Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Extraktion und Reinigung pflanzlicher Polyphenole bereitzustellen, die zukünftig zur Behandlung von Zellen verwendet werden könnten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Rolle von Lebensmitteln für die menschliche Gesundheit und bei Krankheiten zu beantworten. Die ethanolbasierte und ultraschellunterstützte Polyphenol-Extraktion ist eine einfache und reproduzierbare Methode, die eine höhere Ausbeute an Polyphenolen ermöglicht.

Die Verwendung von Chloroform ermöglicht die Entfernung von Zuckern, Fettsäuren, Proteinen und anderen Molekülen, während Essigsäureethylester eine Fraktionierung der Polyphenole erlaubt. Diese angereicherten Polyphenol-Extrakte können anschließend in vitro und in vivo verwendet werden, um die Wirkungen von Polyphenolen sowie deren Wirkmechanismen auf verschiedene Gewebe – wie hier beschrieben das kardiovaskuläre System – zu untersuchen. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Reagenzien gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.

Als Nächstes wiegen Sie 10 Gramm gefriergetrocknetes Brombeerpulver ab. Geben Sie das Beerenpulver in einen einliterigen Rundkolben, der 100 Milliliter 80%ige wässrige Ethanol enthält. Stellen Sie den Kolben in ein Ultraschallbad bei 25 Grad Celsius.

Unter kontinuierlicher Stickstoffspülung im abgedunkelten Licht das Gemisch 20 Minuten lang bei 42 Kilohertz und 135 Watt beschallen. Danach das Gemisch mit einem gekühlten Büchner-Trichter unter Vakuumabsaugung über ein Filterpapier der Nummer zwei filtrieren. Den Filterkuchen mit 50 Milliliter 100%igem Ethanol ausspülen.

Speichern Sie das Filtrat und geben Sie den Filterkuchen in einen einliterigen Rundkolben, der 100 Milliliter 80%igen wässrigen Ethanol enthält. Wiederholen Sie anschließend den Extraktionsprozess, indem Sie das Gemisch beschallen, filtrieren und waschen. Vereinigen Sie die beiden Filtrate in einem Rundkolben, der 50 Milliliter 80%igen wässrigen Ethanol enthält.

Verdampfen Sie das Lösungsmittel unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 62 Grad Celsius und 50 U/min. Fahren Sie damit fort, bis kein Ethanol mehr verdampft. Überführen Sie die Probe anschließend in ein 50-Milliliter-Konischgefäß.

Stick Stickstoffgas 10 Minuten lang an die Oberseite des Reagenzglases, um verbleibenden Ethanol zu verdampfen. Gefrieren Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden ein. Anschließend gefriertrocknen Sie die Probe bei minus 50 Grad Celsius für etwa acht Stunden.

Lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius, bis sie verwendet werden. Wiegen Sie zunächst die gefriergetrockneten extrahierten Proben ab. Geben Sie etwa 20 Milliliter Chloroform zu einem 100-Milliliter-Becher mit der Probe hinzu.

Unter Verwendung einer Rührplatte die Lösung fünf Minuten lang mischen. Anschließend die Mischung in ein Trennfunnel geben. Den Rohextrakt eine Stunde lang bei Raumtemperatur abtrennen lassen.

Danach die untere Phase verwerfen und die wässrige Phase in einen sauberen Becher sammeln. Zwei Volumina Ethylacetat zum Becher hinzufügen. Das Gemisch unter Verwendung eines magnetischen Rührstabs fünf Minuten lang bei Raumtemperatur rühren.

Als Nächstes verwenden Sie einen gekühlten Büchner-Trichter mit Vakuumsaugung, um die Mischung über Filterpapier Nummer zwei zu filtrieren. Überführen Sie die filtrierte Probe in einen Rundkolben. Verdampfen Sie das Ethylacetat unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 62 Grad Celsius und 50 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten.

Anschließend das Probenmaterial bei minus 50 Grad Celsius acht Stunden lang gefriertrocknen. Die Probe in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführen und bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis sie verwendet wird. Nach der Kultivierung der vaskulären glatten Muskelzellen das Kulturmedium verwerfen und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen.

Danach vier Milliliter PBS und zwei Milliliter 0,25 %iges Trypsin-EDTA hinzufügen. Im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Anschließend die Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen, das zwei Milliliter komplettes Medium enthält.

Zentrifugieren bei 1.100 × g für fünf Minuten. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit einem Milliliter PBS erneut suspendieren. Die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.

Danach 50.000 Zellen pro Vertiefung in sechs-Vertiefungs-Kulturplatten ansäen. Die Zellen in komplettem Medium, das 10 % fetalen Kälberserum enthält, bis zu 90 % Konfluenz kultivieren. Das Behandlungsmedium gemäß der schriftlichen Anleitung herstellen und bei vier Grad Celsius lagern.

