Name: Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Lernen Sie die Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver mittels ultraschallgestützter Ethanolextraktion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kardioprotektiver Effekte an vaskulären glatten Muskelzellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (14GRNT20180028) und dem Florida State University Council über Forschung und Kreativität (COFRS) finanziert.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie 80% Ethanol (100 ml) vor, indem Sie 80 ml absolutem Ethanol (Molekularbiologie-Klasse) und 20 ml Zellkultur-sterilem Wasser mischen. </li><li> Zur Herstellung von Polyphenol-Extrakt (10 mg / ml) wiegen 10 mg CE oder PE. Füge 1 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) unter einer Zellkultur Kapuze hinzu. Vortex die Lösung. Aliquot in 200-μL-Portionen und bei -20 ° C aufbewahren. </li><li> Lysepuffer vorbereiten <ol><li> Fügen Sie 5 ml 1 M HEPES-Stammlösung (pH 7,4, 50 mM endgültig), 1 ml 5 M NaCl-Stammlösung (50 mM endgültig), 1 ml 0,5 M EDTA-Stammlösung (5 mM endgültig), 2 ml 0,5, hinzu M NaF-Stammlösung (10 mM endgültig), 286 μl 700 mM Na 3 VO 4 Stammlösung (2 mM endgültig), 5 mL 200 mM Na 4 P 2 O 7 Stammlösung (10 mM endgültig) und 5 mL 20% Triton-X-100 Stammlösung in Wasser (1% endgültig) hergestellt. Füge Wasser hinzu, um ein Volumen von 100 ml zu erreichen. Bei 4 ° C aufbewahren. </li><lI&gt; 10 μl / ml Protease-Inhibitor-Cocktail zugeben. Fügen Sie frisch hinzu, wenn die Zellen zur Lyse bereit sind. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Laemmli Probenpuffer (4x) vor. <ol><li> Füge 31,25 ml 2 M Tris-Stammlösung (pH 6,8), 100 ml Glycerin, 50 ml einer in Wasser hergestellten 20% igen Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung und 50 ml β-Mercaptoethanol zu. Füge Wasser bis zu 250 ml hinzu. Bei 4 ° C aufbewahren. </li></ol></li><li> Zur Herstellung von Tris-gepufferten Saline (TBS) -Puffer, wiegen Sie 3 g Tris (25 mM endgültig), 0,18 g KCl (2,5 mM endgültig) und 8,76 g NaCl (150 mM endgültig). Den pH-Wert auf 7,4 einstellen und bis zu 1 L Wasser auffüllen. Bei RT halten. </li><li> Zur Herstellung von TBS-T werden 997,5 ml TBS und 2,5 ml einer 20% igen Triton-X-100-Lösung in Wasser zugesetzt. Bei RT halten </li></ol> 2. Vorbereitung von Blackerry-Extrakten <ol><li> Herstellung von Rohextrakt aus gefriergetrocknetem Beerenpulver. <ol><li> 10 g gefriergetrocknetes Brombeerpulver (oder 5 g frisches Pulver) wiegen. Wenn gefrorene Früchte verwendet werden, schneide es iNto sehr kleine Stücke vor Beginn der Extraktion. </li><li> Mischen Sie das Fruchtpulver mit 100 ml 80% igem wässrigem Ethanol in einem 1 l Rundboden-Erlenmeyerkolben. </li><li> Sonde die Mischung für 20 min bei 42 kHz, 135 W mit einem Ultraschallbad bei 25 ° C, ohne jegliches Zeitintervall dazwischen. Führen Sie die Beschallung mit kontinuierlicher Stickstoffspülung in gedämpftem Licht durch. Bei gefrorenen Früchten die Inkubationszeit auf 4 h erhöhen. </li><li> Filtriere die Mischung durch ein # 2 Filterpapier unter Verwendung eines gekühlten Buchner-Trichters mit Vakuumsaugung. HINWEIS: Am Ende dieses Schrittes erscheinen Reste der Probe auf dem Filterpapier; Das heißt Filterkuchen. </li><li> Spülen Sie den Filterkuchen mit 50 ml 100% igem Ethanol ab. Das Filtrat abspülen und den Filterkuchen in einen 1 l Rundkolben geben, der 100 ml 80% iges wässriges Ethanol enthält. </li><li> Wiederholen Sie den Extraktionsvorgang für den Rückstand (Schritte 2.1.2 - 2.1.4). </li><li> Kombinieren Sie die beiden Filtrate in einen Rundkolben mit zusätzlichen 50 mlVon 80% igem wässrigem Ethanol. HINWEIS: Das Endvolumen sollte ca. 300 ml betragen. </li><li> Verwenden Sie einen Rotationsverdampfer bei 62 ° C und 50 U / min, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis der Ethanol nicht mehr verdunstet. HINWEIS: Dieser Vorgang dauert ca. 45 min. </li><li> Übertragen Sie die Probe auf ein 50 ml konisches Rohr. Verdampfen des Ethanols durch Einspritzen von Stickstoffgas an der Oberseite des Röhrchens für 10 min. HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um die vollständige Verdunstung des Ethanols zu gewährleisten. Das Volumen der Probe beträgt bei diesem Schritt etwa 20 ml. </li><li> Einfrieren der Probe bei -80 ° C für mindestens 24 h. HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um einen effizienteren Gefriertrocknungsprozess zu ermöglichen. </li><li> Gefriertrocknen Sie die Probe bei -50 ° C für ca. 8 h. Die Proben bei -20 ° C aufbewahren. HINWEIS: Der Gefriertrockner schafft ein kraftvolles Vakuum bei -50 ° C in der Kammer, um die Proben zu trocknen, aber bewahrt die meisten Verbindungen, wie PolypheNols </li></ol></li><li> Herstellung von gereinigten Polyphenol-Extrakten aus Rohextrakten. <ol><li> Wiegen der gefriergetrockneten extrahierten Proben. HINWEIS: Das Volumen des Extraktes bei diesem Schritt beträgt ca. 10 ml. </li><li> Füge dem Rohextrakt zwei Volumina (~ 20 ml) Chloroform zu und schüttele die Lösung 5 min in einer Rührplatte. </li><li> Gießen Sie die Mischung in einen Trenntrichter. Man ließ den Rohextrakt 1 h bei RT dekantieren, um die gereinigte Fraktion zu erhalten. HINWEIS: Bei diesem Schritt bildet sich eine zweiphasige Mischung. </li><li> Die untere Schicht (Chloroformphase) aus dem Scheidetrichter verwerfen und die wässrige Schicht in einen sauberen Becher geben. </li><li> Zugabe von zwei Volumina Ethylacetat zu der wässrigen Fraktion und Verwendung eines Magnetrührers, um das Gemisch 5 min bei RT zu rühren. </li><li> Filterung der Mischung durch # 2 Filterpapier unter Verwendung eines gekühlten Buchner-Trichters mit Vakuumsaugung. </li><li> Sammeln Sie die gefilterte Probe und übertragen Sie sie zu einem Rundkolben, um uns zu seinMit dem Rotationsverdampfer. </li><li> Den Rotationsverdampfer auf 62 ° C und 50 U / min stellen und das Ethylacetat ca. 30 min verdampfen. </li><li> Gefriertrocknen Sie die Probe bei -50 ° C für ca. 8 h. Übertragen Sie die Probe auf ein 50 mL konisches Rohr und bewahren Sie es bei -20 ° C auf. </li></ol></li></ol> 3. Behandlung von VSMCs mit Beerenextrakten <ol><li> VSMCs Kultur. <ol><li> Isoliere VSMCs aus den Thorax-Aorta von Sprague-Dawley-Ratten durch die Durchführung einer enzymatischen Verdauung, wie zuvor beschrieben 29 . Kultur die VSMCs wie beschrieben 29 . </li><li> Vorbereiten des vollständigen Mediums für die Kultur von VSMCs unter Verwendung von DMEM, enthaltend 1 g / l Glucose und ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. Das gesamte Medium bei 4 ° C aufbewahren. </li></ol></li><li> Inkubation von VSMCs mit Polyphenol-Extrakten. <ol><li> Um die VSMCs zu teilen, verwerfe die KultRe mittel und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Fügen Sie 4 ml PBS und 2 ml Trypsin EDTA 0,25% hinzu. Inkubieren der Zellen für 5 min bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. <ol><li> Sammeln Sie die Zellen, mischen Sie sie mit 2 ml Vollmedium in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 1.100 × g für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit 1 ml PBS resuspendieren. Zähle die Zellen mit einem Hämocytometer. </li><li> Samen 50.000 VSMCs pro Vertiefung in 6-Well-Kulturplatten und wachsen sie in komplettem Medium mit 10% FBS, bis sie 90% Konfluenz erreichen (ca. 3 d). Halten Sie die VSMCs bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 Inkubator. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Medium für die Behandlung mit DMEM-Medium mit 1 g / l Glucose, 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 0,5% FBS vor. Das Behandlungsmedium bei 4 ° C aufbewahren. HINWEIS: Polyphenol-Extrakte und Ang II werden direkt zu Zellen mit diesem mir hinzugefügtDium </li><li> Eine Stammlösung von 10 mg / ml Rohextrakt (CE) oder gereinigtem Extrakt (PE) von Polyphenolen vorbereiten, indem man 10 mg Extrakt in 1 ml DMM-Medium auflöst. Halten Sie den Bestand in 200 μl Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Inkubieren der VSMCs mit 2 ml Behandlungsmedium, enthaltend 0,5% FBS und fügen entweder CE- oder PE-Extrakte hinzu, um eine Konzentration von 50 - 500 μg / ml zu erreichen. Wechseln Sie das Medium alle 24 Stunden durch Zugabe von frischen Polyphenol-Extrakten. Behandle die Zellen für 3 d. </li><li> Zur Behandlung mit Ang II oder anderen Hormonen und Wachstumsfaktoren verhungern die Zellen für mindestens 24 h durch Inkubieren der Zellen mit Behandlungsmedium mit 0,5% FBS vor der Zugabe von Ang II (100 nM). ANMERKUNG: Inkubation mit und ohne CE und PE in 0,5% FBS Behandlungsmedium vor der Zugabe von Ang II wird empfohlen. <ol><li> Nach 24 h Hunger fügen Sie 100 nM Ang II hinzu. Ersetzen Sie das Behandlungsmedium mit frischem CE, PE oder Ang II alle 24 h für 3 d. </li></ol></li></ol></li><li> Vorbereitung von Zellproben <ol><li> Die behandelten Zellen zweimal in kaltem PBS waschen und mit 200 μl Lysepuffer auf Eis lysieren. </li><li> Sammeln von Zelllysaten unter Verwendung von Zellschabern und übertragen die Lysate auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Gesamtzelllysate für 20 min auf Eis und verwirbeln Sie alle 5 min. </li><li> Sonden Sie die Zellextrakte mit drei Bursts bei 125 W für jeweils 10 s, mit einer 2 s Pause dazwischen. Halten Sie die Proben auf Eis während der Beschallung. </li><li> Messen Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung eines Protein-Assay-Reagens bei 595 nm. </li><li> Die Proben bei -20 ° C zur Analyse durch Western Blot aufbewahren. </li></ol></li><li> Westlicher Fleck. <ol><li> Mischen Sie gleiche Mengen an Protein (ca. 50 μg) aus kontrollierten nicht behandelten und mit Polyphenol behandelten oder mit AngII behandelten Proben mit Lysepuffer, um ein maximales Gesamtvolumen von 50 μl zu erhalten. Füge 16 μl eines 4x Laemmli Probenpuffers hinzu. Die Proben 5 Minuten bei 75 ° C erhitzen. </li><li> Trennen Sie den SamplEs in 10% SDS-PAGE-Gelen und transferiert sie auf PDVF-Membranen bei 10 V für 75 min in einem halbtrockenen Transfersystem für die Western-Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern. </li><li> Blockieren Sie die Membran mit 2% Milch in TBS 0,05% Triton-X100 Puffer (TBS-T) für 20 min. </li><li> Entfernen Sie die Milch, indem Sie die Membran mindestens dreimal mit TBS (jeweils 5 min) waschen und mit primären Antikörpern für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Die Membran dreimal, jeweils 10 min, mit TBS-T waschen und mit einem HRP-verknüpften sekundären Antikörper für 45 min inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal, jeweils 10 min, mit TBS-T und entwickeln Sie durch verbesserte Chemilumineszenz (ECL). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biological+effects+of+dietary+phenolic+compounds%3A+relevance+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).</li>
<li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664075">Gut microbiota in health and disease.</a> Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).</li>
<li>Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols%3A+food+sources+and+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Polyphenols: food sources and bioavailability.</a> Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).</li>
<li>Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onions--a+global+benefit+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother+Res%22%5BJournal%5D)">Onions--a global benefit to health.</a> Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).</li>
<li>Mazzoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+aspects+of+berries%3A+from+field+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sci+Food+Agric%22%5BJournal%5D)">The genetic aspects of berries: from field to health.</a> J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).</li>
<li>Wang, S. Y., Jiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenging+capacity+of+berry+crops+on+superoxide+radicals%2C+hydrogen+peroxide%2C+hydroxyl+radicals%2C+and+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen.</a> J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).</li>
<li>Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+black+raspberry+seed+containing+anthocyanins+against+oxidative+damage+to+DNA%2C+protein%2C+and+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid.</a> J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).</li>
<li>Forbes-Hernandez, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Healthy+Effects+of+Strawberry+Polyphenols%3A+Which+Strategy+behind+Antioxidant+Capacity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Food+Sci+Nutr%22%5BJournal%5D)">The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).</li>
<li>Figueira, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+a+blueberry+extract+in+acute+inflammation+and+collagen-induced+arthritis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat.</a> Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).</li>
