Video-Tracking-Protokoll auf Bildschirm abschreckende Chemie für Honigbienen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, chemische Abwehrstoffe für Honigbienen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entomologie zu beantworten, beispielsweise welche Chemikalien das Verhalten von Honigbienen dahingehend beeinflussen, dass sie eine Nahrungsquelle meiden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es einen einfachen Ansatz bietet, um chemische Abwehrstoffe für Honigbienen auf relativ schnelle und unkomplizierte Weise zu testen.

Um einen Zucker-Agarose-Würfel für die Kontrollbehandlung herzustellen, gießen Sie eine halb abgekühlte Zucker-Agarose-Lösung in eine Wägebootform. Für die Abwehrbehandlung geben Sie die gewünschte Menge der Substanz zur halb abgekühlten Agarose-Lösung hinzu. In dieser Demonstration wird eine Endkonzentration von 1 % DEET verwendet.

Schwenken Sie den Kolben, um die Verbindung einzumischen, und gießen Sie die Lösung anschließend in eine Wägebootform. Nach dem Abkühlen der Zucker-Agarose-Würfel nehmen Sie die erstarrten Würfel aus den Wägebootformen und legen sie in einen Plastikbehälter mit einem angefeuchteten Papiertuch. Stellen Sie die Behälter zur Aufbewahrung in einen Kühlschrank.

Gehen Sie in der Tracking-Software zu den Experimenteinstellungen in der Experiment-Explorer-Leiste, die sich links auf dem Bildschirm befindet. Stellen Sie sicher, dass die korrekte Kamera ausgewählt ist und die Videobildaufnahme auf die Petrischalen-Arenen zentriert ist. Falls die Videobildaufnahme zentriert werden muss, wechseln Sie in die Kameraeinstellungen, im Bereich der Steuerung des Interessenbereichs, und wählen Sie die Optionen Center X und Center Y aus.

Ändern Sie unter Experimenteinstellungen die Anzahl der Arenen auf 16. Wählen Sie unter zu verfolgenden Merkmalen die Erkennung des Mittelpunkts aus. Wählen Sie anschließend die Arena-Einstellungen aus, um die gewünschte Arena für den Assay einzurichten.

Stellen Sie die 16 Petrischalen in einem vier mal vier großen Muster auf eine unter der Kamera positionierte Leuchtplatte. Nutzen Sie in den Arena-Einstellungen die Schaltfläche „Hintergrund erfassen“, die sich im rechten Seitenwerkzeugpanel befindet, um ein Bild der 16 Petrischalen aufzunehmen. Dieses Bild dient als Vorlage zur Einrichtung der Arena.

Wählen Sie „Ellipse erstellen“ in der Symbolleiste am oberen Rand des Arena-Einstellungsbildschirms und erstellen Sie einen Kreis, dessen Durchmesser dem Durchmesser einer der Petrischalen im erfassten Bild entspricht. Platzieren Sie den Arena-One-Marker innerhalb des Kreises. Wählen Sie anschließend die Zonen-Gruppe eins, die sich unterhalb von Arena eins im rechten Seitenbereich des Werkzeugpanels befindet.

Wählen Sie „Rechteck erstellen“ aus der Symbolleiste oben auf dem Bildschirm aus. Erstellen Sie mit diesem Werkzeug ein Quadrat mit 30 mal 30 Pixeln. Positionieren Sie es anschließend in der Mitte des Kreises, der im vorherigen Schritt erstellt wurde.

Wählen Sie in der oberen Symbolleiste „Zone hinzufügen“ aus und klicken Sie anschließend in die Mitte des Quadrats. Verschieben Sie die Zone um einen Marker, sodass sie innerhalb des Quadrats liegt. Wählen Sie danach im seitlichen Werkzeugpanel rechts „Arena eins“ aus und klicken Sie auf „Vollständige Arena duplizieren“.

Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü alle anderen Arenen aus und klicken Sie dann auf „OK“. Verschieben Sie die duplizierten Arena-Einstellungen in die verbleibenden Petrischalen auf dem erfassten Bild. Wählen Sie anschließend Arena eins aus und klicken Sie auf der oberen Symbolleiste auf „Skala kalibrieren“. Zeichnen Sie die Kalibrierungslinie über den Durchmesser der Petrischale von Arena eins.

Ändern Sie die Durchmesser-Messung auf neun Zentimeter. Wählen Sie auf der rechten Seite des Werkzeugpanels „Arena-Einstellungen überprüfen“ aus. Wählen Sie anschließend auf der linken Seitenleiste „Erkennungseinstellungen“ aus.

Wählen Sie die Erkennungseinstellungen eins aus, und wählen Sie dann Graustufen in der Dropdown-Liste in der Werkzeugbox auf der rechten Seite. Legen Sie unter „Erkennung“ den Bereich von 0 bis 83 fest. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Erkennungseinstellungen, und erstellen Sie eine neue Einstellung mit dem Namen Erkennungseinstellungen zwei.

Stellen Sie sicher, dass die Graustufenabbildung weiterhin ausgewählt ist, ändern Sie jedoch nicht die anderen Parameter. Wählen Sie die Versuchsliste im Experiment-Explorer aus und klicken Sie auf „Variable hinzufügen“ in der oberen Symbolleiste. Benennen Sie die benutzerdefinierte Variable als Behandlung.

