Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine gezielte Ablation von Nierenepithelzellen des Zebrafisches zu induzieren, um die Schädigung und Reparatur von Nephronen zu modellieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Organ- und insbesondere der Nierenregeneration zu beantworten. Zum Beispiel, was sind die wichtigsten zellulären Prozesse, die an der Regeneration beteiligt sind, wie hoch ist das Ausmaß der Plastizität des überlebenden Gewebes und vieles mehr.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine präzise räumliche zeitliche Kontrolle der Verletzung sowie die Möglichkeit bietet, den Grad der Verletzung anzupassen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose eines akuten Nierenversagens, da es eine präzise räumliche und zeitliche Beurteilung der zellulären und molekularen Prozesse ermöglicht, die an der Schädigung und Regeneration von Nierenzellen beteiligt sind. Zu Beginn erzeugen Sie Embryonen durch Kreuzung von fluoreszierenden GFP-Zebrafischen der Niere.

Bewahren Sie die Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung in E3-Lösung bei 28,5 Grad Celsius auf. Verwenden Sie dann 0,003 % PTU in E3, um das E3-Medium zu ersetzen. Lege die Embryonen für sechs oder mehr Tage in den Inkubator zurück, dann sind die Nieren gereift.

Um den Zebrafisch für die Live-Bildgebung zu kartieren, bereiten Sie 1 % bis 2 % niedrigschmelzende Agarose mit 0,2 Milligramm pro Milliliter Trigainlösung vor. Stellen Sie sicher, dass die Agarosetrigain-Lösung abgekühlt ist, bevor Sie eine Plastik- oder Glaspipette verwenden, um einen Embryo in die Lösung zu übertragen. Anschließend ziehen Sie die Larve mit einer Transferpipette in die Agarose und legen sie in der Mitte einer 35-Millimeter-Schale ab.

Die Agarose mit dem Zebrafisch schnell verteilen, so dass der Boden der Schüssel gleichmäßig bedeckt ist. Verwenden Sie dann eine Glassonde, um die Larve für die Photoablation und Bildgebung auszurichten, so dass das interessierende Nierensegment senkrecht zum Strahlengang steht, während das kontralaterale Segment vom Laserstrahl weg ist. Die Ausrichtung des Zebrafisches ist entscheidend für die weiteren Schritte der Laserablation.

Eine gute Technik ist ratsam, um sicherzustellen, dass die Larven eine senkrechte Position in der Agarose einnehmen. Decken Sie die Petrischale ab, um die Verdunstung zu minimieren, und lassen Sie die Agarose etwa 15 Minuten lang erstarren. Nachdem Sie das konfokale Mikroskop gemäß dem Textprotokoll in der aufrechten Konfiguration aufgestellt haben, positionieren Sie die Petrischale, die die Larve enthält, auf einem Objektträger und halten Sie sie mit Modelliermasse an Ort und Stelle.

Positionieren Sie anschließend die verschiebbare Petrischale auf dem Mikroskoptisch. Fügen Sie dann drei Milliliter Bildgebungslösung hinzu. Heben Sie den Tisch unter einer Wassertauchlinse langsam an und achten Sie darauf, dass die Linse leicht abgewinkelt ist, um zu verhindern, dass Luft im Strahlengang eingeschlossen wird.

Sobald die Linse die Lösung in einem Winkel berührt, zentrieren Sie sie so, dass sie sich im Sichtfeld des Embryos befindet. Suchen Sie nun mit der Leuchtstoffröhre das Segment von Interesse und fokussieren Sie sich dann auf den oberflächlichen Ast, um ihn zu verletzen. Die oberflächlichen Äste, die gewählt wurden, um die Lichtstreuung zu minimieren.

Navigieren Sie in der Mikroskopsoftware zu Ansicht, Erfassungssteuerung und C2plus Compact GUI. Stellen Sie die Verweilzeit der Pixel auf 1,9 Mikrosekunden, die Framegröße auf 512 x 512 Pixel und die Lochblende auf 90 Mikrometer ein. Stellen Sie die Laserintensität von 405 Nanometern auf Null und die Laserintensität von 488 auf einen niedrigen Wert ein.

Wenn Sie den 488-Nanometer-Laser verwenden, klicken Sie in der Softwareoberfläche auf Scannen. Finden Sie das Segment von Interesse, das senkrecht zum Strahlengang verläuft und das mit guter GFP-Fluoreszenz gut sichtbar ist. Nachdem dieser Bereich identifiziert wurde, navigieren Sie zu ROI, elliptischen ROI zeichnen, um einen Interessenbereich zu zeichnen.