<li>Daglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyphenols as antimicrobial agents.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).</li>
<li>Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenol+protection+and+treatment+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Polyphenol protection and treatment of hypertension.</a> Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).</li>
<li>Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+Efficacy+of+Polyphenols+and+Their+Combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations.</a> Nutrients. 8 (9), E552(2016).</li>
<li>Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+raspberries+in+cancer+clinical+trials%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Berry+Res%22%5BJournal%5D)">Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future.</a> J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).</li>
<li>Hertog, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+intake+and+long-term+risk+of+coronary+heart+disease+and+cancer+in+the+seven+countries+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study.</a> Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).</li>
<li>Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+flavonoids+and+cardiovascular+disease+incidence+or+mortality+in+European+and+US+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Rev%22%5BJournal%5D)">Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations.</a> Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).</li>
<li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+anthocyanin+intake+is+associated+with+a+reduced+risk+of+myocardial+infarction+in+young+and+middle-aged+women%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women.</a> Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).</li>
<li>Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+flavonoid+intakes+and+CVD+incidence+in+the+Framingham+Offspring+Cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort.</a> Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).</li>
<li>Aghababaee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+blackberry+%28Morus+nigra+L.%29+consumption+on+serum+concentration+of+lipoproteins%2C+apo+A-I%2C+apo+B%2C+and+high-sensitivity-C-reactive+protein+and+blood+pressure+in+dyslipidemic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Res+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients.</a> J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).</li>
<li>Jeong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Rubus+occidentalis+extract+on+blood+pressure+in+patients+with+prehypertension%3A+Randomized%2C+double-blinded%2C+placebo-controlled+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial.</a> Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).</li>
<li>Jia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antihypertensive+effect+of+ethyl+acetate+extract+from+red+raspberry+fruit+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogn+Mag%22%5BJournal%5D)">The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats.</a> Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).</li>
<li>Feresin, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blackberry%2C+raspberry+and+black+raspberry+polyphenol+extracts+attenuate+angiotensin+II-induced+senescence+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Funct%22%5BJournal%5D)">Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells.</a> Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).</li>
<li>Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+biosynthesis+by+anthocyanin+fraction+of+blackberry+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract.</a> Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).</li>
<li>Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+chemoprevention+of+black+raspberry+extracts%3A+from+transcription+factors+to+their+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes.</a> Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+extract+of+unripe+Rubus+coreanus+fruit+attenuates+atherosclerosis+by+improving+blood+lipid+profile+and+inhibiting+NF-%CE%BAB+activation+via+phase+II+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression.</a> J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).</li>
<li>Wang, J., Mazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anthocyanins+and+other+phenolic+compounds+on+the+production+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+LPS%2FIFN-gamma-activated+RAW+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages.</a> J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).</li>
<li>Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavanols+and+anthocyanins+in+cardiovascular+health%3A+a+review+of+current+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence.</a> Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).</li>
<li>Kim, D. O., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142913.fai0102s06/abstract">Extraction and Isolation of Polyphenolics.</a> Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).</li>
<li>Queires, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+purified+from+the+Brazilian+aroeira+plant+%28Schinus+terebinthifolius%2C+Raddi%29+induce+apoptotic+and+autophagic+cell+death+of+DU145+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells.</a> Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).</li>
<li>Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phosphatidylinositol-specific+phospholipase+C+from+cultured+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells.</a> J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).</li>
<li>Vuong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+polyphenol-enriched+preparation+on+chemoprevention+of+mammary+carcinoma+through+cancer+stem+cells+and+inflammatory+pathways+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation.</a> J Transl Med. 14, (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Polyphenole, die aus Beeren isoliert sind, enthalten unterschiedliche Kompositionen. Das hier beschriebene Ethanol-basierte Extraktionsprotokoll ermöglichte die Identifizierung verschiedener Phenolsäuren und Flavonoide, die in rohen und gereinigten Polyphenol-Extrakten von BL vorliegen ( Tabelle 1 ). CE wurde mit Gallussäure, Ferulasäure, 4-O-Caffeochininsäure und 5-O-Caffeoylchininsäure angereichert. Der Reinigungsprozess änderte die Mengen an Gallussäure und p-Cumarsäure nicht signifikant. Allerdings ...

