Spannklemme Fluorometrie in Xenopus Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine fluoreszierende unnatürliche Aminosäure in ein Membranprotein einzuführen, das in Xenopus-Eizellen exprimiert wird, und gleichzeitig die Funktion des Proteins und die strukturelle Umlagerung mit Hilfe der Voltage-Clamp-Fluorometrie zu bestimmen. Diese Technik wird dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Struktur-Funktions-Beziehungen von Membranproteinen zu beantworten. Mit Hilfe der Voltage-Clamp-Fluorometrie können wir strukturelle Umlagerungen direkt mit der Proteinfunktion korrelieren.

Das Hinzufügen von fluoreszierender unnatürlicher Aminosäuremarkierung hilft, frühere Einschränkungen bei der Markierung zu überwinden. Dies war einst die Zugänglichkeit der Markierungsstellen sowie die Hintergrundmarkierung aufgrund endogener Bindungsstellen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf ein besseres biophysikalisches Verständnis von Membranproteinen, da man jetzt Domänen untersuchen kann, die zuvor mit der herkömmlichen Voltage-Clamp-Fluorometrie nicht zugänglich waren.

Nach der chirurgischen Entnahme der Xenopus-Eizellen waschen Sie die Eizellen dreimal mit SOS-Lösung. Große und gesunde Eizellen einzeln auswählen und vor der Injektion mindestens vier Stunden lang bei 18 Grad Celsius in Barth-Lösung inkubieren, die mit Antibiotika und 5%igem Pferdeserum ergänzt ist. Für die nukleare Injektion von DNA bereiten Sie eine lange und dünne Injektionsspitze vor, um den Zellkern zu erreichen, ohne die Eizellen zu beschädigen.

Füllen Sie dann die Injektionsspitze mit Öl und montieren Sie die Injektionsspitze auf dem Nanoinjektor. Als nächstes installieren Sie den Nanoinjektor unter einem Stereomikroskop und brechen das Ende der Spitze mit einer Pinzette. Werfen Sie danach das Öl aus, bis sich keine Luftblase mehr am Ende der Spitze befindet.

Anschließend wird ein Mikroliter 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter pAnap in nukleasefreiem Wasser auf ein Stück Parafilm unter dem Stereoskop gelegt und die Injektionsspitze mit DNA gefüllt. Übertragen Sie dann die Eizellen in eine netzhaltige Injektionsschale, die Barth-Lösung enthält, die mit Antibiotika ergänzt ist. Da sich der Eizellkern im Tierpol befindet, richten Sie die Injektionsspitze auf die Mitte des Tierpols und spießen Sie sie so auf, dass die Spitze nahe der Mitte der Tierhalbkugel reicht.

Als nächstes injizieren Sie 9,2 Nanoliter der pAnap-Lösung in den Zellkern jeder Eizelle. Anschließend werden die Eizellen sechs bis 24 Stunden lang in zwei Millilitern Barth-Lösung, ergänzt mit Antibiotika und 5 % Pferdeserum, bei 18 Grad Celsius inkubiert, um eine robuste Expression von Anap-spezifischen tRNAs und tRNA-Synthetasen zu ermöglichen. Bereiten Sie nun den Nanoinjektor erneut vor, aber dieses Mal muss die Injektionsspitze nicht so dünn sein wie die für die DNA-Injektion.

Arbeiten Sie ab diesem Punkt nur bei rotem Licht, um ein Photobleaching des Anap zu verhindern. Mischen Sie einen Mikroliter einmillimolare Anap mit einem Mikroliter ein bis zwei Mikrogramm pro Mikroliter mRNA direkt auf ein Stück Parafilm und füllen Sie die Injektionsspitze mit der Mischlösung. Spießen Sie die Spitze im Pflanzenpol direkt unter der Membran auf und injizieren Sie 46 Nanoliter der Mischlösung in jede pAnap-injizierte Eizelle.

Schützen Sie dann die Eizellen vor Licht, indem Sie sie in eine lichtdichte Schachtel legen oder den Kolben in Alufolie einwickeln. Inkubieren Sie sie in Barths Lösung, ergänzt mit Antibiotika und 5%igem Pferdeserum bei 18 Grad Celsius für zwei bis drei Tage. Ersetzen Sie es jeden Tag durch frische Barth-Lösung und entfernen Sie die abgestorbenen Eizellen, um eine Kontamination zu vermeiden.

