Wiederholte Messung der Atemmuskelaktivität und Ventilation in Mausmodellen von neuromuskulären Erkrankungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität der Atemmuskulatur und die Ventilation während des gesamten Krankheitsverlaufs wiederholt zu messen. Nach der chirurgischen Implantation eines Telemetrie-Geräts, bei dem Elektromyographie-Elektroden in ausgewählte Muskeln eingeführt werden, kann diese Methode genutzt werden, um zentrale Fragen dazu zu beantworten, wie die akzessorischen Atemmuskeln eine beeinträchtigte Zwerchfellfunktion infolge einer Erkrankung oder Verletzung kompensieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Beatmung und Atemmuskulaturaktivität am selben frei beweglichen Mausmodell während des gesamten Krankheitsverlaufs gemessen werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Diagnose und Behandlung der ALS liefern, ist jedoch auch auf andere Modelle neuromuskulärer Erkrankungen oder Rückenmarkverletzungen anwendbar. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der EMG-Elektrodenleitungen.

Verwenden Sie eine für die Bearbeitung von Drähten reservierte Schere, um die distalen Leitungen so zu kürzen, dass etwa drei Zentimeter Leitung zur Erreichung des Zielmuskels verbleiben. Anschließend verwenden Sie ein Skalpell, um 0,5 Zentimeter der Kunststoffummantelung zu entfernen, ohne den Draht selbst zu durchtrennen. Verwenden Sie danach Drahtbearbeitungswerkzeuge, um die Enden der Leitungen auf das Vier- bis Fünffache ihrer ursprünglichen Länge zu dehnen.

Kürzen Sie das freiliegende Drahtende der Leitungen, sodass diese 0,5 Zentimeter lang sind. Bereiten Sie anschließend Leitungskappen vor, um die Drahtenden zu bedecken, indem Sie 0,25 Zentimeter lange Stücke von dem zuvor entfernten Kunststoffmantel abschneiden. Nach der Anästhesie der Maus führen Sie einen Zehen- und Schwanzdrucktest durch, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig anästhesiert ist, was durch das Fehlen einer Reaktion bestätigt wird.

Überführen Sie dann die Maus auf den Operationsplatz und setzen Sie die Nasenkappe auf, um die Anästhesie während der Operation aufrechtzuerhalten. Tragen Sie einen schmierenden Augensalbe auf, um zu verhindern, dass die Augen während der Operation austrocknen. Schneiden Sie die Krallen der Seite, auf der der Eingriff durchgeführt wird, um die Gefahr zu verringern, dass die Maus die Elektroden herauszieht oder sich durch Kratzen während des Heilungsprozesses Wunden zufügt.

Rasieren Sie die Maus, um eine Operationsstelle zwischen Ohr und Schulter freizulegen. Wechseln Sie dann abwechselnd das Abtupfen der Operationsstelle zuerst mit Desinfektionsmittel und anschließend mit Isopropanol. Um die Implantation zu beginnen, ziehen Sie das Vorderbein in Richtung des ipsilateralen Fußes, um die Schulterblattknochen kaudal zu verschieben und so chirurgischen Zugang zu den Skalenus- und Trapezmuskeln zu erhalten.

Verwenden Sie stumpfe, gebogene Pinzetten, um die der Operationsstelle ipsilaterale Vorderpfote zurückzuhalten, und befestigen Sie die Pfote mit Klebeband. Nachdem Sie ein neues Paar chirurgische Handschuhe angezogen haben, führen Sie mit dem Skalpell einen zwei Zentimeter langen schrägen Schnitt zwischen Schulter und Ohr durch. Ziehen Sie anschließend mit je zwei Laminektomie-Pinzetten in jeder Hand das Fettgewebe zurück und spreizen Sie die Musculus trapezius und den Musculus platysma, um die Faszie freizulegen, die die Musculi sternocleidomastoideus und scaleni bedeckt.

Verwenden Sie den blassen Musculus sternocleidomastoideus und den Nervus phrenicus als Orientierungspunkte, um die Musculi scaleni zu identifizieren. Beachten Sie, dass der Nervus phrenicus parallel zu den Musculi scaleni verläuft, während der Musculus sternocleidomastoideus kaudal liegt. Die Musculi scaleni verlaufen schräg von den Halswirbeln zu den Rippen unter dem Musculus trapezius.

Biopotentialableitungen werden in den M. scalenus anterior eingeführt, der als der Muskel identifiziert werden kann, der neben dem Nervus phrenicus verläuft. Anschließend wird eine Tasche für den Sender angelegt, indem die Spitzen einer Gewebespreizschere unter die Haut der Maus eingeführt und auseinandergebreitet werden, bis eine Tasche entsteht, die etwas größer ist als die Breite des Senders. Die Tasche wird mit warmer steriler Kochsalzlösung gespült.

Danach das Transmittergerät so einsetzen, dass die flachere Seite an dem Muskel anliegt. Positionieren Sie das Transmittergerät so, dass es flach aufliegt und die Drähte parallel zueinander – nicht verdreht – aus der Tasche austreten. Führen Sie die Leitungen vom Transmitter zu den Muskeln Musculus scalenus und Musculus trapezius, sodass die beiden Sätze biopotentieller Leitungen flach und parallel zueinander verlaufen.

