Video-Tracking-Protokoll auf Bildschirm abschreckende Chemie für Honigbienen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, chemische Abschreckungsmittel für Honigbienen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Entomologie zu beantworten, z. B. welche Chemikalien das Verhalten von Honigbienen weg von einer Nahrungsquelle beeinflussen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es einen einfachen Ansatz bietet, um chemische Abschreckungsmittel für Honigbienen relativ schnell und einfach zu screenen.

Um einen Zucker-Agarose-Würfel für die Kontrollbehandlung vorzubereiten, gießen Sie eine halbgekühlte Zucker-Agarose-Lösung in eine Waagstabchenform. Für die Repellent-Behandlung geben Sie die gewünschte Menge der Verbindung in die halbgekühlte Agaroselösung. In dieser Demonstration wird eine Endkonzentration von 1 %DEET verwendet.

Schwenken Sie den Kolben, um die Mischung einzumischen, und gießen Sie dann die Lösung in eine Wiegebehälterform. Nach dem Abkühlen der Zucker-Agarose-Würfel die erstarrten Würfel aus den Waagschalenformen nehmen und mit einem angefeuchteten Papiertuch in ein Plastikgefäß geben. Stellen Sie die Behälter zur Aufbewahrung in einen Kühlschrank.

Navigieren Sie in der Tracking-Software zu den Experimenteinstellungen in der Experiment-Explorer-Leiste, die sich auf der linken Seite des Bildschirms befindet. Stellen Sie sicher, dass die richtige Kamera ausgewählt ist und dass die Videoaufzeichnung auf die Petrischalen-Arenen zentriert ist. Wenn die Videoaufnahme zentriert werden muss, gehen Sie in die Einstellungen der Kamera unter den Steuerelementen für den Interessenbereich und wählen Sie die Optionen X zentrieren und Y zentrieren.

Ändern Sie in den Experimenteinstellungen die Anzahl der Arenen auf 16. Wählen Sie unter Verfolgte Features die Option Mittelpunkterkennung aus. Wählen Sie dann die Arena-Einstellungen, um die gewünschte Arena für den Assay einzurichten.

Platzieren Sie die 16 Petrischalen in einem Vier-mal-Vier-Muster auf einem Leuchtkasten, der unter der Kamera positioniert ist. Verwende in den Arena-Einstellungen die Schaltfläche zum Greifen des Hintergrunds auf der rechten Seite, um ein Foto von den 16 Petrischalen zu machen. Dies wird als Vorlage für die Einrichtung der Arena verwendet.

Wählen Sie Ellipse erstellen aus der Symbolleiste oben auf dem Bildschirm mit den Arena-Einstellungen und erstellen Sie einen Kreis, der dem Durchmesser einer der Petrischalen im aufgenommenen Bild entspricht. Lege den Marker der Arena einen Marker in den Kreis. Wählen Sie dann die Zonengruppe eins aus, die sich unter Arena eins in der rechten Werkzeugleiste befindet.

Wählen Sie Rechteck erstellen aus der Symbolleiste oben auf dem Bildschirm. Erstellen Sie mit diesem Werkzeug ein Quadrat von 30 x 30 Pixeln. Positionieren Sie es dann in der Mitte des Kreises, der im vorherigen Schritt erstellt wurde.

Wählen Sie in der oberen Symbolleiste Zone hinzufügen aus und klicken Sie dann in die Mitte des Quadrats. Verschieben Sie die Markierung um eine Zone so, dass sie sich im Quadrat befindet. Wählen Sie als Nächstes Arena eins in der rechten Werkzeugleiste aus und klicken Sie dann auf Komplette Arena duplizieren.

Wählen Sie im Dropdown-Menü alle anderen Arenen aus und klicken Sie dann auf OK. Verschieben Sie die duplizierten Arena-Setups auf die verbleibenden Petrischalen im aufgenommenen Bild. Wählen Sie dann Arena eins und wählen Sie in der oberen Symbolleiste Skala kalibrieren. Ziehen Sie die Kalibrierlinie über den Durchmesser der Petrischale der Arena.

Ändern Sie die Durchmessermessung auf neun Zentimeter. Wählen Sie auf der rechten Seite die Option Arena-Einstellungen validieren aus. Wählen Sie als Nächstes in der Steuerungsleiste auf der linken Seite die Erkennungseinstellungen aus.

Wählen Sie die erste Erkennungseinstellung und dann die Option Grauskalierung im Dropdown-Menü auf der rechten Seite aus. Legen Sie unter Erkennung den Bereich so fest, dass er null bis 83 ist. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Erkennungseinstellungen, und nehmen Sie eine neue Einstellung mit dem Namen Erkennungseinstellungen Zwei vor.

Stellen Sie sicher, dass die Grauskalierung weiterhin ausgewählt ist, aber ändern Sie die anderen Parameter nicht. Wählen Sie im experimentellen Explorer die Option Testliste aus, und klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf Variable hinzufügen. Benennen Sie die benutzerdefinierte Variable als Behandlung.

