Name: Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Lernen Sie die chirurgische Ablation von Planarien-Augen zur Untersuchung von Regenerationsmechanismen und Stammzellbiologie. Diese Methode ermöglicht präzise Entfernung der Augen mit minimaler Beeinträchtigung umliegender Gewebe.

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Die Autoren möchten sie Michelle Deochand für die Perfektionierung dieses Auge Ablationstechnik, Taylor Birkholz für die Unterstützung bei dem Funktionstest, Michael Levin für die Anti-Arrestin Antikörper und Junji Morokuma Informationen zu den Peltier-Platten danken. Diese Arbeit wurde durch einen SFSA Zuschuss von der Western Michigan University WSB unterstützt.

1. Tier Kultur und Handhabung Hinweis: Dieses Protokoll verwendet Schmidtea mediterranea, eine diploide Planarien Spezies mit einem sequenzierten Genom 16, 17 , die üblicherweise für die Regeneration Forschung verwendet wird. Jedoch ist der Test ebenso erfolgreich mit anderen Arten, wie Dugesia Tigrina und Girardia dorotocephala (die im Handel erhältlich). <ol><li> Pflegen Würmer in „worm Wasser“ aus 0,5 g / l Meersalz wird in Reinstwasser (oder gefiltertes entionisiertes) Wasser. Verwenden sterile Polypropylen oder Glasbehälter des Wurm , Wasser zu halten. Siehe <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Zusatzdatei 1</a> für Details über Wurm Wasseraufbereitung. HINWEIS: Niemals Seife reinigen Behälter (oder andere Verbrauchsmaterialien), wie Seife ist giftig für Würmer; statt mit 70% Ethanol abwischen und an der Luft trocknen lassen. &lt;ol&gt; <li> Handschuhe tragen, während sie mit planaria arbeiten, um sie vor Verschmutzung zu schützen. HINWEIS: Würmer sind sehr empfindlich gegenüber Umweltgiften und Chemikalien, einschließlich Seife, Bleichmittel, Shampoo, Conditioner, und Handcreme. </li></ol></li><li> Haus Kolonien in Polypropylen Nahrungsmittelbehältern, wobei der Deckel teilweise geöffnet gelassen zum Luftaustausch bei ~ 20 ° C (Raumtemperatur). Store experimentelle Würmer in entweder Petrischalen (20 Würmer pro 100 mm-Schale) oder nicht-behandelten Gewebe-Kulturplatten (1 worm pro Well für 12-Well-Platten). Um Stress abzubauen, halten beide Kolonien und Experimente im Dunkeln. HINWEIS: Die Kolonien sollten nicht mehr als 500-1000 Würmer pro Liter Wurm Wasser. Für Experimente lassen Deckel vollständig an Ort und Stelle, da Luftstrom in diese Gerichte ausgelegt ist. </li><li> Feed-nicht-experimentelle Würmer einmal pro Woche mit püriertem Bio-Rindfleisch oder Hühnerleber mit Püree aus einer Transferpipette fallen, Platzierung Tropfen Nahrung in den Behälter. Lassen Sie Würmer 2 h Lebensmittel in die konsumierendunkel vor dem Behälter (siehe Schritt 1.4) Reinigung aus. Vor der Verwendung speichert Püree bei -20 ° C für kurzfristig (Wochen) oder -80 ° C für langfristige (Monate); nicht Püree zur erneuten Verwendung wieder einfrieren (als Bakterien blühen kann und die Würmer schaden). HINWEIS: Leber keine Hormone oder Antibiotika und vorzugsweise nicht vorher eingefroren enthalten sollte. Centrifuge Püree vor der Anwendung (oder vor der Fütterung) zum Gefrieren Luft zu entfernen und verhindern, dass Lebensmittel aus schweben. Lebensmittel sollten auf den Boden des Behälters sinken. 1 ml Püree ist für 500-1.000 Würmer ausreichend. </li><li> Austauschwasser einmal pro Woche mit frischem Wasser Wurm für beide Kolonien und Experimente. Colony Behälter auch mit einem ungebleichten Papiertuch abgewischt werden (entfernen Schleim Reste, die Trap-Abfälle) einmal pro Woche für Würmer oder zweimal in der Woche für die Zufuhr Würmer (2 h nach der Fütterung und wieder 2 Tage später) am Verhungern. Um den Biofilm zu behalten, nicht wischen mehr als 80% des Behälters. </li><li> Bewegen Würmer zwischen Containern (oder Operation setup) unter Verwendung einer Transferpipette. Um freie Würmer Behälteroberflächen anhaftet, spritzt Wasser über / hinter der Schnecke von der Oberfläche zu lösen. Dann saugen die Schnecke in die Pipette, bei dem Versuch, die Schnecke innerhalb des unteren inch (dünner) Teil der Pipette zu halten. <ol><li> Backload Pipetten mit einer kleinen Menge von Wurm Wasser vor ihnen zu saugen. </li><li> Versuchen Sie, das Wasser um den Wurm zu bewegen, anstatt der Wurm selbst, um zu verhindern, weiche Körper Würmer zu reißen, indem sie mit der Pipette zu berühren. </li><li> Halten Sie bedeckt experimentellen Gerichte, es sei denn Würmer übertragen oder Wasser zu ersetzen. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung <ol><li> Stoppen Sie Würmer mindestens eine Woche vor den Experimenten zugeführt wird . <ol><li> Wählen Sie Würmer, die für ≥1 Woche wurden nicht gefüttert worden und sind mindestens 5-7 mm in der Länge. Übertragen Sie die Würmer in eine Petrischale 2/3 voller Wurm Wasser und bestätigen Schneckenlänge von einem Lineal unterhalb der Schale gleiten. messen Sie worms während voll ausgefahren und bewegend. HINWEIS: Während kleiner (5-7 mm) Würmer besser funktionieren , wenn nachfolgende Immunofluoreszenz durchführt und in situ - Hybridisierungsanalysen, größere Würmer (8-10 mm) sind leichter zu handhaben - vor allem , wenn das Lernen abzutragen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Würmer sind ganze, unversehrt, und in letzter Zeit nicht regenerieren. HINWEIS: Regenerieren Würmer haben viel leichter (oder keine) Pigment im Kopf und / oder Schwanzbereich im Vergleich zu normalen Würmern. </li><li> Wenn RNAi oder pharmakologische Behandlungen von Würmern durchführen, tun Sie dies an dieser Stelle. Wenn Würmer als Teil der Behandlung (wie für RNAi) gefüttert wurden, wartet mindestens 7 Tage nach der letzten Fütterung vor dem Fortfahren zu Schritt 2.2. </li></ol></li><li> Reinigen der Arbeitsfläche und Präpariermikroskop Basis mit 70% igem Ethanol und lassen Sie ihn vollständig trocknen. Die Schale ausgewählter Würmer auf der linken Seite des Bereichs. Rechts von dem Umfang, Ort ein Paar von # 5 Zangen, a 31 G 5/16 Zoll Insulin Nadel mit einem 1ml-Spritze und eine saubere Transferpipette. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Instrumente durch Berühren der Bank gehalten werden (die Verunreinigungen einführen könnte). Verwenden ein starres Element (wie ein Stäbchen Rest), um die Zange zu halten, Nadel, Pipette und sauber. Alternativ Ort Instrumente auf einem frischen braunen (roh) Papiertuch. Hinweis: Diese und nachfolgende Befehle geschrieben werden, wie sie auf rechtshändige Personen betreffen. Linkshändig Personen sollten die rechts / links Richtung umkehren. </li></ol></li><li> Neben dem Arbeitsbereich, legen Sie eine Schachtel mit einem fusselfreien Tuch wischt, eine Quelle von frischem Wurm Wasser, und einige zusätzliche Transferpipetten (von der Tischplatte geschützt). Platz Wurm Wasser in einer Plastikwaschflasche für eine einfache Dosierung. stellen auch eine markierte 12-Well-Platte (oder 100 mm Petrischale) auf der rechten Seite des Umfangs für ablatiert Tiere zu sammeln. </li><li> Bei Verwendung einer maßgefertigte Platte Peltier Würmer zu immobilisieren, positioniert die Peltier - Platte in die Vertiefung in ter Basis des Binokular und stellt den Ausgang auf der Gleichstromquelle, bis die Arbeitsfläche der Peltier-Platte ausreichend kühl ist (typischerweise ~ 5 V) .Alternatively, bildet eine Kühlplatte mit einer 100 mm Petrischale Füllung ½ voll mit Wasser und frieren für mindestens 24 Stunden. Verwerfen Sie den Deckel und legen den Boden der 100-mm-Schale auf der Basis des Binokular, anschießend den Deckel einer 60 mm Petrischale mit der Oberseite nach unten direkt auf der Oberfläche des Eises (1A). <ol><li> Nachdem das Wasser in der 100-mm-Schale gefroren ist, wird ein „Vulkan“ von Eis in der Mitte der Platte erscheinen. Wenn dies der Fall ist, verwenden Sie eine Rasierklinge das Eis flach zu kratzen, Unregelmäßigkeiten von der Oberfläche zu entfernen. HINWEIS: Während der Operationen wird das Eis schmelzen, so dass Ablationen viel schwieriger. Bereiten mehr Eier Geschirr im Voraus, und gefrorene ersetzen für diejenigen während des Tests, sobald der Deckel der 60-mm-Schale beginnt floating schmelzen. </li></ol></li><li> Bereite das ... VorChirurgie Oberfläche. Geschnitten , um ein 5 cm x 10 cm großes Stück aus Kunststoffparaffinfilm (4 cm 2 bei Verwendung der Petrischal kalte Platte) und es auf dem Zentrum der Fixiereinrichtung. Falten Sie ein fusselfreien Tuch abwischen in ein Quadrat etwa 2 cm 2 und legen Sie es auf der Folie. Schneiden Sie ein Stück weißes Filterpapier 1,5-2 cm 2 und legen Sie es auf des Tuchs. Siehe Abbildung 1B-1E. <ol><li> Halten Sie die gefaltete Wischtuch an der Stelle mit einem behandschuhten Finger, und verwendet Wurm Wasser leicht zu dämpfen das Wischtuch, um sicherzustellen, dass es gefaltet bleibt. Verwenden, um die Seite einer Transferpipette zu rollen die flache abzuwischen. HINWEIS: Kälte hilft Würmer zu hindern. Die Arbeit „trocken“ hilft auch bei der Immobilisierung. Das Gewebe wirkt abzuwischen Wasser durch das Filterpapier Docht, die während der Operation worm feucht zu halten, ohne Würmer ermöglichen vollständig zu austrocknen (das letal ist). </li></ol></li></ol> 3. Chirurgische Ablation <ol><li> Verwenden einer Transferpipette Ort aufe worm dorsal auf das Filterpapier. Schalten Sie die Lichtquelle auf und leiten die Schwanenhälse, so dass das Licht auf der Wurm fokussiert ist. Stellen Sie den Binokular Fokus und Vergrößerung, so dass die Augen deutlich sichtbar sind (der gesamte Wurm muss nicht in Sicht sein); 5fache Vergrößerung ist ein guter Ausgangspunkt. Orientieren die Schnecke durch Drehen des Paraffinfilmes so dass der Kopf in Richtung der Forscher gerichtet ist (in Richtung der Vorderseite des Mikroskops), gewinkelt 30-40 Grad nach rechts. <ol><li> Vermeiden Sie den Einsatz von hellem Licht überschüssige Wurm Bewegung zu verhindern. Planarien Anzeige negativ Photo- und versuchen, helle Licht zu entziehen. </li><li> Wenn der Wurm ventrale Seite positioniert ist, nach oben zeigt (mit Schlundöffnung sichtbar), verwendet, um die matte Seite der Pinzette vorsichtig auf die Schnecken Dorsalseite repositionieren (mit Augen sichtbar). Vermeiden Sie das Tier mit der scharfen Spitze der Zange Annäherung an die Möglichkeit des Reißens durch Weichgewebe zu minimieren, wenn das Tier Neupositionierung. </li><li&gt; Das Mikroskop Fokus so einstellen, dass die Augen klar im Fokus. Achten Sie auch darauf, dass sowohl die Augen und die umgebenden Gewebe Kopf in Sicht sind. </li></ol></li><li> Halt eine frische Nadel / Spritze in der rechten Hand , als ob es ein Stift (zwischen Daumen und Zeigefinger) war. Verspannen den linken Daumens gegen die Peltier - Platte (oder eine Petrischale kalte Platte) und mit dem linken Daumen als einen Drehpunkt , auf das der Bodenabschnitt der Spritze aufliegt (Abbildung 2A). Schauen Sie durch das Mikroskop, und stellen Sie sicher , dass die Abschrägung der Nadel sichtbar ist. HINWEIS: Nadeln sind sehr scharf. