Spannklemme Fluorometrie in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine fluoreszierende, unnatürliche Aminosäure in ein in Xenopus-Oozyten exprimiertes Membranprotein einzubauen und gleichzeitig die Funktion des Proteins sowie strukturelle Umstellungen mithilfe der Spannungs-Klemm-Fluorimetrie zu untersuchen. Diese Technik trägt dazu bei, zentrale Fragen im Bereich der Struktur-Funktions-Beziehungen von Membranproteinen zu beantworten. Mithilfe der Spannungs-Klemm-Fluorimetrie können wir strukturelle Umstellungen direkt mit der Proteinfunktion korrelieren.

Die Hinzufügung einer Markierung mit fluoreszierenden, unnatürlichen Aminosäuren hilft, frühere Einschränkungen der Markierung zu überwinden. Dies betraf einst die Zugänglichkeit der Markierungsstellen sowie Hintergrundmarkierungen aufgrund endogener Bindungsstellen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zu einem besseren biophysikalischen Verständnis von Membranproteinen, da man nun Domänen untersuchen kann, die zuvor mit der herkömmlichen Spannungs-Klammer-Fluorimetrie unzugänglich waren.

Nach der chirurgischen Entfernung der Xenopus-Oozyten waschen Sie die Oozyten dreimal mit SOS-Lösung. Wählen Sie große und gesunde Oozyten einzeln aus und inkubieren Sie sie mindestens vier Stunden bei 18 Grad Celsius in Barthscher Lösung, die mit Antibiotika und 5 % Pferdeserum ergänzt wurde, bevor sie injiziert werden. Für die nukleäre DNA-Injektion bereiten Sie eine lange und dünne Injektionsspitze vor, um den Kern zu erreichen, ohne die Oozyten zu beschädigen.

Danach füllen Sie die Injektionsspitze mit Öl und montieren die Injektionsspitze am Nanoinjektor-Gerät. Installieren Sie anschließend den Nanoinjektor unter einem Stereomikroskop und brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette ab. Danach pressen Sie das Öl heraus, bis keine Luftblase mehr am Ende der Spitze eingeschlossen ist.

Danach einen Mikroliter einer 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter pAnap-Lösung in nukleasefreiem Wasser auf ein Stück Parafilm unter dem Stereomikroskop geben und die Injektionsspitze mit DNA füllen. Anschließend die Oozyten in eine Injektionsschale mit Netzwerk, die mit Barth-Lösung ergänzt um Antibiotika gefüllt ist, überführen. Da der Oozytenkern in der Animalregion liegt, die Injektionsspitze auf das Zentrum der Animalregion ausrichten und so eindringen, dass die Spitze nahe dem Zentrum der Animalhälfte liegt.

Als Nächstes 9,2 Nanoliter der pAnap-Lösung in den Zellkern jedes Oozyten injizieren. Anschließend die Oozyten in zwei Milliliter Barth-Lösung inkubieren, die mit Antibiotika und 5 % Pferdeserum ergänzt wurde, bei 18 Grad Celsius für sechs bis 24 Stunden, um eine starke Expression von Anap-spezifischen tRNAs und tRNA-Synthetasen zu ermöglichen. Bereiten Sie nun den Nanoinjektor erneut vor, jedoch muss diesmal die Injektionsspitze nicht so dünn sein wie die für die DNA-Injektion.

Ab diesem Punkt nur unter rotem Licht arbeiten, um eine Photobleiche des Anap zu verhindern. Einen Mikroliter einer einmillimolaren Anap-Lösung mit einem Mikroliter einer mRNA-Lösung mit einer Konzentration von ein bis zwei Mikrogramm pro Mikroliter direkt auf einem Stück Parafilm mischen und die Injektionsspitze mit dieser Mischung füllen. Die Spitze am vegetativen Pol unmittelbar unterhalb der Membran eindringen lassen und in jede pAnap-injizierte Oozyte 46 Nanoliter der Mischlösung injizieren.

Danach die Oozyten vor Licht schützen, indem sie in eine lichtundurchlässige Box gestellt oder der Kolben mit Aluminiumfolie umwickelt wird. Inkubieren Sie sie in Barths Lösung, ergänzt mit Antibiotika und 5 % Pferdeserum, bei 18 Grad Celsius für zwei bis drei Tage. Täglich durch frische Barths Lösung ersetzen und die abgestorbenen Oozyten entfernen, um Kontaminationen zu vermeiden.

