Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen In vitro

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache und reproduzierbare Methode für die Extraktion und Reinigung von pflanzlichen Polyphenolen bereitzustellen, die in Zukunft zur Behandlung von Zellen eingesetzt werden könnte. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Rolle der Funktion von Lebensmitteln für die menschliche Gesundheit und Krankheit zu beantworten. Diese ethanolbasierte und ultraschallunterstützte Polyphenol-Extraktion ist eine einfache und reproduzierbare Methode, die eine höhere Polyphenolausbeute ermöglicht.

Die Verwendung von Chloroform ermöglicht die Entfernung von Zuckern, Fettsäuren, Proteinen und anderen Molekülen, während Ethylacetat die Polyphenolfraktionierung ermöglicht. Diese konzentrierten Polyphenolextrakte können dann in vitro und in vivo verwendet werden, um die Auswirkungen von Polyphenolen sowie ihre Wirkmechanismen auf verschiedene Gewebe, einschließlich des Herz-Kreislauf-Systems, zu untersuchen, wie hier beschrieben. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Reagenzien vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wiegen Sie anschließend 10 Gramm gefriergetrocknetes Brombeerpulver ab. Das Beerenpulver wird in einen 1-Liter-Rundkolben gegeben, der 100 Milliliter 80%iges wässriges Ethanol enthält. Stellen Sie den Kolben in ein Ultraschallbad bei 25 Grad Celsius.

Unter kontinuierlicher Stickstoffspülung bei gedämpftem Licht wird das Gemisch 20 Minuten lang bei 42 Kilohertz und 135 Watt beschallt. Verwenden Sie danach einen gekühlten Buchner-Trichter mit Vakuumsauger, um die Mischung durch ein Filterpapier Nummer zwei zu filtern. Spülen Sie den Filterkuchen mit 50 Millilitern 100%igem Ethanol aus.

Bewahren Sie das Filtrat auf und geben Sie den Filterkuchen in einen Ein-Liter-Rundkolben mit 100 Millilitern 80 % wässrigem Ethanol. Wiederholen Sie dann den Extraktionsvorgang, indem Sie die Mischung beschallen, filtrieren und waschen. Die beiden Filtrate werden in einem Rundkolben mit 50 Millilitern 80 % wässrigem Ethanol kombiniert.

Mit einem Rotationsverdampfer bei 62 Grad Celsius und 50 U/min das Lösungsmittel verdampfen. Fahren Sie damit fort, bis das Ethanol nicht mehr verdampft. Übertragen Sie anschließend die Probe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Injizieren Sie Stickstoffgas 10 Minuten lang an der Oberseite des Rohrs, um das restliche Ethanol zu verdampfen. Frieren Sie die Probe mindestens 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius ein. Anschließend wird die Probe etwa acht Stunden lang bei minus 50 Grad Celsius gefriergetrocknet.

Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Wiegen Sie zunächst die gefriergetrockneten extrahierten Proben. Geben Sie etwa 20 Milliliter Chloroform mit der Probe in ein 100-Milliliter-Becherglas.

Mischen Sie die Lösung mit einer Rührplatte fünf Minuten lang. Gieße dann die Mischung in einen Scheidetrichter. Lassen Sie den Rohextrakt eine Stunde lang bei Raumtemperatur dekantieren.

Entsorgen Sie danach die untere Schicht und sammeln Sie die wässrige Schicht in einem sauberen Becherglas. Geben Sie zwei Volumen Ethylacetat in das Becherglas. Rühren Sie die Mischung mit einem Magnetrührstab fünf Minuten lang bei Raumtemperatur um.

Verwenden Sie anschließend einen gekühlten Buchner-Trichter mit Vakuumabsaugung, um die Mischung durch Filterpapier Nummer zwei zu filtern. Die gefilterte Probe wird in einen Kolben mit rundem Boden überführt. Mit einem Rotationsverdampfer bei 62 Grad Celsius und 50 U/min das Ethylacetat 30 Minuten lang verdampfen.

Danach wird die Probe acht Stunden lang bei minus 50 Grad Celsius gefriergetrocknet. Die Probe wird in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Nach der Kultivierung der glatten Gefäßmuskelzellen wird das Nährmedium verworfen und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen.

Fügen Sie dann vier Milliliter PBS und zwei Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Danach werden die Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern vollständigem Medium überführt.

Zentrifugieren Sie bei 1.100 g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut mit einem Milliliter PBS. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Anschließend säen Sie in Sechs-Well-Kulturplatten 50.000 Zellen pro Well. Züchten Sie die Zellen auf 90 % Konfluenz in einem vollständigen Medium, das 10 % fötales Rinderserum enthält. Bereiten Sie das Behandlungsmedium wie im Textprotokoll beschrieben vor und lagern Sie es bei vier Grad Celsius.