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit ihnen. Das Tragen von Latex oder Nitril Handschuhe können einen gewissen Schutz bieten. <ol><li> Mit dem linken Daumen, um die Nadel / Spritze stetig während des gesamten Verfahrens zu halten und zu vermeiden Hände schütteln. </li><li> Bildet einen Winkel von etwa 40 ° mit dem linken Daumen und linken Zeigefingern (mit dem Zeigefinger auf der Oberfläche der Operation), um die Operation Oberfläche stabil zu halten. </li></ol></li><li> Mitdie Abschrägung der Nadel nach oben zeigt (wie ein Löffel) positioniert, um die Nadel im rechten Winkel zu dem Auge (2B). Verwenden, um die Spitze der Nadel vorsichtig auf die dünne Gewebeschicht durchdringt von rechts über den Augenbecher (weiß, unpigmentierten Region) des Auges, Ausschöpfen nach links. Sehr sanft jede pigmentierte Gewebe innerhalb des Augenbechers, wobei darauf geachtet befanden entfernen nicht den Boden zu durchstechen oder um die Grenzen der Exkavation zu zerstören. <ol><li> Wenn der Wurm auf dem Filterpapier für&gt; 1-2 min an jedem Punkt während des Verfahrens gewesen ist, einen Tropfen Wurm Wasser, um den Wurm zu rehydrieren. HINWEIS: Dehydration wird der Wurm Anfälligkeit Rippen Verletzungen erhöhen. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.3, bis alle schwarzen pigmentierten Geweben (Pigmentzellen) sowie alle weißen Geweben des Augenbechers (Dendriten der Sehzellen), werden entfernt. Entfernen Sie nach dem Ende der Nadel stecken operativ entfernte Gewebe durch sorgfältig mit einem Tuch abwischen wischen. Wenn Doppel Auge Ablation ist, abzutragen das zweite Auge an dieser Stelle gewünscht. HINWEIS: Um Verletzungen zu vermeiden, Nadeln können durch Greifen die Nadel mit einem sauberen Tuch wischt mit dem Daumen und Zeigefinger, dann mit der anderen Hand gehalten gereinigt werden, um die Nadel durch die wegzuwischen von Daumen und Zeigefinger zu ziehen. Alternativ kann die Nadel auf die Oberfläche eines feuchten Gewebes abzuwischen und untersucht Sauberkeits abgewischt werden. </li><li> Wenn Sie fertig ist , verwenden Sie eine Transferpipette den Wurm auf eine markierte Schale mit frischem Wurm Wasser zu bewegen. Wenn Gruppendaten zu analysieren, in einem einzigen 100 mm Petrischale bis 20 Würmer auf. Wenn die Regeneration in den gleichen Individuen über die Zeit - Tracking, lege 1 Wurm in jede Vertiefung einer 12-Well - Platte. Sobald alle Würmer übertragen werden, Würmer spülen , indem sie alle Würmer Wasser aus den Schalen / Brunnen entfernt und mit frischem Wurm Wasser zu ersetzen. <ol><li> Zum Entfernen von Würmern aus dem Filter, Backload die Pipette mit einer geringen Menge an Wasser worm und läßt das Wasser auf die Schnecke. Dies sollte heben ter Wurm aus dem Filterpapier, um sofort in die Pipette für die Übertragung angesaugt werden. </li></ol></li><li> Inkubieren Experimente bei ~ 20 ° C (Raumtemperatur) vor Licht geschützt und dem Regenerationsprozess folgen. HINWEIS: Würmer können in einem temperaturgesteuerten Inkubator gelagert werden, um eine konstante Temperatur zu halten, aber das ist nicht unbedingt notwendig. Die meisten Raumtemperaturen variieren nur von + 5 ° C, was nicht den Wurm der Fähigkeit beeinflussen zu regenerieren. </li><li> Wenn es gewünscht wird , zu beheben Würmer für die Immunhistochemie (siehe Abbildungen 3-4) und / oder in situ - Hybridisierungsanalysen der Genexpression. Verschiedene Befestigungsverfahren gibt es für Planarien Immunhistochemie 18, 19, 20 und in situ - Hybridisierung 21, 22, 23 - Protokolle. </li><li> Wenn Experimente abgeschlossen werden, sacrifice leben Würmer durch worm Wasser aus der Schale entfernt und mit 70% Ethanol zu ersetzen. Inkubieren Würmer für 3-5 min, für Würmer Kontrolle zu lysieren und drehen gräulich. </li><li> Legen Sie nicht behandelten Würmer in den normalen Abfallstrom einmal geopfert. Vermeiden Sie Live-Würmer in die Umwelt einzuführen, insbesondere nicht-einheimische Arten. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Auge Ablationstechnik verbessert die aktuellen Methoden (wie Lochung) von Hirngewebe mit Ausnahme von und Exzision hauptsächlich auf die Augengewebe zu beschränken. Mit etwas Übung kann diese Technik von den meisten Personen durchgeführt wird, von Technikern in microsurgeries zu unerfahren, aber gewissenhaft Studenten erlebt. Es wird empfohlen , dass diese Technik oft vor der Verwendung von Ablationen in Experimenten durchgeführt werden, einschließlich (wenn möglich) Bestätigung der vollständigen Entfernung aller...