Wählen Sie in der Spalte „benutzerdefinierte Behandlung“ die Dropdown-Leiste mit vordefinierten Werten aus und fügen Sie „Kontrolle“ und „Behandlung“ als vordefinierte Werte hinzu. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Versuche hinzufügen“ in der oberen Symbolleiste und fügen Sie zwei Versuche hinzu. Weisen Sie danach für jedes Areal aus, ob es sich um ein Kontrollareal oder ein Behandlungsareal handelt.

Wählen Sie anschließend das Datenprofil im Bereich Experiment-Explorer aus. Wählen Sie in der linken Spalte die Behandlung unter der Überschrift „Benutzerdefinierte unabhängige Variablen“. Dadurch wird ein Filterfeld im Bereich mit dem Flussdiagramm hinzugefügt.

Wählen Sie im Popup-Fenster C aus und platzieren Sie dann den neu erstellten Filter zwischen dem Startfeld und dem Ergebnisfeld. Die Pfeile des Flussdiagramms sollten sich so anpassen, dass sie vom Startfeld zum Filter und schließlich zum Ergebnisfeld zeigen. Wiederholen Sie diesen Schritt, wählen Sie jedoch diesmal T für den Filter aus und anschließend Ergebnis im Abschnitt „Häufige Elemente“.

Verschieben Sie die neu erstellten Felder in den Flussdiagrammbereich und verbinden Sie die Felder mit Pfeilen; speichern Sie die Datei. Starten Sie das Programm zur visuellen Verfolgung und öffnen Sie die gespeicherte Versuchsdatei, die für diesen Assay erstellt wurde. Wählen Sie die Erkennungseinstellungen zwei aus.

Danach Kontrollzucker-Agarose-Würfel in die Mitte von acht der 16 Petrischalen geben. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den Zucker-Agarose-Verbindungswürfeln in den verbleibenden acht Schalen. Entnehmen Sie mithilfe einer Pinzette eine einzelne Honigbiene aus der Plastikbox und legen Sie sie in eine der Kontroll-Petrischalen.

Wiederholen Sie diesen Schritt für die verbleibenden 15 Petrischalen. Stellen Sie alle Schalen auf die Leuchtschale. Beleuchten Sie die Leuchtschale von unten mit einem Array von LED-Leuchten, die auf das rote Spektrum eingestellt sind, und positionieren Sie sie so, dass die Erkennungsbereiche der Arenen in jede der Petrischalen-Arenen passen.

Umgeben Sie die gesamte Box und die Kamera mit einem schwarzen Plastikblatt, um externe Beleuchtung auszuschließen und Schatten innerhalb der Arenen zu reduzieren. Nachdem die Petrischalen platziert wurden, stellen Sie sicher, dass die Erkennungseinstellung „Eins“ als aktive Einstellung ausgewählt ist. Zu diesem Zeitpunkt sollte die visuelle Verfolgungssoftware nur die Honigbienen innerhalb der Petrischalen-Arenen erfassen.

Danach im Experiment-Explorer die Datenaufnahme auswählen. Die grüne Schaltfläche „Start Trial“ in der Popup-Box zur Aufnahme-Steuerung rechts drücken, um die Aufzeichnung zu beginnen. Den Assay 10 Minuten lang durchführen und anschließend die rote Schaltfläche „Stop Trial“ in der Popup-Box zur Aufnahme-Steuerung anklicken, um die Aufzeichnung zu beenden.

Im Folgenden werden repräsentative Ergebnisse der Wirkung von DEET auf das Fressverhalten einzelner Honigbienen gezeigt. Die Individuen, die den Kontrollwürfeln ausgesetzt waren, verbrachten im Durchschnitt 343 Sekunden in der Fresszone, verglichen mit 16 Sekunden bei Individuen, die Würfeln mit DEET ausgesetzt waren. Hier werden repräsentative Ergebnisse der Auswirkungen zweier verschiedener Verbindungen auf das Fressverhalten einzelner Honigbienen dargestellt.

Einzelne Exemplare, die einer nicht-abweisenden Verbindung ausgesetzt waren, verbrachten im Durchschnitt 282 Sekunden in der Futterzone, verglichen mit den Kontrollen, die dort etwa 352 Sekunden verbrachten. Die Exposition gegenüber einer abweisenden Verbindung führt dazu, dass Individuen signifikant weniger Zeit – etwa 23 Sekunden – in der Futterzone verbringen, verglichen mit den Kontrollen, die durchschnittlich 493 Sekunden in der Zone verbrachten.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in 20 Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alles im Voraus vorzubereiten und die Honigbienen ausreichend lange zu entwöhnen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Wirkung einer in eine Nahrungsquelle eingearbeiteten Substanz auf einzelne Honigbienen mithilfe einer Video-Tracking-Software bestimmt.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Nahfeld- und Freilanduntersuchungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Wirkung einer Verbindung auf Kolonienebene zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern im Bereich der Entomologie den Weg, um neue Chemikalien und deren Auswirkungen auf das Fressverhalten von Honigbienen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Verbindungen äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.