Verwenden Sie anschließend die Laminektomiezange, um den Musculus scalenus anterior von den umgebenden Muskeln zu lösen. Führen Sie dann eine 25-Gauge-Nadel senkrecht zu den Muskelfasern durch den Musculus scalenus ein. Stecken Sie eine Elektrode in die Nadelspitze und ziehen Sie danach die Nadel aus dem Muskel, sodass die Elektrode bis zur Isolierung des Drahtes im Muskel verbleibt.

Notieren Sie, welche farbigen Elektroden in welchen Muskel eingeführt werden. Geben Sie einen Tropfen Cyanoacrylat-Klebstoff auf eine Nadel mit 21 Gauge, um die Applikation des Klebstoffs auf die Elektroden zu erleichtern. Tragen Sie den Klebstoff anschließend auf das freiliegende Ende des Drahtes nahe der Stelle auf, an der die Elektrode in den Muskel eingeführt wird.

Schieben Sie die Leitungskappe schnell über den Draht, sodass zwischen der Leitungskappe und dem Muskel kein Draht mehr freiliegt. Schneiden Sie den überschüssigen Draht distal zur Kappe ab und geben Sie einen Tropfen Cyanacrylat-Klebstoff an das Ende der Leitungskappe und des Drahtes. Geben Sie dem Klebstoff Zeit zur Polymerisation, bevor Sie loslassen.

Führen Sie als Nächstes die Elektrode mit entgegengesetzter Polarität parallel zur ersten auf dieselbe Weise im selben Muskel ein. Diese Elektrode sollte einen bis zwei Millimeter von der ersten Elektrode entfernt sein. Wiederholen Sie den Vorgang, um Elektroden in den M. trapezius einzubringen, der direkt vor dem Musculus scalenus liegt, wie hier gezeigt.

Überprüfen Sie anschließend, ob die Drahtleitungen fest sitzen und ob gerade genügend Spiel in den Leitungen vorhanden ist, damit das Tier Körperbewegungen ausführen kann, ohne an den Leitungen zu ziehen. Entfernen Sie dann vorsichtig das Klebeband, das die Vordergliedmaße fixiert. Ziehen Sie das Fettgewebe wieder über den Muskel und verwenden Sie es, um die eingeführten Leitungen zu bedecken.

Ziehen Sie die Hautlappen anschließend so zusammen, dass die Schnittkanten bündig liegen. Nehmen Sie einen Teil der Hautlappen mit einer gebogenen Pinzette zusammen und tragen Sie einen dünnen Strich Cyanacrylat-Klebstoff entlang dieser Linie auf. Injizieren Sie 0,1 Milliliter Carprofen subkutan, um postoperative Schmerzen zu lindern, während das Tier noch unter Narkose steht.

Entfernen Sie das Tier aus der Nasenkappe und stellen Sie es in einen sauberen Käfig im vorgewärmten Inkubator, bis das Tier wach ist und sich freiwillig im Käfig bewegt. Stellen Sie die Maus mindestens eine Stunde lang in die Plethysmographiekammer, um sie vor der Aufzeichnung von EMG und Plethysmographie zu akklimatisieren. Schalten Sie vor der Aufzeichnung, aber nach der Kalibrierung, den Sender ein, indem Sie einen starken Magneten innerhalb von einem Zoll Abstand zum implantierten Tier platzieren.

Ein rotes Licht an der Vorderseite des Empfängers zeigt an, wann der Sender eingeschaltet ist. Beginnen Sie die Aufnahme über das Dropdown-Menü mit der Bezeichnung Aufnahme und wählen Sie Aufnahme starten. Obwohl die Aufnahmedauer je nach Experiment variieren kann, dauert eine typische Plethysmographie- und EMG-Aufnahme ein bis drei Stunden.

Wenn die Datenaufnahme abgeschlossen ist, schalten Sie den Sender mit einem Magneten aus und bringen Sie das Tier in den Heimkäfig zurück. Die folgenden Spuren zeigen WBP und EMG-Aktivitäten der Skalenus- und Trapezmuskulatur einer präsymptomatischen SOD-1(G93A)-Maus am 98. Tag nach der Geburt. Zeiträume, in denen sich das Tier in Ruhe befindet, werden für die Analyse verwendet.

Der rote Rahmen zeigt EMG-Spuren in Ruhe, die keine EMG-Aktivitätsphasen aufweisen, was charakteristisch für eine präsymptomatische Maus ist. Die Spuren außerhalb des roten Rahmens zeigen große und unregelmäßige Ausschläge in den Plethysmographie-Spuren sowie Muskelaktivität und EMG-Spuren, typisch für eine sich bewegende Versuchstier. Dieses Bild zeigt WBP- und EMG-Spuren des Musculus trapezius einer symptomatischen SOD-1(G93A)-Maus am 126. Tag nach der Geburt, wobei eine EMG-Aktivitätsphase vorhanden ist, während sich die Maus in Ruhe befindet.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 35 Minuten durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können die implantierten Tiere verwendet werden, um die Wirksamkeit von Arzneimitteln zur Steigerung der Aktivität der akzessorischen Atemmuskulatur in Krankheits- oder Verletzungsmodellen zu bewerten.