Planarien sind ein leistungsfähiger Modellorganismus für die adulte Stammzellvermittelte Regeneration zu studieren. Diese nichtparasitären Süßwasser Plattwürmer besitzen die Fähigkeit , jegliche und alle fehlenden Gewebe zu regenerieren, einschließlich ihrer zentralen Nervensystems und des Gehirns 1. Studium so weit zurück wie die 1700er Jahre 2, technologischen Fortschritte in den Planarien Feld in den letzten 10-15 Jahren (wie ein sequenzierten Genom, in - situ - Hybridisierung, Immunhistochemie, RNA - Interferenz (RNAi) und Transkriptomik) hat diesen historischen Modellorganismus aktualisiert . Insbesondere haben Planarien vor kurzer Popularität durchaus als ein Modell für die Augenforschung 3 gewonnen. Planarien haben prototypischen Augen mit nur zwei Gewebetypen, die Photorezeptorneuronen und Pigmentzellen; dies hat die Charakterisierung seiner Augenstammzellpopulation und demonstriert ermöglicht, dass viele der gleichen Gene Wirbeltierauge de Regulierungwicklung ist in Planarien konservierte 4, 5. Die Augenbecher befinden sich dorsal und der weißen, nicht pigmentierten Dendriten der Photorezeptorneuronen und den Halbmond schwarzen Pigmentzellen enthalten, und die Augen, das Gehirn über eine Chiasma innervate. Zusätzlich ist ein Modell zur Erläuterung regenerative Prozesse 6 ist, wobei die Planarien Auge zu studieren , die Entwicklung der visuellen Mechanismen gut geeignet ist , 7, Verhaltensreaktionen auf Licht (Planarien anzuzeigen negativen Phototaxis) 8 und die neurologische Grundlage des Verhaltens 9. Augenregeneration in Planarien wurde in zwei Kontexten weitgehend untersucht: als Teil des Regenerationskopfes Dekapitation folgenden 4, 10, und im Anschluss an der Exzision von nur die Augengeweben 11, 12 </sup&gt;. Die meisten Planarien Studien zur Augen Regeneration haben die Enthauptung Methode verwendet, da es einfach und unkompliziert ist. Die gebräuchlichste Methode Planarien Auge Exzision hat bisher mit einem feinen Glaskapillare 13 über Locher gewesen, 14, obwohl einige Studien auch Amputationen durchgeführt sind gerade hinter den Augen (teilweise Enthauptung) 15. Jedoch beinhalten alle diese Methoden, um den Verlust von vielen anderen Geweben als nur das Auge (wie Gehirn, Darm und Nephridien), möglicherweise die Ergebnisse kompliziert Interpretation. Das Protokoll Auge Ablation präsentierte hier beschränkt Exzision auf die Augengewebe (insbesondere ohne Gehirn), in Daten entstehen, die spezifischen für das Auge sind. Außerdem, im Gegensatz zu geköpft Würmer , die 7-14 Tage , um Fütterung zu beginnen, Augen abgetragenen Würmer füttern innerhalb von 24 h von Ablation 12, so dass RNAi - Experimente (wo RNAi über die Nahrung zugeführt wird) werden performed gleichzeitig. Obwohl technisch schwieriges Auge Ablation erfolgreich als Enthauptung durchzuführen, Exzision aktuelle Studien mit Auge haben keine detaillierten Anweisungen auf ihren Verfahren enthalten. Das Ziel dieses Video-Artikel ist Forscher zu ermöglichen, konsequent die Planarien Exkavation zu entfernen, ohne die zugrunde liegenden Hirngewebe zu stören und so einige anderen Gewebe wie möglich zu entfernen. Dieses Verfahren kann sowohl für die Einzel- und Doppel Auge Ablation verwendet werden und ist für eine Vielzahl von Untersuchungen. Wie die meisten Regenerations Assays wird Augen Ablation gut geeignet für die Kombination mit sowohl pharmakologischen und genetischen (RNAi) Bildschirme sowie Verhaltensstudien. Hier beschreiben wir Methoden für die Behandlung von Würmern, eine Planarien Kolonie Aufrechterhaltung und das Auge Ablationstechnik selbst.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean Meersalze</td><td>Spectrum Brands&nbsp;</td><td>SS15-10</td><td>"10 Gallonen" Box&nbsp; (Nettogewicht 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L fusselfreies Tuchtuch</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4,5 x 8,5 Zoll</td></tr><tr><td>Whatman #2 Filterpapier</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Kreise, 125 mm Durchmesser, weiße</td></tr><tr><td>Easy Touch Insulinspritze (mit Nadel)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&nbsp; U-100 1 cc Spritze, 31 G 5/16 in Nadel</td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Petrischale</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&nbsp; Pinzette&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, gerade Spitze, 11 cm</td></tr><tr><td>Transferpipetten&nbsp;</td><td>Samco Scientific&nbsp;</td><td>225</td><td>Graduiert, große Glühbirne, 7,5 mL, unsterile</td></tr><tr><td>Parafilm M Paraffinfolie</td><td>Marke&nbsp;</td><td>701606</td><td>&nbsp; 4 Zoll x 125 Fuß Rolle</td></tr><tr><td>12-Well, unbehandelte Gewebekulturplatte</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Unbehandelt, flacher Boden, steril, Falcon Marke</td></tr><tr><td>Kunststoff-Lebensmittelbehälter (für Kolonie) &nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Großes Rechteck</td><td>2,25 qt (2,12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" &nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (Girardia tigrina)</td><td>Carolina Biological 132954</td><td></td><td>Verkauft als "braune" Planaria; meistens sind sie G. tigrina (aka Dugesia tigrina), manchmal aber auch G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); beides funktioniert.</td></tr><tr><td>Planarien (Schmidtea mediterranea)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>S. mediterranea sind nicht im Handel erhältlich. Derzeit sind Tiere nur von Laboratorien erhältlich, die sie verwenden und über zusätzliche Tiere verfügen.</td></tr><tr><td>Braune Papierhandtücher&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8" 1-lagiges Mehrfach-Papierhandtuch, UNGEBLEICHTE</td></tr><tr><td>Waschflasche (für Wurmwasser), optional</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Spritzflaschen, Polyethylen niedriger Dichte, Weithals, 500 mL</td></tr><tr><td>Anti-Synapsin-Antikörper, optional</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Überstand</td></tr><tr><td>Anti-Arrestin-Antikörper, optional</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Nicht im Handel erhältlich. Freundliches Geschenk von Michael Levin, Tufts</td></tr><tr><td>University Nalgene Lowboy Ballonflasche mit Zapfhahn (zur Aufbewahrung von Wurmwasser), optional</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&nbsp; Polypropylen, flaches Profil erleichtert das Befüllen von Koloniebehältern aus Kunststoff&nbsp;</td></tr><tr><td>Kundenspezifische Peltier-Platte, optional</td><td>Williams Machine, Foxboro, MA&nbsp;</td><td>n/a</td><td>Design-Besonderheiten mit freundlicher Genehmigung von Junji Morokuma, Tufts University:&nbsp; Die Peltier-Platte besteht aus einer standardmäßigen thermoelektrischen Wärmepumpe (z. B. All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).&nbsp; Die quadratische Wärmepumpe wird mit einer dünnen, verspiegelten Oberfläche bedeckt und dann in ein quadratisches Loch von 30 mm2 in einer kreisförmigen Plexiglasform (~50 mm Durchmesser) eingesetzt. Diese Form hat eine ähnliche Dicke wie die Wärmepumpe und passt bündig in einen Brunnen in der Mitte eines runden Kühlkörpers (~115 mm Durchmesser). Die Form-/Wärmepumpe ist&nbsp; Mit einer Kühlkörperpaste auf Silikonbasis an der Spüle "verankert". Die Leitungen werden durch Löcher gefädelt, die sowohl durch die Form als auch durch den Kühlkörper gebohrt werden. Die untere Hälfte des Kühlkörpers ist in einen "Fuß" eingearbeitet, der in die Öffnung der Grundplatte Ihres Mikroskops passt.</td></tr><tr><td>Gleichstromquelle (für Peltierplatte), optional</td><td>B & K Precision</td><td>1665</td><td>Geregeltes Niederspannungs-Gleichstromnetzteil, 1-18 V (DC), 1-10 Ampere.</td></tr><tr><td>Andere gängige Verbrauchsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparierzielfernrohr mit Schwanenhalsbeleuchtung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essstäbchenablagen, optional</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische ablation assay zur untersuchung von augen regeneration in planarien

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In der Studie von adulten Stammzellen und Regenerationsmechanismen sind Planarienplattwürmer eine Heftklammer in vivo Modellsystem. Dies ist zum großen Teil auf ihre reichlich vorhandenen pluripotenten Stammzellpopulation und die Fähigkeit, alle Zell- und Gewebetypen nach Verletzungen zu regenerieren, die für die meisten Tiere katastrophal sein würde. Vor kurzem haben Planarien an Popularität gewinnen als Modell für die Augenregeneration. Ihre Fähigkeit, das gesamte Auge (bestehend aus zwei Gewebetypen: Pigmentzellen und Photorezeptoren) zu regenerieren ermöglicht die Präparation der Regulierungsmechanismen Sehsystem Regeneration. Eye Ablation hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Techniken (wie Enthauptung oder Loch) für die Prüfung Augenspezifische Wege und Mechanismen, die wichtigsten davon ist, dass die Regeneration weitgehend Augengewebe allein beschränkt ist. Der Zweck dieses Video-Artikel ist zu zeigen, wie zuverlässig die Planarien Exkavation zu entfernen, ohne das Gehirn oder die umgebenden Gewebe zu stören.Der Umgang mit Würmern und Wartung einer etablierten Kolonie wird ebenfalls beschrieben. Diese Technik verwendet eine 31-G, 5/16-Zoll-Nadel Insulin chirurgisch die Exkavation von Planarien auf einer kalten Platte immobilisierte aushöhlen. Dieses Verfahren umfasst sowohl Einzel- und Doppel Auge Ablation, mit den Augen in 1-2 Wochen zu regenerieren, so dass für eine breite Palette von Anwendungen. Insbesondere kann diese Ablationstechnik leicht mit pharmakologischen und genetischen (RNA-Interferenz) Bildschirmen für ein besseres Verständnis von Regenerationsmechanismen und deren Entwicklung, Augen Stammzellen und deren Wartung und phototaxic Verhaltensreaktionen und deren neurologischen Basis kombiniert werden.