Polyphenole sind Verbindungen, die mindestens einen phenolischen Ring in ihrer Struktur enthalten und im Pflanzenreich reichlich vorhanden sind. Menschen verbrauchen Pflanzen seit Jahrtausenden für medizinische Zwecke, ohne sich der Existenz solcher Verbindungen bewusst zu sein 2 . Viele Früchte und Gemüse haben einige geteilte polyphenolische Verbindungen, wenn auch mit unterschiedlichen Mengen, einschließlich Flavonoide, Stilbene und Phenolsäuren 3 . Obwohl Polyphenole oft mit bunten Früchten und Gemüse verbunden sind, ist dies nicht strikt wahr. Zum Beispiel sind Zeaxanthin und Xanthin in Gemüse, die nicht sehr bunt sind, wie Zwiebeln und Knoblauch, die aus der Familie der Schalotten sind und sind mit zahlreichen gesundheitlichen Vorteile verbunden 4 vorhanden . Abgesehen davon, dass sie mit mehreren gesundheitlichen Vorteilen verbunden sind, dienen Polyphenole auch Pflanzen, indem sie sie vor Insekten schützenD Ultraviolettstrahlung 2 . Polyphenole werden häufig in der menschlichen Ernährung gefunden und gelten als leistungsstarke Antioxidantien, da sie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 6 , 7 , 8 fangen können. Sie haben auch entzündungshemmende 9 , antimikrobielle 10 , antihypertensive 11 und anti-karzinogene 12 , 13 Eigenschaften. Epidemiologische Studien zeigen eine umgekehrte Assoziation zwischen dem Verzehr von Flavonoiden und Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) Inzidenz 16 , 17 und Mortalität 14 , 15 . Beeren sind in den USA weit verbreitet und haben hohe Mengen an Polyphenolen, einschließlich Flavonoide. Zum Beispiel, Verbrauch von Brombeere (BL) Saft (300<html> ML / d) für acht Wochen signifikant den systolischen Blutdruck bei dyslipidämischen Patienten verringert 18 . Jeong et al. 19 berichteten, dass vorhypertensive Männer und Frauen, die 2,5 g schwarze Himbeere (BRB) Extrakt pro Tag verbrauchen, einen niedrigeren 24-Stunden- und Nacht-Blutdruck im Vergleich zu denen hatten, die ein Placebo verbrauchten. Himbeeren (RB) verringerten den Blutdruck bei gleichzeitiger Erhöhung der Expression von Superoxid-Dismutase (SOD) bei spontan hypertensiven Ratten 20 . Es wurde kürzlich gezeigt, dass BL, RB und BRB die Niveaus von ROS und Seneszenz reduzieren, die durch Angiotensin II (Ang II) in vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) induziert werden. Darüber hinaus reduzierte die Anthocyaninfraktion aus BL-Extrakt die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) und hemmte die Aktivität von Nuklearfaktor kappa B (NF- &amp; kgr; B) und extrazellulärer signalregulierter Kinase (ERK) in Lipopolysaccharid (LPS) -stimuliert J774-ZellenAss = &quot;xref&quot;&gt; 22 BRB-Extrakte verringerten die NF-κB-Aktivierung und die Cyclooxygenase 2 (COX-2) -Expression in vitro 23 , verbesserten das Lipidprofil und verhinderten die Bildung von Atherosklerose-Läsionen bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät versorgt wurden. Anthocyanine, die als die häufigsten Flavonoide in Beeren angesehen werden, modulieren die Entzündungsreaktion in LPS-stimulierten RAW 264.7-Makrophagen durch Verringerung der Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α) -Produktion 25 und verringern die Proliferation und Migration von VSMCs 26 . Da es zunehmendes Interesse am Verständnis der Rolle der Polyphenole in der menschlichen Gesundheit und Krankheit gibt, ist es wichtig, die Extraktionsmethode zu optimieren. Die Lösemittel-Extraktion wird hierfür weit verbreitet, da sie kostengünstig und leicht reproduzierbar ist. In dieser Studie wurde eine Lösungsmittelextraktion mit Ethanol, zusammen mit einem Ultraschall-unterstützten Extrakt, verwendetN-Methode, die von Kim und Lee 27 angepasst wurde. Die Reinigung und Fraktionierung von Rohextrakten (CE) unter Verwendung von Chloroform und Ethylacetat wurde durchgeführt, um die gereinigte Extrakt (PE) -Fraktion zu erhalten, die von Queires et al. 28 angepasst wurde. Weiterhin wurde die Wirksamkeit von rohen versus gereinigten Polyphenol-Extrakten aus BL bei der Verringerung der basalen Phosphorylierung von ERK1 / 2 verglichen und repräsentative Beispiele für die hemmende Wirkung von gereinigtem BL-Polyphenol-Extrakt auf Ang-II-induzierte Signalisierungsreduktionen in VSMCs wurden bereitgestellt.