Anschießend 10 Milligramm entweder roher oder gereinigter Extrakt zu einem Milliliter ungesättigtem DMEM hinzufügen, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Die Stammlösung in Aliquots zu je 200 Mikroliter bei minus 20 Grad Celsius lagern. Danach zwei Milliliter Behandlungsmedium, das 0,5 % fetalen Kälberserum und die gewünschte Konzentration der Stammlösung enthält, zu den Zellen geben.

Die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator inkubieren. Anschließend, falls mit Hormonen oder Wachstumsfaktoren behandelt wird, die Zellen mindestens 24 Stunden lang durch Inkubation mit Behandlungsmedium, das 0,5 % fetalen Kälberserum enthält, hungern lassen. Nach der Hungerphase das gewünschte Hormon hinzufügen und das Behandlungsmedium alle 24 Stunden für drei Tage erneuern, wie im Textprotokoll beschrieben.

Als Nächstes die behandelten Zellen zweimal mit kaltem PBS waschen. Die Zellen mit 200 µL Puffer zur Zelllyse auf Eis lysieren. Mit Zellabstreifern das Zelllysat sammeln und in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Die gesammelte Lyseprobe 20 Minuten auf Eis inkubieren, dabei alle fünf Minuten kurz wirbeln. Danach die Zellextrakte mit drei Impulsen à 10 Sekunden bei 125 Watt beschallen, wobei zwischen den Impulsen jeweils eine Pause von zwei Sekunden eingelegt wird. Mithilfe eines Protein-Assay-Reagenzes bei 595 Nanometern die Protein-Konzentration bestimmen.

Vermischen Sie 50 Mikrogramm Protein mit Lysepuffer, um ein maximales Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern zu erhalten. Geben Sie 16 Mikroliter eines 4x Laemmli-Probelösepuffers hinzu. Anschließend erhitzen Sie die Proben fünf Minuten bei 75 Grad Celsius.

Trennen Sie die Proben in 10 %igen SDS-PAGE-Gelen und übertragen Sie sie für die Western-Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern auf PVDF-Membranen. In dieser Studie wurde eine ethanolbasierte Extraktion verwendet, um die unterschiedlichen Gehalte an Phenolsäuren und Flavonoiden in rohen und gereinigten polyphenolischen Brombeerextrakten zu identifizieren. Während der Reinigungsprozess die Gehalte an Gallussäure oder p-Cumarsäure nicht signifikant veränderte, erhöhte er die Gehalte an 3-O-Caffeoylchininsäure von 170,5 auf 235,3 ppm und an Quercetin von 24,5 auf 95 ppm.

Im Gegensatz dazu gingen Ferulasäure und Rutin während der Reinigung des Rohextrakts verloren. Nach der Extraktion wurden glatte Muskelzellen der Blutgefäße drei Tage lang in Medium, das 0,5 % fetalen Kälberserum enthielt, mit entweder 50 bis 500 Mikrogramm pro Milliliter Roh- oder gereinigtem Brombeerextrakt inkubiert. Beide Extrakte zeigten sich wirksam bei der Verringerung der basalen Phosphorylierung von ERK.

Jedoch wird bei 100 Mikrogramm pro Milliliter eine starke Herunterregulation durch den gereinigten Extrakt beobachtet, während 400 bis 500 Mikrogramm pro Milliliter rohem Extrakt erforderlich sind. Dies deutet darauf hin, dass die höhere Wirksamkeit des gereinigten Extrakts bei der Hemmung der ERK-Phosphorylierung auf seinen höheren Gehalt an Polyphenolverbindungen zurückzuführen ist. Danach werden VSMCs 24 Stunden lang mit 200 Mikrogramm pro Milliliter gereinigtem Brombeerextrakt behandelt, bevor 100 Nanomol Angiotensin II zugegeben werden. Wie zuvor berichtet, verringert der Polyphenol-Extrakt aus Brombeeren die durch Angiotensin II induzierte ERK-Phosphorylierung, zeigt jedoch keine Wirkung auf die Expression von Katalase oder SOD2.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Extraktion von Polyphenolen innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Diese Methode kann Forschern auf dem Gebiet der funktionellen Lebensmittel dabei helfen, die Rolle von Polyphenolen in vitro und in tierexperimentellen Modellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, Polyphenole aus Obst und Gemüse zu extrahieren und zu reinigen sowie die gewonnenen Polyphenolextrakte zur Behandlung von Zellen in Kultur zu verwenden.

Wir haben diese Methode verwendet, um die Rolle von Brombeer-Polyphenolen bei der Verhinderung der Alterung aortaler glatter Gefäßmuskelzellen nachzuweisen. Dies ist bedeutend, da die Alterung des Gefäßsystems ein wesentlicher Risikofaktor für die Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen ist.