Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie der Planarien-Optiktopf zuverlässig entfernt werden kann, ohne das Gehirn oder das umgebende Gewebe zu stören, damit die Technik von Forschern und Studenten auf allen Bildungsebenen umgesetzt werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im regenerativen Bereich zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der Mechanismen, die die Aufrechterhaltung und Differenzierung endogener Augenstammzellen in vivo regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, nur das Augengewebe mit minimaler Störung des anderen Gewebes zu entfernen.

Im Allgemeinen ist Übung erforderlich, bevor Personen, die neu in dieser Methode sind, zuverlässig die richtige Menge an Gewebe entfernen können, indem sie das gesamte Auge abtragen und gleichzeitig eine Ablation des umgebenden Gewebes vermeiden. Wählen Sie zunächst Würmer aus, die seit mindestens einer Woche nicht mehr gefüttert wurden und mindestens fünf bis sieben Millimeter lang sind. Füllen Sie 15 bis 30 Würmer in eine 100 Millimeter große Petrischale, die zu zwei Dritteln mit Wurmwasser gefüllt ist, und setzen Sie sofort den Deckel wieder auf.

Beobachten Sie die Würmer auf fehlendes oder unpigmentiertes Gewebe, wie z. B. weiße Köpfe oder Schwänze, um sicherzustellen, dass sie unbeschädigt sind und sich nicht erst kürzlich regeneriert haben. Wischen Sie zuerst den Arbeitsbereich und die Basis des Präpariermikroskops mit einer 70%igen Ethanollösung ab und lassen Sie sie vollständig trocknen. Stellen Sie die Schale mit den ausgewählten Würmern auf die linke Seite des Mikroskops.

Platzieren Sie dann auf der rechten Seite des Mikroskops eine Pinzette Nummer fünf, eine 31 Gauge 5/16 Zoll Insulinnadel mit einer Ein-Milliliter-Spritze, eine saubere Transferpipette und eine beschriftete 12-Well-Platte zum Auffangen abgetragener Würmer. Legen Sie eine Schachtel mit fusselfreien Gewebetüchern, eine Plastikwaschflasche mit frischem Wurmwasser und zusätzliche Transferpipetten so, dass sie während der Operation leicht zugänglich sind. Positionieren Sie eine Peltierplatte in der Mitte des Präpariermikroskops und stellen Sie den Ausgang an der Gleichstromquelle so ein, dass die Oberfläche der Peltierplatte ausreichend kühl ist, um Würmer ruhigzustellen.

Alternativ kann eine mit Eis gefüllte Petrischale anstelle einer Peltier-Platte verwendet werden. Um die OP-Oberfläche vorzubereiten, schneiden Sie zunächst ein fünf mal zehn Zentimeter großes Stück Paraffinfolie ab und legen Sie es über die Mitte der Peltierplatte. Falten Sie dann ein fusselfreies Taschentuch zu einem Quadrat von etwa zwei Zentimetern und legen Sie es auf die Folie.

Halten Sie dann das gefaltete Tuch an Ort und Stelle, befeuchten Sie es mit Wurmwasser und rollen Sie das Tuch mit einer Transferpipette flach. Schneiden Sie zum Schluss ein Stück weißes Filterpapier von 1,5 bis zwei Zentimetern im Quadrat ab und legen Sie es auf das Tuch. Um die Operation zu beginnen, legen Sie einen Wurm mit der Rückenseite nach oben auf das Filterpapier und verwenden Sie die Transferpipette.

Schalte das Licht ein und richte seinen Strahl auf den Wurm. Stellen Sie den Fokus und die Vergrößerung des Präpariermikroskops so ein, dass die Augen des Wurms deutlich sichtbar sind. Drehen Sie den Paraffinfilm, um die Position des Wurms so einzustellen, dass sein Kopf zum Forscher zeigt und um 30 bis 40 Grad nach rechts geneigt ist.

Wenn der Wurm mit der Bauchseite nach oben positioniert ist und die Rachenöffnung sichtbar ist, verwenden Sie die stumpfe Seite der Pinzette, um die Position des Wurms vorsichtig auf die Rückenseite nach oben zu ändern, wobei die Augen sichtbar sind. Stellen Sie die Mikroskopeinstellungen so ein, dass die Augen deutlich scharf sind. Stellen Sie außerdem sicher, dass sowohl die Augen als auch das umgebende Kopfgewebe im Blick sind.