<table><tbody><tr><td>Angiotensin II</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9525-10MG</td><td>Behandlung von VSMCs</td></tr><tr><td>&beta;-Aktin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2228</td><td>Primärer Antikörper (1:5000)</td></tr><tr><td>Brombeerfrucht</td><td>Mercer Foods</td><td></td><td>Gefriergetrocknete Brombeerpulver</td></tr><tr><td>Katalase&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>Primärer Antikörper (1:1000)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>Zubereitung von gereinigten Polyphenol-Extrakten</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM</td>)<td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>Kultur von VSMCs</td></tr><tr><td>Ethanol (absolute molekularbiologische Qualität)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E7023-500ML</td><td>Zubereitung von Polyphenol-Extrakten</td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>439169</td><td>Herstellung von gereinigten Polyphenol-Extrakten</td></tr><tr><td>ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9102S</td><td>Primärer Antikörper (1:500)</td></tr><tr><td>EDTA, 500 mM, pH 8,0</td><td>Teknova, Inc.</td><td>E0306</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>Labconco</td><td>VirTis Benchtop K</td><td>Aufbereitung von Polyphenolextrakten</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>Lyse-Puffer&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc.</td><td>7760</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&nbsp;</td><td>Lyse-Puffer</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Na4P2O7 , Decahydrat</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Phospho ERK1/2&nbsp;</td><td>Zellsignaltechnologie, Inc.</td><td>9101S</td><td>Primärer Antikörper (1:1000)</td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5ml</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Proteinassay Farbstoffreagenz</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td>Messung der Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>PVDF-Transfermembran</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>Western Blots</td></tr><tr><td>Rotatorischer Verdampfer</td><td>Büchi Labortechnik</td><td>Rotavapor R3000</td><td>Aufbereitung von Polyphenol-Extrakten</td></tr><tr><td>Sterilwasser</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>Aufbereitung von Polyphenol-Extrakten</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>Aufbereitung von Zellextrakten</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>Primärer Antikörper (1:1000)</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>X100</td><td>Western Blots</td></tr><tr><td>Whatman #2 Filterpapier</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>Zubereitung von Polyphenol-Extrakten</td></tr></tbody></table>

