Eine neuartige Methode zur Modellierung chronisch traumatischer Enzephalopathie in Drosophila

Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, um in Drosophila melanogaster eine geschlossene traumatische Hirnverletzung zuzufügen. Unsere Methode hat den Vorteil, direkt wiederkehrende Stöße mit einstellbarer Kraft auf den Kopf allein zu liefern. Eine weitere Erforschung des wirbellosen Systems wird dazu beitragen, die Pathogenese der chronischen traumatischen Enzephalopathie zu erhellen.

Das übergeordnete Ziel dieses neuartigen Verfahrens ist es, der Fruchtfliege Drosophila geschlossene traumatische Hirnverletzungen zuzufügen, um ein neues Modell der chronischen traumatischen Enzephalopathie zu etablieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der chronischen traumatischen Enzephalopathie zu beantworten, z. B. wie das wiederholte Trauma die Degeneration von Neuronen induziert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die sich wiederholenden Stöße mit einstellbaren Stärken direkt auf den Fliegenkopf überträgt, ohne andere Teile des Tierkörpers zu beschädigen.

Demonstration dieser Methode in der Praxis ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zum Zusammenbau des Geräts und zum Fliegenladen schwer zu erlernen sind, da der Drosophila-Kopf so klein ist und es wichtig ist, den Aufprall nur auf den Kopf anzuwenden. Um den Apparat herzustellen, der zum Erschüttern oder Schlagen der Fruchtfliegen verwendet wird, stellen Sie zuerst den Schlagkörperteil des Apparates her. Entfernen Sie den Kolben von einer Ein-Milliliter-Polycarbonat-Tuberkulin-Spritze und schneiden Sie dann den Zylinder an der Ein-Milliliter-Markierung ab.

Verwenden Sie für einen Impaktor die Aerosolbarriere, die sich auf einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze befindet. Dieser Schlagkörper sollte drei Millimeter lang sein und einen Durchmesser von vier Millimetern haben. Packen Sie dann den Impaktor mit der flachen Seite zur Düse hin in den Spritzenzylinder.

Um Kraft zu erzeugen, befestigen Sie den Spritzenzylinder an einem Kohlendioxid-Durchflussregler. Der Regler muss über einen Ein-Aus-Kippschalter und eine gute Kontrolle des Gasdurchflusses verfügen. Klemmen Sie dann den Lauf senkrecht an einen Eisenständer, so dass der Schlagkörper auf den Boden des Laufs fällt.

Als nächstes stellen Sie den Fliegenhalter her. Beginnen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze. Schneide die Spitze der Pipette fünf Millimeter vom kleinen Ende ab, um eine Öffnung mit einem Durchmesser von 8 Millimetern zu erhalten.

Durch dieses Loch passt ein Fliegenkopf, der Brustkorb jedoch nicht. Zum Schluss machen Sie einen für den Fliegenhalter und das Impaktorgerät. Schneiden Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze 44 Millimeter aus der kleinen Öffnung ab.

Schneiden Sie zweitens sechs Millimeter Länge von der Nadelabdeckung für eine Ein-Milliliter-Spritze ab. Schieben Sie dann die beiden zusammen. Betäuben Sie ein einzelnes, zwei Tage altes erwachsenes Fliegeweibchen mit Kohlendioxid.

Vom Kohlendioxid-Pad aus die Fliege mit einer feinen Bürste vorsichtig in die Halterung befördern. Klopfen Sie dann vorsichtig auf den Halter, bis der Kopf aus der Spitze herausragt. Wenn der Rüssel freiliegt, verwenden Sie eine abgestumpfte Ein-Milliliter-Spritzennadel, um ihn vorsichtig wieder in die Spitze zu stecken.

Es ist wichtig, den Fliegenkörper, insbesondere das Mundteil, in der Halterung zu halten. Andernfalls kann die Fliege an Schäden an den inneren Organen sterben oder daran, dass sie keine Nahrung aufnehmen kann. Stellen Sie anschließend den Gasdruck auf 100 Kilopascal ein und passen Sie den Durchfluss nach Bedarf an.

Sobald die Fliege geladen ist, ziehen Sie den Halter mit dem Konnektor so an den Spritzenzylinder fest, dass der Fliegenkopf nach unten zeigt. Senden Sie dann mit dem Kippschalter einen Gasstoß, der den Impaktor so bewegt, dass er die Fliege nur einmal trifft. Löse nun den Fliegenhalter und kippe die Fliege zurück auf das Kohlendioxid-Pad.

Bürsten Sie die Fliege in ein leeres Fläschchen, bis sie sich erholt hat. Bewahren Sie eine Fliege pro Durchstechflasche auf. Die Wiederherstellung dauert nur wenige Minuten.