Halten Sie eine saubere Spritze in der rechten Hand zwischen Daumen und Zeigefinger. Stützen Sie den unteren Teil der Spritze auf den linken Daumen und stützen Sie ihn gegen die Peltierplatte. Schauen Sie durch das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Fase der Nadel sichtbar ist.

Legen Sie den linken Zeigefinger so auf die Operationsoberfläche, dass er mit dem linken Daumen einen 40-Grad-Winkel bildet, um sicherzustellen, dass die Oberfläche während des Eingriffs stabil bleibt. Positionieren Sie die Nadel in einem 90-Grad-Winkel zum Öhr, wobei die Abschrägung der Nadel nach oben zeigt. Dringen Sie mit der Nadelspitze sanft in die dünne Gewebeschicht ein, die über der Sehschale des Auges liegt und als weißer, unpigmentierter Bereich sichtbar ist.

Schöpfen Sie von rechts nach links und entfernen Sie sehr vorsichtig alle schwarz pigmentierten Tücher, die sich in der optischen Tasse befinden, sowie alle weißen Tücher. Wenn Sie eine Doppelaugenablation durchführen, tragen Sie jetzt das zweite Auge ab. Nachdem Sie die Operation abgeschlossen haben, füllen Sie die Pipette mit einer kleinen Menge Wurmwasser zurück und lassen Sie das Wasser auf den Wurm ab, um ihn vom Filterpapier abzuheben.

Ziehen Sie die Schnecke sofort in die Transferpipette. Setze den Wurm auf eine beschriftete 12-Well-Platte, die zu zwei Dritteln mit frischem Wurmwasser gefüllt ist. Sobald alle Würmer übertragen sind, wasche sie, indem du das Wasser aus den Brunnen durch frisches Wurmwasser ersetzt.

Inkubieren Sie die Würmer lichtgeschützt in einem 20 Grad Celsius heißen Inkubator und überwachen Sie den Regenerationsprozess. Um lebende Würmer zu opfern, entfernen Sie Wurmwasser von der Platte und ersetzen Sie es durch 70%iges Ethanol. Inkubieren Sie die Würmer drei bis fünf Minuten lang und beobachten Sie, ob die Würmer lysieren und grau werden.

Hier werden Fotos von Plattwürmern gezeigt, die einer Doppelaugenablation und einer Einaugenablation unterzogen wurden, die vor, vier Tage nach und zwei Wochen nach dem chirurgischen Eingriff aufgenommen wurden. Die Bilder zeigen den Fortschritt der Regeneration im Laufe der Zeit. Die Augenregeneration bei ablierten Würmern wurde auch durch immunhistochemische Färbung von Arrestin und neu entwickelten Photorezeptorneuronen bestätigt.

Die Wiederherstellung des visuellen Systems bei Plattwürmern nach einer Doppelaugenablation wurde ebenfalls in einem funktionellen Assay untersucht, der auf der photophoben Reaktion des Wildtyps auf Licht basiert. 24 Stunden nach der Ablation meiden augenlose Würmer das Licht nicht und wandern durch Lichtflecken. Die Photophobie ist sieben Tage nach dem Eingriff wiederhergestellt, was darauf hinweist, dass das regenerierte visuelle System funktionsfähig ist.

Sobald Sie es beherrschen, kann das Verfahren einer Doppelaugenablation eines Wurms etwa drei Minuten dauern. Bei der Ablation ist es wichtig, das gesamte pigmentierte und unpigmentierte Gewebe des Auges herauszuschneiden und dabei darauf zu achten, das Gewebe zwischen den Augen nicht zu beschädigen oder das Gewebe später in das Auge einzureißen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunhistochemie und RNA-Interferenz durchgeführt werden, um die Rolle bestimmter Gene und deren Regenerationsprozess zu untersuchen.

Zusätzlich können Verhaltenstests durchgeführt werden, um die Augenfunktion nach dem Nachwachsen zu testen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Planarienaugen entfernen können, ohne das umgebende Gewebe zu stören. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Nadeln gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Halten der Nadel von Ihnen weg getroffen werden sollten.