extraktion und reinigung von polyphenolen aus gefriergetrocknetem beerenpulver zur behandlung von vaskulären glatten muskelzellen<em&gt; in vitro</em

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Epidemiologische Studien zeigen, dass eine erhöhte Flavonoidaufnahme mit einer verminderten Mortalität aufgrund von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) in den USA (USA) und Europa korreliert. Beeren sind in den USA weit verbreitet und haben einen hohen Polyphenolgehalt. Es wurde gezeigt, dass Polyphenole mit vielen molekularen Targets in Wechselwirkung treten und zahlreiche positive biologische Funktionen ausüben, darunter antioxidative, entzündungshemmende und kardioprotektive Effekte. Polyphenole, die aus Brombeeren (BL), Himbeere (RB) und schwarzer Himbeere (BRB) isoliert wurden, reduzieren den oxidativen Stress und die zelluläre Seneszenz als Reaktion auf Angiotensin II (Ang II). Diese Arbeit liefert eine detaillierte Beschreibung des Protokolls zur Herstellung der Polyphenolextrakte aus gefriergetrockneten Beeren. Polyphenol-Extraktionen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver wurden unter Verwendung von 80% igem wässrigem Ethanol und einem Ultraschall-unterstützten Extraktionsverfahren durchgeführt. Der Rohextrakt wurde weiter gereinigt und mit Chloroform und Ethylacetat fraktioniert,beziehungsweise. Die Effekte von sowohl rohen als auch gereinigten Extrakten wurden an vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in Kultur getestet.