Wählen Sie die Dropdown-Leiste "Vordefinierte Werte" in der Spalte "Benutzerdefinierte Behandlung" aus und fügen Sie "Steuerung" und "Behandlung" als vordefinierte Werte hinzu. Klicken Sie auf die Schaltfläche Testversionen hinzufügen in der oberen Symbolleiste und fügen Sie zwei Testversionen hinzu. Wählen Sie dann für jede Arena aus, ob es sich um eine Kontrollarena oder eine Behandlungsarena handelt.

Wählen Sie als Nächstes im Bereich Experiment-Explorer die Option Datenprofil aus. Wählen Sie in der linken Spalte Behandlung aus, die sich unter der Überschrift Benutzerdefinierte unabhängige Variablen befindet. Dadurch wird ein Filterfeld in den Bereich mit dem Flussdiagramm eingefügt.

Wählen Sie im Popup-Fenster C aus und platzieren Sie dann den neu erstellten Filter zwischen dem Startfeld und dem Ergebnisfeld. Die Pfeile des Flussdiagramms sollten so angepasst werden, dass sie von der Startbox auf den Filter und schließlich auf das Ergebnis zeigen. Wiederholen Sie diesen Schritt, wählen Sie diesmal jedoch T für den Filter aus, und wählen Sie dann im Abschnitt Allgemeine Elemente die Option Ergebnis aus.

Verschieben Sie die neu erstellten Boxen in den Flussdiagrammbereich und verbinden Sie die Boxen mit Pfeilen, speichern Sie die Datei. Starten Sie das visuelle Tracking-Programm und öffnen Sie die gespeicherte experimentelle Datei, die für diesen Assay erstellt wurde. Wählen Sie zwei Erkennungseinstellungen aus.

Geben Sie dann Kontrollzucker-Agarose-Würfel in die Mitte von acht der 16 Petrischale. Diesen Vorgang mit den Würfeln der Zucker-Agarose-Verbindung in den restlichen acht Förmchen wiederholen. Nehmen Sie mit einer Pinzette eine einzelne Honigbiene aus der Plastikbox und legen Sie sie in eine der Kontroll-Petrischale.

Wiederholen Sie diesen Schritt für die restlichen 15 Petrischale. Stellen Sie das gesamte Geschirr auf den Leuchtkasten. Beleuchten Sie den Leuchtkasten von unten mit einer Reihe von LED-Leuchten, die auf das rote Spektrum eingestellt sind, und positionieren Sie sie so, dass die Erfassungsbereiche der Arena in jede der Petrischalen passen.

Umgeben Sie die gesamte Box und die Kamera mit einer schwarzen Plastikfolie, um externes Licht zu eliminieren und Schatten in den Arenen zu reduzieren. Nachdem die Petrischalen eingestellt wurden, stellen Sie sicher, dass die Erkennungseinstellungen eins die ausgewählte Einstellung ist. Zu diesem Zeitpunkt sollte die visuelle Tracking-Software nur die Honigbienen in den Petrischalen-Arenen erfassen.

Wählen Sie dann im Experiment-Explorer die Option Erfassung aus. Drücken Sie die grüne Schaltfläche zum Starten der Testversion, die sich im Popup-Fenster für die Aufnahmesteuerung auf der rechten Seite befindet, um die Aufnahme zu starten. Führen Sie den Assay 10 Minuten lang aus und klicken Sie dann auf die rote Schaltfläche "Testversion stoppen" im Popup-Fenster für die Akquisitionssteuerung, um die Aufzeichnung zu stoppen.

Repräsentative Ergebnisse der Wirkung von DEET auf das Fressverhalten einzelner Honigbienen sind hier dargestellt. Die Personen, die den Kontrollwürfeln ausgesetzt waren, verbrachten durchschnittlich 343 Sekunden in der Fütterungszone, verglichen mit 16 Sekunden bei Personen, die Würfeln mit DEET ausgesetzt waren. Hier werden repräsentative Ergebnisse der Auswirkungen von zwei verschiedenen Verbindungen auf das Fressverhalten einzelner Honigbienen gezeigt.

Personen, die einer nicht abschreckenden Verbindung ausgesetzt waren, verbrachten durchschnittlich 282 Sekunden in der Fütterungszone, verglichen mit den Kontrollen, die dort etwa 352 Sekunden verbrachten. Die Exposition gegenüber einer abschreckenden Verbindung führt dazu, dass Personen deutlich weniger Zeit, etwa 23 Sekunden, in der Fütterungszone verbringen. Im Vergleich zu den Kontrollen, die durchschnittlich 493 Sekunden in der Zone verbrachten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alles im Voraus vorzubereiten und die Honigbienen für eine angemessene Zeit auszuhungern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Auswirkungen einer Verbindung, die in eine Nahrungsquelle infundiert wird, auf einzelne Honigbienen mit Hilfe von Video-Tracking-Software bestimmen können.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Nahfeld- und Feldassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Wirkung einer Substanz auf Kolonieebene zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Entomologie den Weg, um neuartige Chemikalien und ihre Auswirkungen auf das Fressverhalten von Honigbienen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Verbindungen extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen persönlicher Schutzausrüstung.