Für die ersten 1-2 Stunden nach der Operation erhalten die Tiere Bewegung aufweisen können im Vergleich zu intakten Würmer verringert (aber sie werden immer noch bewegen). Falls gewünscht, werden essen Würmer innerhalb von 24 h nach der Operation (beispielsweise für RNAi Fütterung). Wenn folgendes Auge Regeneration in den gleichen Individuen im Laufe der Zeit, stellen Sie sicher, dass ein Foto von jedem Wurm sowohl vor der Operation (intakt) und bei 1 h nach der Ablation (hpa) zu nehmen....

Dieses Protokoll zeigt, wie konsequent Planarien Augen (Augenbecher) ohne störende umgebende Gewebe auszuschneiden. Verwendung eine Insulin-Nadel und Spritze, entweder einen oder beiden Augen ablatiert werden können Untersuchungen über die Mechanismen der Regeneration regulierenden Auge, um die Entwicklung der visuellen Regeneration und die neuronalen Grundlage des lichtinduzierten Verhaltens zu erleichtern.

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie die Planarien-Augenschale zuverlässig entfernt werden kann, ohne das Gehirn oder umgebende Gewebe zu beeinträchtigen, sodass die Technik von Forschenden und Studierenden auf allen Bildungsniveaus angewendet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Regeneration zu beantworten, beispielsweise die Mechanismen zu bestimmen, die die Aufrechterhaltung und Differenzierung endogener Augen-Stammzellen in vivo regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Forschenden dadurch ermöglicht wird, ausschließlich die Augengewebe zu entfernen, wobei andere Gewebe minimal gestört werden.Im Allgemeinen ist Übung erforderlich, bevor Personen, die neu in dieser Methode sind, zuverlässig die richtige Menge an Gewebe entfernen können, wobei das gesamte Auge ablatiert wird, um jedoch eine Ablation des umgebenden Gewebes zu vermeiden. Beginnen Sie damit, Würmer auszuwählen, die mindestens eine Woche lang nicht gefüttert wurden und mindestens fünf bis sieben Millimeter lang sind. Überführen Sie 15 bis 30 Würmer in eine 100 Millimeter große Petrischale, die zu zwei Dritteln mit Wurm-Wasser gefüllt ist, und setzen Sie den Deckel unverzüglich wieder auf.Beobachten Sie die Würmer auf fehlende oder unpigmentierte Gewebe, wie weiße Köpfe oder Schwänze, um sicherzustellen, dass sie unversehrt sind und nicht kürzlich regenerieren. Wischen Sie zunächst den Arbeitsplatz und den Unterbau des Stereomikroskops mit einer 70 %igen Ethanol-Lösung ab und lassen Sie ihn vollständig trocknen. Stellen Sie die Schale mit den ausgewählten Würmern auf die linke Seite des Mikroskops.Dann platzieren Sie auf der rechten Seite des Mikroskops ein Paar Pinzetten der Größe fünf, eine 31-Gauge-5/16-Zoll-Insulin-Nadel mit einer Ein-Milliliter-Spritze, eine saubere Transferpipette und eine beschriftete 12-Loch-Platte zur Sammlung der ablatierten Würmer. Stellen Sie eine Schachtel fusselfreier Tücher, eine Kunststoffwaschflasche mit frischem Wurmwasser und zusätzliche Transferpipetten so bereit, dass sie während der Operation leicht zugänglich sind. Positionieren Sie eine Peltier-Platte in der Mitte der Basis des Stereomikroskops und stellen Sie die Ausgabe der Gleichstromquelle so ein, dass die Oberfläche der Peltier-Platte ausreichend kühl ist, um die Würmer zu immobilisieren.Alternativ kann eine mit Eis gefüllte Petrischale anstelle einer Peltierplatte verwendet werden. Um die Operationsfläche vorzubereiten, schneiden Sie zunächst ein fünf Zentimeter mal zehn Zentimeter großes Stück Plastik-Paraffinfolie zu und legen es über die Mitte der Peltierplatte. Falten Sie danach ein fusselfreies Tuch in ein Quadrat von etwa zwei Zentimetern Kantenlänge und legen Sie es auf die Folie.Dann das gefaltete Tuch an Ort und Stelle halten, mit Wurmwasser befeuchten und mit einer Transferpipette glatt rollen. Schließlich ein Stück weißes Filterpapier von 1,5 bis zwei Quadratzentimetern abschneiden und es auf das Tuch legen. Um die Operation zu beginnen, mithilfe der Transferpipette einen Wurm mit der dorsalen Seite nach oben auf das Filterpapier legen.Schalten Sie das Licht ein und richten Sie den Lichtstrahl auf den Wurm. Stellen Sie den Fokus und die Vergrößerung des Stereomikroskops so ein, dass die Augen des Wurms deutlich sichtbar sind. Drehen Sie die Paraffinfolie, um die Position des Wurms anzupassen, sodass sein Kopf in Richtung des Forschers zeigt und um 30 bis 40 Grad nach rechts geneigt ist.Wenn der Wurm mit der Bauchseite nach oben liegt und die Pharynxöffnung sichtbar ist, verwenden Sie die stumpfe Seite der Pinzette, um die Position des Wurms vorsichtig so zu verändern, dass die Rückenseite nach oben zeigt und die Augen sichtbar sind. Passen Sie die Mikroskopeinstellungen erneut an, sodass die Augen deutlich scharfgestellt sind. Stellen Sie außerdem sicher, dass sowohl die Augen als auch das umgebende Kopfgewebe im Sichtfeld liegen.Halten Sie eine saubere Spritze mit Daumen und Zeigefinger der rechten Hand. Stützen Sie den unteren Teil der Spritze auf dem linken Daumen ab, der gegen die Peltier-Platte gedrückt wird. Blicken Sie durch das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Schräge der Nadel sichtbar ist.Platzieren Sie den linken Zeigefinger auf der Operationsfläche, sodass er einen 40-Grad-Winkel mit dem linken Daumen bildet, um sicherzustellen, dass die Fläche während des Eingriffs stabil bleibt. Positionieren Sie die Nadel im 90-Grad-Winkel zum Auge, wobei die Schräge der Nadel nach oben zeigt. Dringen Sie mit der Nadelspitze vorsichtig durch die dünne Gewebeschicht über der sichtbaren Optikschale des Auges, die als weißer, unpigmentierter Bereich erkennbar ist.Entfernen Sie vorsichtig von rechts nach links das innerhalb der Augenschale befindliche schwarze pigmentierte Gewebe sowie das gesamte weiße Gewebe. Falls eine Doppelaugenaugulation durchgeführt wird, führen Sie nun die Ablation des zweiten Auges durch. Nach Abschluss der Operation laden Sie die Pipette rückwärts mit einer kleinen Menge Wurmwasser auf und geben das Wasser auf den Wurm, um ihn von dem Filterpapier abzuheben.Ziehen Sie den Wurm sofort in die Transferspipette ein. Bringen Sie den Wurm in eine beschriftete 12-Loch-Platte, die zu zwei Dritteln mit frischem Wurmwasser gefüllt ist. Nachdem alle Würmer überführt wurden, waschen Sie sie, indem Sie das Wasser in den Vertiefungen durch frisches Wurmwasser ersetzen.Die Würmer im Dunkeln in einem 20-Grad-Celsius-Inkubator inkubieren und den Regenerationsprozess überwachen. Um lebende Würmer zu töten, das Wurmwasser von der Platte entfernen und durch 70 % Ethanol ersetzen. Die Würmer drei bis fünf Minuten inkubieren und beobachten, ob sie lysieren und grau werden.Hier werden Fotografien von Plattwürmern gezeigt, die einer doppelten beziehungsweise einfachen Augenexstirpation unterzogen wurden, aufgenommen vor dem Eingriff, vier Tage danach und zwei Wochen danach. Die Bilder veranschaulichen den Fortschritt der Regeneration über die Zeit. Die Augenregeneration bei den exstirpierten Würmern wurde außerdem durch immunhistochemische Färbung von Arrestin und neu gebildeten Photorezeptorneuronen bestätigt.Die Wiederherstellung des Sehsystems bei Plattwürmern nach einer doppelten Augenexenteration wurde ebenfalls in einem funktionellen Test untersucht, der auf der photophoben Reaktion des Wildtyps auf Licht beruht. 24 Stunden nach der Exenteration meiden augenlose Würmer das Licht nicht und bewegen sich durch Lichtflecken hindurch. Die Photophobie stellt sich sieben Tage nach dem Eingriff wieder ein, was darauf hinweist, dass das regenerierte Sehsystem funktionsfähig ist.Wenn man einmal die Methode der doppelten Augenablative an einem Wurm beherrscht, kann der Eingriff in etwa drei Minuten durchgeführt werden. Bei der Ablation ist es wichtig, das gesamte pigmentierte und unpigmentierte Augengewebe zu entfernen, ohne dabei das Gewebe zwischen den Augen zu beschädigen oder das Augengewebe später einzureißen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Immunhistochemie und RNA-Interferenz angewendet werden, um die Rolle spezifischer Gene und deren regenerativen Prozess zu untersuchen.Außerdem können Verhaltensassays durchgeführt werden, um die Augenfunktion nach dem Wiederauswachsen zu testen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man planariische Augen entfernt, ohne das umgebende Gewebe zu stören. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Nadeln gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sowie das Halten der Nadel mit der Spitze von Ihnen weg gerichtet, sollten getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Akute Nierenschädigung (AKI) in den Menschen ist ein bekanntes klinisches Problem durch eine Schädigung der Epithelzellen, die Nieren Nephrone umfassen verursacht und AKI ist mit hohen Sterblichkeitsraten von 50-70% 1 verbunden. Nach epithelialen Zell-Zerstörung, haben Nephronen eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, obwohl die Mechanismen und Einschränkungen, die dieses Phänomen Führung schlecht bleiben verstanden. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir unsere Technik für die gezielte...