Es wurde zuvor gezeigt, dass Polyphenolextrakte, die aus BL, RB und BRB isoliert wurden, die Seneszenz von VSMCs als Reaktion auf Ang II 21 reduzierten. Es wurde gezeigt, dass diese gereinigten Polyphenolextrakte die Ang II-Signalisierung modulieren, indem sie die Phosphorylierung von Akt, p38 Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK) und ERK1 / 2 reduzieren. BL verhindert die Alterung durch die Verringerung der Expression der NADPH-Oxidase (Nox) 1, eines Enzyms, d...

Diese Arbeit beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Herstellung von Polyphenol-reichen Extrakten aus gefriergetrockneten Beerenpulver. Darüber hinaus gibt es eine gründliche Beschreibung der Verwendung dieser Polyphenol-reichen Extrakte in der Zellkultur in Gegenwart des Peptidhormons Angiotensin II (Ang II) unter Verwendung von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs).

Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen<em&gt; In vitro</em

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Extraktion und Reinigung pflanzlicher Polyphenole bereitzustellen, die zukünftig zur Behandlung von Zellen verwendet werden könnten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Rolle von Lebensmitteln für die menschliche Gesundheit und bei Krankheiten zu beantworten. Die ethanolbasierte und ultraschellunterstützte Polyphenol-Extraktion ist eine einfache und reproduzierbare Methode, die eine höhere Ausbeute an Polyphenolen ermöglicht.Die Verwendung von Chloroform ermöglicht die Entfernung von Zuckern, Fettsäuren, Proteinen und anderen Molekülen, während Essigsäureethylester eine Fraktionierung der Polyphenole erlaubt. Diese angereicherten Polyphenol-Extrakte können anschließend in vitro und in vivo verwendet werden, um die Wirkungen von Polyphenolen sowie deren Wirkmechanismen auf verschiedene Gewebe – wie hier beschrieben das kardiovaskuläre System – zu untersuchen. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Reagenzien gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.Als Nächstes wiegen Sie 10 Gramm gefriergetrocknetes Brombeerpulver ab. Geben Sie das Beerenpulver in einen einliterigen Rundkolben, der 100 Milliliter 80%ige wässrige Ethanol enthält. Stellen Sie den Kolben in ein Ultraschallbad bei 25 Grad Celsius.Unter kontinuierlicher Stickstoffspülung im abgedunkelten Licht das Gemisch 20 Minuten lang bei 42 Kilohertz und 135 Watt beschallen. Danach das Gemisch mit einem gekühlten Büchner-Trichter unter Vakuumabsaugung über ein Filterpapier der Nummer zwei filtrieren. Den Filterkuchen mit 50 Milliliter 100%igem Ethanol ausspülen.Speichern Sie das Filtrat und geben Sie den Filterkuchen in einen einliterigen Rundkolben, der 100 Milliliter 80%igen wässrigen Ethanol enthält. Wiederholen Sie anschließend den Extraktionsprozess, indem Sie das Gemisch beschallen, filtrieren und waschen. Vereinigen Sie die beiden Filtrate in einem Rundkolben, der 50 Milliliter 80%igen wässrigen Ethanol enthält.Verdampfen Sie das Lösungsmittel unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 62 Grad Celsius und 50 U/min. Fahren Sie damit fort, bis kein Ethanol mehr verdampft. Überführen Sie die Probe anschließend in ein 50-Milliliter-Konischgefäß.Stick Stickstoffgas 10 Minuten lang an die Oberseite des Reagenzglases, um verbleibenden Ethanol zu verdampfen. Gefrieren Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden ein. Anschließend gefriertrocknen Sie die Probe bei minus 50 Grad Celsius für etwa acht Stunden.Lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius, bis sie verwendet werden. Wiegen Sie zunächst die gefriergetrockneten extrahierten Proben ab. Geben Sie etwa 20 Milliliter Chloroform zu einem 100-Milliliter-Becher mit der Probe hinzu.Unter Verwendung einer Rührplatte die Lösung fünf Minuten lang mischen. Anschließend die Mischung in ein Trennfunnel geben. Den Rohextrakt eine Stunde lang bei Raumtemperatur abtrennen lassen. Danach die untere Phase verwerfen und die wässrige Phase in einen sauberen Becher sammeln. Zwei Volumina Ethylacetat zum Becher hinzufügen. Das Gemisch unter Verwendung eines magnetischen Rührstabs fünf Minuten lang bei Raumtemperatur rühren. Als Nächstes verwenden Sie einen gek&uuml;hlten B&uuml;chner-Trichter mit Vakuumsaugung, um die Mischung &uuml;ber Filterpapier Nummer zwei zu filtrieren. &Uuml;berf&uuml;hren Sie die filtrierte Probe in einen Rundkolben. Verdampfen Sie das Ethylacetat unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 62 Grad Celsius und 50 Umdrehungen pro Minute f&uuml;r 30 Minuten.Anschließend das Probenmaterial bei minus 50 Grad Celsius acht Stunden lang gefriertrocknen. Die Probe in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführen und bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis sie verwendet wird. Nach der Kultivierung der vaskulären glatten Muskelzellen das Kulturmedium verwerfen und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen.Danach vier Milliliter PBS und zwei Milliliter 0,25 %iges Trypsin-EDTA hinzufügen. Im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Anschließend die Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen, das zwei Milliliter komplettes Medium enthält.Zentrifugieren bei 1.100 × g für fünf Minuten. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit einem Milliliter PBS erneut suspendieren. Die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.Danach 50.000 Zellen pro Vertiefung in sechs-Vertiefungs-Kulturplatten ansäen. Die Zellen in komplettem Medium, das 10 % fetalen Kälberserum enthält, bis zu 90 % Konfluenz kultivieren. Das Behandlungsmedium gemäß der schriftlichen Anleitung herstellen und bei vier Grad Celsius lagern.Anschießend 10 Milligramm entweder roher oder gereinigter Extrakt zu einem Milliliter ungesättigtem DMEM hinzufügen, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Die Stammlösung in Aliquots zu je 200 Mikroliter bei minus 20 Grad Celsius lagern. Danach zwei Milliliter Behandlungsmedium, das 0,5 % fetalen Kälberserum und die gewünschte Konzentration der Stammlösung enthält, zu den Zellen geben.Die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator inkubieren. Anschließend, falls mit Hormonen oder Wachstumsfaktoren behandelt wird, die Zellen mindestens 24 Stunden lang durch Inkubation mit Behandlungsmedium, das 0,5 % fetalen Kälberserum enthält, hungern lassen. Nach der Hungerphase das gewünschte Hormon hinzufügen und das Behandlungsmedium alle 24 Stunden für drei Tage erneuern, wie im Textprotokoll beschrieben.Als Nächstes die behandelten Zellen zweimal mit kaltem PBS waschen. Die Zellen mit 200 µL Puffer zur Zelllyse auf Eis lysieren. Mit Zellabstreifern das Zelllysat sammeln und in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Die gesammelte Lyseprobe 20 Minuten auf Eis inkubieren, dabei alle fünf Minuten kurz wirbeln. Danach die Zellextrakte mit drei Impulsen à 10 Sekunden bei 125 Watt beschallen, wobei zwischen den Impulsen jeweils eine Pause von zwei Sekunden eingelegt wird. Mithilfe eines Protein-Assay-Reagenzes bei 595 Nanometern die Protein-Konzentration bestimmen.Vermischen Sie 50 Mikrogramm Protein mit Lysepuffer, um ein maximales Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern zu erhalten. Geben Sie 16 Mikroliter eines 4x Laemmli-Probelösepuffers hinzu. Anschließend erhitzen Sie die Proben fünf Minuten bei 75 Grad Celsius.Trennen Sie die Proben in 10 %igen SDS-PAGE-Gelen und übertragen Sie sie für die Western-Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern auf PVDF-Membranen. In dieser Studie wurde eine ethanolbasierte Extraktion verwendet, um die unterschiedlichen Gehalte an Phenolsäuren und Flavonoiden in rohen und gereinigten polyphenolischen Brombeerextrakten zu identifizieren. Während der Reinigungsprozess die Gehalte an Gallussäure oder p-Cumarsäure nicht signifikant veränderte, erhöhte er die Gehalte an 3-O-Caffeoylchininsäure von 170,5 auf 235,3 ppm und an Quercetin von 24,5 auf 95 ppm.Im Gegensatz dazu gingen Ferulasäure und Rutin während der Reinigung des Rohextrakts verloren. Nach der Extraktion wurden glatte Muskelzellen der Blutgefäße drei Tage lang in Medium, das 0,5 % fetalen Kälberserum enthielt, mit entweder 50 bis 500 Mikrogramm pro Milliliter Roh- oder gereinigtem Brombeerextrakt inkubiert. Beide Extrakte zeigten sich wirksam bei der Verringerung der basalen Phosphorylierung von ERK.Jedoch wird bei 100 Mikrogramm pro Milliliter eine starke Herunterregulation durch den gereinigten Extrakt beobachtet, während 400 bis 500 Mikrogramm pro Milliliter rohem Extrakt erforderlich sind. Dies deutet darauf hin, dass die höhere Wirksamkeit des gereinigten Extrakts bei der Hemmung der ERK-Phosphorylierung auf seinen höheren Gehalt an Polyphenolverbindungen zurückzuführen ist. Danach werden VSMCs 24 Stunden lang mit 200 Mikrogramm pro Milliliter gereinigtem Brombeerextrakt behandelt, bevor 100 Nanomol Angiotensin II zugegeben werden. Wie zuvor berichtet, verringert der Polyphenol-Extrakt aus Brombeeren die durch Angiotensin II induzierte ERK-Phosphorylierung, zeigt jedoch keine Wirkung auf die Expression von Katalase oder SOD2.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Extraktion von Polyphenolen innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Diese Methode kann Forschern auf dem Gebiet der funktionellen Lebensmittel dabei helfen, die Rolle von Polyphenolen in vitro und in tierexperimentellen Modellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, Polyphenole aus Obst und Gemüse zu extrahieren und zu reinigen sowie die gewonnenen Polyphenolextrakte zur Behandlung von Zellen in Kultur zu verwenden.Wir haben diese Methode verwendet, um die Rolle von Brombeer-Polyphenolen bei der Verhinderung der Alterung aortaler glatter Gefäßmuskelzellen nachzuweisen. Dies ist bedeutend, da die Alterung des Gefäßsystems ein wesentlicher Risikofaktor für die Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen ist.