Bei diesem Aufbau wird die aufgeschnittene Spannungsklemme in einen Fluoreszenzmikroskopie-Aufbau integriert. Die Aufnahmekammer ist auf einem Schieber installiert, der es ermöglicht, sich zwischen dem Standardstereoskop zum Platzieren der Eizelle und dem Mikroskop zur Durchführung von Fluoreszenzmessungen zu bewegen. Ein Photodioden-Detektionssystem wird an den C-Mount-Ausgang des Fluoreszenzmikroskops angeschlossen, und die Photostromanzeige ist mit einem zweiten Eingangskanal im digitalen Signalprozessor verbunden.

Als Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung wird eine 100 Watt starke 12-Volt-Halogenlampe verwendet. Die Steuerung der Anregung erfolgt über einen mechanischen Verschluss zwischen der Anregungslichtquelle und dem Mikroskop. Die Aktivierung wird über einen TTL-Impuls ausgelöst, der vom digitalen Signalprozessor kommt und in der Aufnahmesoftware so getaktet ist, dass sich der Verschluss etwa 100 Millisekunden vor Beginn der Aufnahme öffnet und ein entsprechender Filterwürfel im Filterwürfelrevolver erforderlich ist.

Bei zweifarbiger VCF inkubieren Sie die vorbereiteten Eizellen unmittelbar vor der Aufzeichnung 15 Minuten lang in fünfmikromolarem TMR-Maleimid in Markierungslösung. Waschen Sie dann die Eizellen dreimal mit der Markierungslösung, um überschüssigen Farbstoff vor der Aufnahme zu entfernen. An dieser Stelle wird das Protein spezifisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert.

Schieben Sie nach der Eizellenmontage die Kammer mit dem tierischen Pol nach oben und permeabilisiert, schieben Sie die Kammer zum Mikroskop und fokussieren Sie mit einem 4X-Objektiv auf die Eizelle. Als nächstes spießen Sie die Eizelle mit einer spannungsmessenden V1-Elektrode auf. Wechseln Sie dann zum 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv.

Fokussieren Sie sich auf die Tierstange, die nach oben zeigt. Schalten Sie danach das rote Licht aus. Wählen Sie den Anap-Filterwürfel aus, indem Sie den Revolver des Filterwürfels und den optischen Ausgang, der mit der Fotodiode verbunden ist, drehen.

Schalten Sie danach die Halogenlampe auf die höchste Intensität ein und öffnen Sie den Verschluss für zwei bis fünf Sekunden, um die von der Eizelle ausgehende Hintergrundfluoreszenzintensität abzulesen. Schalten Sie anschließend die Klemme ein, schalten Sie den Bad-/Schutzschalter auf aktiv und stellen Sie das Membranpotential auf das Befehlspotenzial ein, indem Sie den Knopf an der Kopfbühne drehen. Wählen Sie anschließend das Haltepotential, das Schrittprotokoll, die Anzahl und die Länge der Impulse in der Aufnahmesoftware aus.

Zeichnen Sie dann die spannungsabhängigen Ströme und die Anap-Fluoreszenzintensitäten auf. Wählen Sie für zweifarbige VCF-Modelle den TMR-Filterwürfel aus, indem Sie den Würfelrevolver drehen. Lesen Sie die Hintergrundfluoreszenz für TMR, wie für Anap beschrieben, und zeichnen Sie spannungsabhängige Ströme und TMR-Fluoreszenzintensität gleichzeitig auf.

Diese Abbildung zeigt Anap- und TMR-Fluoreszenzsignale unter Verwendung von Stufenprotokollen, die von derselben Eizelle erhalten wurden, die eine Shaker-Mutante exprimiert. Durch Zugabe eines Cysteins, das aus der externen Lösung zugänglich ist, in den L382-Stopp-W434F-Hintergrund und Markierung mit TMR-Maleimid ist es möglich, Echtzeitbewegungen in verschiedenen Regionen desselben Proteins gleichzeitig zu untersuchen. Die Beziehung zur Fluoreszenzspannung wird erhalten, indem die stationäre Fluoreszenzintensität gegen die Spannung aufgetragen wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren in Xenopus-Eizellen exprimiert und wie man eine einfarbige oder zweifarbige Voltage-Clamp-Fluorometrie durchführt. Sobald Sie die Technik beherrschen, sollte es ungefähr so lange dauern wie herkömmliche elektrophysiologische Experimente, Sie haben nur den zusätzlichen Schritt, DNA in den Zellkern der Eizelle zu injizieren. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, zu prüfen, ob die unnatürliche Aminosäure auf Leckexpression exprimiert ist.

Dies muss bei jeder Mutation erfolgen, da die Menge der Leckexpression von der Insertionsstelle des Stoppcodons innerhalb des Proteins abhängt. Diese Technik ermöglicht es den Forschern nun, Konformationsänderungen an der zytosolischen Stelle des Proteins zu untersuchen, wo viele der Regulationsmechanismen stattfinden.