtet werden. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden.Währenddessen können andere Verfahren wie ELISA, Western Blot und weitere Studien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Zytokine und der Gene, die an dem Signalweg beteiligt sind, zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der okularen Oberflächenstudien den Weg, um die verschiedenen Immunzelltypen innerhalb einer bestimmten interessierenden Patientendemografie zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Abdruckzytologie durchführt und wie man Immunzellen von der okularen Oberfläche isoliert und verarbeitet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt eine auf Abstrichen basierende Technik, um lebensfähige kommensale Bakterien aus der okulären Bindehaut zu isolieren. Die Technik kann verwendet werden, um ein Profil des kommensalen bakteriellen Mikrobioms der Bindehaut zu erstellen, das eine defensive Rolle gegen Krankheitserreger spielt.

Tupferbasierte Isolierung von konjunktivalen kommensalen Bakterien: Eine Technik zur Isolierung kommensaler Bakterien aus der Bindehaut des Mausmodells

Wir beschreiben ein Protokoll zur effizienten Isolierung von hautresidenten T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien. Dieses Protokoll liefert eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Lymphozyten in der menschlichen Haut für die durchflusszytometrische Analyse und die Ex-vivo-Kultur.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Wir haben Zellen aus der Bindehaut des inneren Augenlidrandes von menschlichen Probanden gesammelt, gefärbt und abgebildet. Durch die Charakterisierung der Zellmorphologie und der Stoffwechselaktivität kann diese Methode unser Verständnis des trockenen Auges und der Rolle, die die Reibung zwischen den Augenoberflächen bei der Wahrnehmung von Augenbeschwerden spielen kann, verbessern.

Impressionszytologie des Deckels Wiper Bereich

Millionen von Menschen leiden an retinalen degenerativen Erkrankungen, die zu irreversibler Blindheit führen. Ein gemeinsames Element vieler dieser Krankheiten ist der Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Isolierung von primären murinen RGCs durch positive und negative Selektion mit Durchflusszytometrie.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung des Mausauges mit Augenlid-, Augenoberfläche-, vorderen und hinteren Segmenten in relativ intakter Position.

Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie

Präsentiert wird hier eine mikroskopische Multiphotonen-Plattform für die Live-Maus-Augenoberflächenbildgebung. Fluoreszierende transgene Maus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Nichtlineare Signale der zweiten harmonischen Generation, die von kollagenen Strukturen abgeleitet werden, bieten eine etikettenfreie Bildgebung für stromale Architekturen.

Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Amplifikation aerober und fakultativer anaerober Maus-Bindehaut-Kommensalbakterien unter Verwendung eines einzigartigen Augenabstrichs und eines kulturbasierten Anreicherungsschritts mit anschließender Identifizierung durch mikrobiologische Methoden und MALDI-TOF-Massenspektrometrie vorgestellt.

Bindehautkommusale Isolierung und Identifizierung bei Mäusen

Phenolrotfreies/fetales Rinderserum-freies Medium ist eine bessere Option als fortschrittliches RPMI, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion der Bindehautbecherzellen bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.

In vitro Methode zur Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in Bindehautbecherzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung der menschlichen Limbus-Nischenzellen vor.

Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entnahme und Verarbeitung einer Bindehautbiopsie zur Identifizierung von Schleimhautpemphigoiden vor.

Technik der Bindehautbiopsie und direkten Immunfluoreszenz zur Diagnose von Schleimhaut-Pemphigoiden

Dieser Artikel zeigt die Funktionsweise und Wirkung der in vivo konfokalen Mikroskopie bei der Diagnose und Behandlung des trockenen Auges und untersucht die Anwendung und Ergebnisse der in vivo konfokalen Mikroskopie, um eine Grundlage für zukünftige Forschungen zu schaffen.

Im lebenden Organismus Konfokale Mikroskopie in der Diagnose und Behandlung des trockenen Auges: Ein Fokus auf bildgebende Protokolle und Interpretation

Lernen Sie eine nicht-invasive Impression-Cytologie-Technik zur Gewinnung und Immunphänotypisierung von Zellen der okulären Oberfläche. Diese Methode ermöglicht die Analyse von T-Zell-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie.

Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen

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