Bei diesem Aufbau ist die Cut-open-Voltage-Clamp-Ausrüstung in einen Fluoreszenzmikroskopie-Aufbau integriert. Die Messkammer ist auf einem Schieberegler montiert, der eine Bewegung zwischen dem Standard-Stereomikroskop zum Platzieren des Oozyten und dem Mikroskop zur Durchführung von Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Ein Photodioden-Detektionssystem ist an den C-Mount-Ausgangsport des Fluoreszenzmikroskops angeschlossen, und die Photostromablesung ist mit einem zweiten Eingangskanal des digitalen Signalprozessors verbunden.

Eine 100-Watt-12-Volt-Halogenlampe dient als Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung. Die Anregung wird durch einen mechanischen Verschluss zwischen der Anregungslichtquelle und dem Mikroskop gesteuert. Die Aktivierung wird über einen TTL-Impuls ausgelöst, der von dem digitalen Signalprozessor kommt und in der Aufnahmesoftware so zeitlich abgestimmt ist, dass der Verschluss etwa 100 Millisekunden vor Beginn der Aufnahme öffnet, und ein geeigneter Filterwürfel ist im Filterwürfelturm erforderlich.

Für die zweifarbige VCF inkubieren Sie die vorbereiteten Oozyten unmittelbar vor der Aufzeichnung fünfzehn Minuten lang in einer Markierungslösung mit fünf Mikromolar TMR-Maleimid. Anschließend waschen Sie die Oozyten dreimal mit der Markierungslösung, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen, bevor Sie die Aufzeichnung durchführen. Zu diesem Zeitpunkt ist das Protein spezifisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert.

Nachdem die Oozyten montiert wurden, mit der Animalpole nach oben gerichtet und permeabilisiert, schieben Sie die Kammer unter das Mikroskop und fokussieren Sie die Oozyte mit einem 4X-Objektiv. Danach stechen Sie die Oozyte mit einer spannungssensitiven V1-Elektrode an. Wechseln Sie anschließend zum 40X-Wasserimmersionsobjektiv.

Konzentrieren Sie sich auf den Animalpol, der nach oben zeigt. Danach schalten Sie das rote Licht aus. Wählen Sie den Anap-Filterblock aus, indem Sie den Filterblockturm drehen, und den mit der Fotodiode verbundenen optischen Austrittsport.

Danach das Halogenlampe auf höchster Intensität einschalten und den Verschluss für zwei bis fünf Sekunden öffnen, um die Hintergrundfluoreszenzintensität abzulesen, die von der Oozyte ausgeht. Anschließend den Klemmverstärker einschalten, den Bad/Guard-Schalter auf „aktiv“ stellen und das Membranpotenzial durch Drehen des Knopfs am Kopfverstärker auf das Befehlspotenzial einstellen. Danach im Aufnahmesoftware das Haltepotenzial, den Schrittprotokolltyp, die Anzahl und Dauer der Impulse auswählen.

Zeichnen Sie anschließend die spannungsabhängigen Ströme und die Anap-Fluoreszenzintensitäten auf. Wählen Sie für die zweifarbige VCF den TMR-Filterkubus, indem Sie den Kubusturm drehen. Messen Sie die Hintergrundfluoreszenz für TMR, wie bereits für Anap beschrieben, und nehmen Sie gleichzeitig die spannungsabhängigen Ströme und die TMR-Fluoreszenzintensität auf.

Diese Abbildung zeigt Anap- und TMR-Fluoreszenzsignale, die mithilfe von Stufenprotokollen von derselben Oozyte erhalten wurden, die einen Shaker-Mutanten exprimiert. Durch Einfügen eines Cysteins, das von der äußeren Lösung aus zugänglich ist, in den Hintergrund von L382 stop W434F und dessen Markierung mit TMR-Maleimid kann man gleichzeitig Echtzeit-Bewegungen in verschiedenen Bereichen desselben Proteins untersuchen. Der Zusammenhang zwischen Fluoreszenz und Spannung wird erhalten, indem die stationäre Fluoreszenzintensität gegen die Spannung aufgetragen wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszierende nichtnatürliche Aminosäuren in Xenopus-Oozyten exprimiert und eine ein- oder zweifarbige Spannungsklemm-Fluorometrie durchführt. Sobald Sie die Technik beherrschen, dauert sie ungefähr genauso lange wie herkömmliche elektrophysiologische Experimente; lediglich der zusätzliche Schritt der DNA-Injektion in den Kern des Oozyten kommt hinzu. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, stets darauf zu achten, ob eine Leckexpression in Abwesenheit der nichtnatürlichen Aminosäure auftritt.

Dies muss für jede Mutation durchgeführt werden, da die Menge der Leck-Expression von der Insertionsstelle des Stopcodons innerhalb des Proteins abhängt. Diese Technik ermöglicht es Forschern nun, Konformationsänderungen an der zytoplasmatischen Seite des Proteins zu untersuchen, wo viele der regulatorischen Mechanismen stattfinden.