extraction-purification-polyphenols-from-freeze-dried-berry-powder

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Hier werden Bioassays zur Überwachung der Entwicklung der pilzliche Erreger, Colletotrichum Fioriniae, im Beisein von Heidelbeeren oder Preiselbeeren floral Auszüge auf Glasdeckgläser beschrieben. Wasser, Chloroform und Feld Regenwasser - basierte floral Extraktion, die Techniken detailliert sind, sowie Einblick, wie diese Information angewendet werden kann.

Colletotrichum fioriniae Entwicklung in Wasser und Chloroform-basierte Heidelbeere und Cranberry Floral Extrakte

Wir haben ein Protokoll optimiert, um murine Herzpericyten für die Grundlagenforschung und die Erforschung ihres biologischen und therapeutischen Potenzials zu isolieren und zu reinigen.

Isolierung und Reinigung von murinen Herzperizyten

Wir präsentieren ein Protokoll zur Extraktion von murinen hirnebralen Pericyten. Basierend auf einer antibiotikafreien Anreicherungs-orientierten Pericyt-Extraktion ist dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien, die eine hohe Reinheit und hohe Ausbeute bieten und somit die Anzahl der verwendeten Versuchstiere verringern.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

Das Ziel dieses Protokolls ist es, phenolische Metaboliten im Plasma mit einer semi-zielgerichteten Chromatographie-Massenspektrometrie-Methode nachzuweisen.

Semi-zielgerichtete Ultra-Hochleistungschromatographie gekoppelt mit massenspektrometrie Analyse von phenolischen Metaboliten im Plasma älterer Erwachsener

Vaskuläre Reaktionen des arteriellen Lungenkreislaufs können mit Hilfe von intrapulmonalen Arterien (IPA) und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) erforscht werden. Die vorliegende Studie beschreibt detailliert die Isolierung von IPA und die Protokolle, die zur Untersuchung der Vasorelaxation als Reaktion auf physiologische Reize verwendet werden.

Isolierung von intrapulmonalen Arterien- und glatten Muskelzellen zur Untersuchung von Gefäßreaktionen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine integrierte Strategie zur Erforschung der wichtigsten Ziele und Mechanismen von Fructus Phyllanthi gegen Hyperlipidämie, basierend auf der Vorhersage der Netzwerkpharmakologie und der Verifizierung der Metabolomik.

Netzwerk Pharmakologische Vorhersage und metabolomische Validierung des Mechanismus von Fructus phyllanthi gegen Hyperlipidämie

Hier stellen wir eine Stabilitätsbewertungsmethode vor, die auf der Mehrfachlichtstreuungstechnologie basiert, um die Stabilität von Extrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin zu bewerten.

Verwendung von Mehrfachlichtstreuung zur Untersuchung der Stabilität von Phyllanthus emblica L. Extrakte, die mit verschiedenen Extraktionsmethoden gewonnen wurden

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines polyolbasierten mikrowellengestützten Extraktionsverfahrens zur Extraktion von phenolischen Verbindungen und natürlichen Antioxidantien, das einen praktischen und ökologisch nachhaltigen Ansatz für die Entwicklung gebrauchsfertiger Extrakte darstellt.

Mikrowellengestützte Extraktion von phenolischen Verbindungen und Antioxidantien für kosmetische Anwendungen mit polyolbasierter Technologie

Dieses Protokoll beschreibt einen hochdurchgestellt kolorimetrischen Methode, die auf der Bildung eines Komplexes zwischen Jod und Ketten von Glucosemolekülen in Stärke beruht. Jod bildet Komplexe mit sowohl Amylose und Amylopektin in langen Ketten. Nach der Zugabe von Jod zu einer Stärkeprobe, die maximale Absorption von Amylose und Amylopektin erfolgt bei 620 und 550 nm auf. Das Amylose / Amylopektin-Verhältnis kann aus dem Verhältnis der 620 und 550 nm Absorptionswerte geschätzt werden und...

Schnelle High Throughput Amylose Bestimmung in Gefriergetrocknete Potato Tuber Proben

DNA-Origami ist eine leistungsfähige Methode zur Herstellung präziser nanoskaliger Objekte durch Programmierung der Selbstorganisation von DNA-Molekülen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Faltung eines bioresponsiven Roboters aus DNA-Origami, seine Aufreinigung und Negativfärbung für die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

Lernen Sie die Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver mittels ultraschallgestützter Ethanolextraktion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kardioprotektiver Effekte an vaskulären glatten Muskelzellen.

Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen In vitro (Video) | JoVE Journal

Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen

Weitere Videos entdecken