Wiederholen Sie den Vorgang, um vier Fliegen pro Versuchsgruppe zu testen. Die Bearbeitung von zwei Gruppen, einem Test und einem Schein, sollte nur 20 bis 30 Minuten dauern. Behandeln Sie Bemänftungen wie Versuchstiere, außer dass Sie keine Aerosolbarriere in das Impaktorröhrchen aufnehmen.

Um die Bewegungen der Fliege in einer Petrischale zu verfolgen, füllen Sie zunächst eine sechs Zentimeter lange Schale mit transparentem Silikonelastomer, um die Tracking-Arena zu erstellen. Lassen Sie zwischen dem Silikon und dem Deckel einen Abstand von drei Millimetern, damit die Fliegen frei in der Lücke laufen, aber nicht fliegen können. Unterhalb der Tracking-Arena befindet sich ein weißer Hintergrund.

Als nächstes betäuben Sie vier Fliegen aus der gleichen Behandlungsgruppe und platzieren Sie sie in der Arena. Lassen Sie die Fliegen eine Stunde lang in der Arena akklimatisieren, die voll beleuchtet und bei etwa 22 Grad Celsius sein sollte. Nicht heißer als Raumtemperatur.

Verwenden Sie nach einer Stunde eine ladungsgekoppelte Gerätekamera, die über der Arena positioniert ist, um die Aktivität der Fliege fünf Minuten lang aufzuzeichnen. Betäuben Sie die Fliegen nach der fünfminütigen Aufnahme in der Arena und setzen Sie sie in ein neues Fläschchen zurück. Entsorge dann die Arena.

Analysieren Sie die Aufnahmen später mit der frei verfügbaren Ctrax-Software. Diese Software generiert Tracking-Daten, die in einem programmierbaren sprachkompatiblen Format, wie z. B. dem MATLAB-Format, exportiert werden können. Berechnen Sie aus den Daten die pro Frame zurückgelegte Strecke, die mittlere Gehstrecke für jede Fliege und die durchschnittlich zurückgelegte Strecke pro Fliege.

Für eine statistische Signifikanz ist mit dem Test von etwa 100 Fliegen pro Behandlungsgruppe zu rechnen. Um ein chronisches traumatisches Enzephalopathie-Modell zu etablieren, wurde die Wirksamkeit einer einzelnen, geschlossenen Kopfverletzung, die durch das Aufprallgerät bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten verursacht wurde, mit zwei Tage alten Canton-S-Weibchen analysiert. Der Gasdruck wurde bei 100 Kilopascal gehalten.

Fliegen, die einem einzigen Schlag mit der höchsten getesteten Durchflussrate ausgesetzt waren, wiesen minimale äußere Defekte auf. Obwohl es keine eindeutigen Beweise für äußere Schäden gab, waren Verletzungen bei einer Durchflussrate von 15 Litern pro Minute akut tödlich, was zu einer Überlebensrate von weniger als 10 % innerhalb von 24 Stunden führte. Die Überlebensrate stieg mit niedrigeren Durchflussraten.

Eine hundertprozentige Überlebensrate wurde bei fünf Litern pro Minute oder weniger erreicht, so dass fünf Liter pro Minute als Standard für das Modell gewählt wurden. Kurz nachdem sie getroffen wurden, gewannen die Fliegen innerhalb von vier Minuten allmählich ihre Beweglichkeit zurück. Die Genesung der Schmiermännchen verlief etwa eine Minute schneller.

Nach dem Aufprall wurde eine videogestützte Bewegungsverfolgung verwendet, um die Funktion der Lokomotive zu messen. In den zwei Tagen nach dem Aufprall normalisierte sich die Fortbewegung langsam. Diese Evidenz für eine allmähliche Genesung steht im Einklang mit der CTE-Genesung beim Menschen.

Um die Langzeitwirkungen zu bewerten, wurde ein repetitives Schädel-Hirn-Trauma-Protokoll mit fünf Schlägen über fünf Tage angewendet. Zwanzig Tage nach der Behandlung wurde die Fortbewegung der überlebenden Mitglieder in jeder Gruppe verglichen und die behandelte Gruppe ging deutlich weniger. Die Lebenserwartung der behandelten Gruppe war ebenfalls erheblich verkürzt, mit einem Median von 26 Tagen im Vergleich zu 37 Tagen bei den Kontrollen.

Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der leichten repetitiven traumatischen Hirnverletzung den Weg, um pathogene Mechanismen im klassischen Tiermodell Drosophila melanogaster zu erforschen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den Rüssel, den Thorax und den Bauch vor direkten Einwirkungen durch die Aerosolbarriere zu schützen.