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Ein attraktives Modell zur Untersuchung Stammzell-Differenzierung innerhalb eines lebenden Tieres ist der Planarie flatworm. Die Regeneration wird durch einfache Amputation Experimente, die leicht in einem der Grundlagenforschung im Labor durchgeführt werden untersucht und sind zugänglich für pharmakologische und genetische...

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Eine effektive Methode für die Transplantation von Gewebe definierte und einheitliche Größe zwischen Planarien beschrieben wird. Ebenfalls enthalten ist eine Beschreibung, wie die Immobilisierung Technik zur Transplantation verwendet werden ausgebildet, in Verbindung mit Blei Schilde, für die partielle Bestrahlung von lebenden Tieren werden.

Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

Quelle: Volpe, B. A.. , et al. Konfokalmikroskopischer Laserablations- und Regenerationsassay in Interneuromastzellen von Zebrafischen. J. Vis. exp.{TAG_ 31}} (2020) Dieses Video zeigt die Überwachung der Regeneration von Interneuromastzellen im Zebrafisch mittels konfokaler Mikroskopie, die Verfolgung des Zelltods und der Reparatur durch Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung.

Überwachung der Gewinnung von laserablierten Interneuromastzellen im Zebrafisch mittels konfokaler Mikroskopie

Da viele Zebrafisch-Modellen der neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen sind in der erwachsenen Fischen nicht der Embryo / Larven untersucht, entwickelten wir eine quantitative Seitenlinie regenerative Assay, die erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle angewendet werden können. Der Test beteiligt Beschluss der 1) Neuromasten und 2) einzelne Haarzelle Ebenen.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

Das Planarian Schmidtea Mediterranea ist ein hervorragendes Modell für das Studium Stammzellen und Regeneration des Gewebes. Diese Publikation beschreibt eine Methode, um ein Organ, des Rachens, selektiv zu entfernen, indem man Tiere, die chemische Natriumazid. Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden für die Überwachung des Rachens Regeneration.

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung eines transgenen Zebrafischmodells. Die Anpassung des Protokolls an die Modulation des Signalwegs unter Verwendung pharmakologischer Verbindungen ist ausführlich beschrieben. Eine MATLAB-Plattform zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf Basis von Pigmentierung wurde entwickelt und wird vorgestellt und diskutiert.

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

Hier schlagen wir drei verschiedene Methoden vor, um die sensorischen Fasern, die die Hornhaut innervieren, zu schädigen. Diese Methoden erleichtern die Untersuchung der Axonregeneration bei Mäusen. Diese drei Methoden, die auf andere Tiermodelle adaptierbar sind, sind ideal für die Untersuchung der Physiologie und Regeneration der Hornhautinnervation.

Drei Strategien zur Induktion von neurotropher Keratitis und Nervenregeneration in der murinen Hornhaut

Lernen Sie die chirurgische Ablation von Planarien-Augen zur Untersuchung von Regenerationsmechanismen und Stammzellbiologie. Diese Methode ermöglicht präzise Entfernung der Augen mit minimaler Beeinträchtigung umliegender Gewebe.

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

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