Navigieren Sie als Nächstes zu Ansicht, Erfassungssteuerung, C2plus-Scanbereich und wählen Sie Bandscanbereich, die rechteckige Maske wird in dieser Benutzeroberfläche angezeigt. Definieren Sie mit dem Cursor manuell einen rechteckigen Scan, um das Segment abzudecken, das für die Laserablation vorgesehen ist. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Maskenbereich, um die Auswahl zu übernehmen.

Wenn Sie nur den 488-Nanometer-Laser zur Aktivierung von GFP verwenden, beginnen Sie die Zeitmessung, während Sie den grünen Kanal überwachen. Stellen Sie sicher, dass die Intensität des Lasers 488 relativ gering ist. Messen Sie die durchschnittliche Intensität des GFP in der Region of Interest, indem Sie Maß, Zeitmessung auswählen.

Verwenden Sie das Diagramm oder die Registerkarte "Daten", um die durchschnittlichen Intensitätsstufen innerhalb des ROI zu überwachen. Mit dem violetten Laser können Sie die Nierenzellen schädigen, indem Sie die Intensität auf 100 % erhöhen, indem Sie den Laserleistungsregler ganz nach rechts schieben. Beobachten Sie auf der Registerkarte "Diagramm" ein Liniendiagramm oder verwenden Sie die Registerkarte "Daten", um die numerischen Werte der GFP-Intensität zu beobachten, und warten Sie, bis sie auf ein gewünschtes Niveau fällt.

Beispiel: 50 % der Basislinie. Sobald die GFP-Intensität innerhalb des elliptischen ROI auf ein gewünschtes Niveau gesunken ist, verringern Sie die Intensität des violetten Lasers sofort auf Null im Bedienfeld der Software, indem Sie den Schieberegler für die Laserleistung ganz nach links bewegen. Erhalten Sie schließlich eine neue Basislinie der GFP-Fluoreszenz.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, verschwindet die GFP-Fluoreszenz nach der Exposition gegenüber 405-Nanometer-Laserlicht eine Zelle nach der anderen. Bis zur 220. Minute verliert das gesamte ablatierte Segment 100 % seiner GFP-Positivität. Dies ist auf den Zelltod und nicht auf die Herunterregulierung der GFP-Expression zurückzuführen, wie das Auftreten von rot fluoreszierenden Propidiumiodid-positiven Kernen in den Zellen zeigt, die die GFP-Positivität verlieren.

Diese Bilder zeigen, dass es durch Variation der anfänglichen Exposition möglich ist, die Verletzung und die Reaktion auf das verletzte Epithel zu bestimmen. Bei einem anfänglichen GFP-Photobleichen von 10 % bis 20 % wird fünf Stunden nach der Verletzung praktisch keine Verringerung der GFP-Positivität beobachtet. 50 % und 60 % führen zu einem vollständigen Verschwinden des GFP nach fünf Stunden, während 30 % und 40 % Bleiche zu Zwischenergebnissen führt, wobei 50 % geschätzter Tod bei etwa 35 % Photobleiche beobachtet werden.

Dies wird durch die Propidiumiodid-Färbung unterstützt, bei der eine 20%ige Photobleiche 100 Minuten nach der Ablation praktisch keine Propidiumiodid-Färbung ergibt. 50%iges Photobleaching führt jedoch nach 60 Minuten zu einer kontinuierlichen Propidiumiodid-Positivität im abgetragenen Epithel. Während 30% und 40% Photobleiche zu einer intermediären Propidiumiodid-Inkorporation führen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern und chemischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. den Blick auf den Laserstrahl zu vermeiden und Handschuhe beim Umgang mit Chemikalien zu tragen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Zeitraffermikroskopie, Immunfluoreszenzfärbung und andere durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, die auf die Analyse von Nierenschäden und -reparaturen auf zellulärer und molekularer Ebene abzielen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Nierenregeneration. Es sollte die Rolle der kollektiven Zellmigration und der Nierenreparatur nach Verletzungen im Zebrafisch untersucht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit konfokaler Mikroskopie bestimmte Nierensegmente in GPF-transgenen Zebrafischlarven und -embryonen verletzen können.