Fügen Sie dann 10 Milligramm rohen oder gereinigten Extrakt zu einem Milliliter reinem DMEM hinzu, um eine Stammlösung von 10 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Lagern Sie die Stammlösung in 200 Mikroliter Aliquoten bei minus 20 Grad Celsius. Danach werden zwei Milliliter Behandlungsmedium mit 0,5 % fötalem Rinderserum und der gewünschten Konzentration der Stammlösung in die Zellen gegeben.

Inkubieren Sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Wenn Sie dann mit Hormonen oder Wachstumsfaktoren behandeln, lassen Sie die Zellen mindestens 24 Stunden lang hungern, indem Sie sie mit einem Behandlungsmedium inkubieren, das 0,5 % fötales Rinderserum enthält. Fügen Sie nach dem Hungern das gewünschte Hormon hinzu und ersetzen Sie das Behandlungsmedium drei Tage lang alle 24 Stunden, wie im Textprotokoll beschrieben.

Waschen Sie anschließend die behandelten Zellen zweimal in kaltem PBS. Lysieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern Lysepuffer auf Eis. Sammeln Sie das Zelllysat mit Zellschabern und geben Sie es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Inkubieren Sie das gesammelte Lysat 20 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie es alle fünf Minuten vortexen. Danach beschallen Sie die Zellextrakte mit drei Stößen bei 125 Watt für jeweils 10 Sekunden, mit einer Pause von zwei Sekunden zwischen jedem Stoß. Messen Sie mit einem Proteinassay-Reagenz bei 595 Nanometern die Proteinkonzentration.

Mischen Sie 50 Mikrogramm Protein mit Lysepuffer, um ein maximales Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern zu erhalten. Geben Sie 16 Mikroliter eines 4x Laemmli Probenpuffers hinzu. Anschließend erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang auf 75 Grad Celsius.

Separieren Sie die Proben in 10%SDS-PAGE-Gelen und übertragen Sie sie auf PVDF-Membranen für die Western-Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern. In dieser Studie wird eine Extraktion auf Ethanolbasis verwendet, um die unterschiedlichen Gehalte an Phenolsäuren und Flavonoiden zu identifizieren, die in rohen und gereinigten Polyphenol-Brombeerextrakten enthalten sind. Während der Reinigungsprozess die Gehalte an Gallussäure oder p-Cumarsäure nicht signifikant veränderte, erhöhte er jedoch die Gehalte an 3-O-Caffeoylchinsäure von 170,5 auf 235,3 ppm und an Quercetin von 24,5 auf 95 ppm.

Im Gegensatz dazu gingen Ferulasäure und Rutin bei der Reinigung des Rohextrakts verloren. Nach der Extraktion wurden die VSMCs drei Tage lang in 50 bis 500 Mikrogramm pro Milliliter rohem oder gereinigtem Brombeerextrakt in einem Medium mit 0,5 % fötalem Rinderserum inkubiert. Beide Extrakte erweisen sich als wirksam bei der Verringerung der basalen Phosphorylierung von ERK.

Es wird jedoch festgestellt, dass der gereinigte Extrakt bei 100 Mikrogramm pro Milliliter stark herunterreguliert, während 400 bis 500 Mikrogramm pro Milliliter Rohextrakt erforderlich sind. Dies deutet darauf hin, dass die größere Wirksamkeit des gereinigten Extrakts bei der Hemmung der ERK-Phosphorylierung auf seine höheren Konzentrationen an Polyphenolverbindungen zurückzuführen ist. Danach werden VSMCs 24 Stunden lang mit 200 Mikrogramm pro Milliliter gereinigtem Brombeerextrakt behandelt, bevor die Zugabe von 100 Nanomol Angiotensin II.As zuvor berichtet, reduziert der Brombeer-Polyphenol-Extrakt die Angiotensin-II-induzierte ERK-Phosphorylierung, zeigt jedoch keinen Einfluss auf die Katalase- oder SOD2-Expression.

Einmal gemeistert, kann die Polyphenol-Extraktion in wenigen Stunden vorbereitet werden. Diese Technik kann Forschern auf dem Gebiet der funktionellen Lebensmittel helfen, die Rolle von Polyphenolen in vitro und in Tiermodellen zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, Polyphenole aus Obst und Gemüse zu extrahieren und zu reinigen und die Polyphenolextrakte zur Behandlung von Zellen in Kultur zu verwenden.

Wir haben diese Methode verwendet, um die Rolle von Brombeer-Polyphenolen bei der Verhinderung der Alterung der glatten Muskelzellen der Aortengefäße zu demonstrieren. Dies ist von Bedeutung, wenn man bedenkt, dass die Alterung des Gefäßsystems ein Hauptrisikofaktor für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist.