Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine gezielte Ablation von Zebrafisch-Nierenepithelzellen zu induzieren, um eine Nierenschädigung und anschließende Reparatur zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Organ- und insbesondere Nierenregeneration zu beantworten, beispielsweise welche zellulären Prozesse an der Regeneration beteiligt sind, inwieweit die Plastizität der verbliebenen Gewebe ausgeprägt ist, und viele weitere.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine präzise räumliche und zeitliche Kontrolle der Verletzung ermöglicht sowie die Anpassung des Verletzungsgrads erlaubt. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie oder Diagnose einer akuten Nierenschädigung, da sie eine präzise räumliche und zeitliche Beurteilung der zellulären und molekularen Prozesse ermöglicht, die an der Nierenzellschädigung und Regeneration beteiligt sind. Zunächst werden Embryonen erzeugt, indem fluoreszierende Nieren-GFP-Zebrafische gekreuzt werden.

Behandeln Sie die Embryonen für 24 Stunden nach der Befruchtung in E3-Lösung bei 28,5 °C. Anschließend ersetzen Sie das E3-Medium durch E3 mit 0,003 % PTU. Stellen Sie die Embryonen für sechs oder mehr Tage zurück in den Inkubator, wodurch die Nieren ausgereift sein werden.

Um den Zebrabärbling für die Live-Bildgebung vorzubereiten, stellen Sie eine 1 % bis 2 %ige Lösung aus Low-Melting-Agarose mit einer Trigainelösung von 0,2 Milligramm pro Milliliter her. Stellen Sie sicher, dass die Agarose-Trigainelösung vor der Verwendung abgekühlt ist, und übertragen Sie mithilfe einer Plastik- oder Glaspipette ein Embryo in die Lösung. Anschließend saugen Sie mit einer Transferpipette den Larvenkörper in der Agarose auf und geben ihn in die Mitte einer 35-Millimeter-Schale.

Verteilen Sie das Agarose enthaltende Zebrafisch-Exemplar schnell, um den Boden der Schale gleichmäßig zu bedecken. Orientieren Sie dann mit einer Glassonde die Larve für die Photoablation und Bildgebung, sodass das gewünschte Nierensegment senkrecht zum Strahlengang steht, während das kontralaterale Segment außerhalb des Laserstrahls liegt. Die Orientierung des Zebrafischs ist für die nachfolgenden Schritte der Laserablation entscheidend.

Eine gute Technik ist zu empfehlen, um sicherzustellen, dass die Larven eine senkrechte Position im Agarose beibehalten. Decken Sie die Petrischale ab, um Verdunstung zu minimieren, und lassen Sie das Agarose etwa 15 Minuten lang verfestigen. Nachdem das konfokale Mikroskop gemäß dem Textprotokoll in aufrechter Konfiguration eingerichtet wurde, platzieren Sie die Petrischale mit der Larve auf einem Objektträger und verwenden Sie Modellierknete, um sie zu fixieren.

Als Nächstes platzieren Sie die bewegliche Petrischale auf dem Mikroskoptisch. Fügen Sie dann drei Milliliter Imaging-Lösung hinzu. Unter einem Wassereintauchobjektiv heben Sie langsam den Tisch an und stellen sicher, dass das Objektiv leicht geneigt ist, um zu verhindern, dass Luft im Strahlengang eingeschlossen wird.

Sobald die Linse die Lösung in einem Winkel berührt, zentrieren Sie sie so, dass sie im Sichtfeld des Embryos liegt. Suchen Sie nun mithilfe der fluoreszierenden Lichtquelle das gewünschte Segment und fokussieren Sie anschließend auf den oberflächlichen Ast, um ihn für die Verletzung zu markieren. Die ausgewählten oberflächlichen Äste dienen der Minimierung der Lichtstreuung.

Öffnen Sie in der Mikroskop-Software die Ansicht „Akquisitionskontrolle“, C2plus kompaktes GUI. Stellen Sie die Pixeldwellzeit auf 1,9 Mikrosekunden, die Bildgröße auf 512 mal 512 Pixel und die Lochblendenöffnung auf 90 Mikrometer ein. Setzen Sie die Intensität des 405 Nanometer-Lasers auf Null und die Intensität des 488 Nanometer-Lasers auf einen niedrigen Wert.

Während der Verwendung des 488 Nanometer-Lasers klicken Sie in der Software-Oberfläche auf „Scan“. Suchen Sie den interessierenden Abschnitt, der senkrecht zum Strahlengang liegt und mit guter GFP-Fluoreszenz gut sichtbar ist. Sobald dieser Bereich identifiziert wurde, navigieren Sie zu ROI und zeichnen eine elliptische ROI, um einen Bereich von Interesse festzulegen.

Navigieren Sie anschließend zu Ansicht, Aufnahme-Steuerung, C2plus-Scan-Bereich und wählen Sie Band-Scan-Bereich; die rechteckige Maske wird in dieser Schnittstelle erscheinen. Definieren Sie mithilfe des Cursors manuell einen rechteckigen Scan-Bereich, der den für die Laserablation vorgesehenen Abschnitt abdeckt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste innerhalb des Maskenbereichs, um die Auswahl zu bestätigen.

Beginnen Sie die Zeitmessung unter Verwendung nur des 488-Nanometer-Lasers zur Aktivierung von GFP, während Sie den grünen Kanal überwachen. Stellen Sie sicher, dass die Intensität des 488-Nanometer-Lasers relativ niedrig ist. Messen Sie die durchschnittliche Intensität des GFP im interessierenden Bereich, indem Sie „Messen“ und „Zeitmessung“ auswählen.

Verwenden Sie das Diagramm- oder Datentab, um die durchschnittlichen Intensitätswerte innerhalb der ROI zu überwachen. Verursachen Sie mithilfe des violetten Lasers eine Schädigung der Nierenzellen, indem Sie die Intensität durch Verschieben der Laserleistungsregelung ganz nach rechts auf 100 % erhöhen. Beobachten Sie im Diagramm-Tab einen Liniendiagrammverlauf oder nutzen Sie das Datentab, um die numerischen Werte der GFP-Intensität zu verfolgen, und warten Sie, bis diese auf einen gewünschten Wert abgefallen ist.

Zum Beispiel 50 % des Ausgangswerts. Sobald die GFP-Intensität innerhalb des elliptischen ROI auf den gewünschten Wert abgefallen ist, verringern Sie sofort die Intensität des violetten Lasers in der Software-Steuerung, indem Sie den Laserleistungsregler ganz nach links bewegen, auf null. Schließlich erfassen Sie eine neue Grundlinie der GFP-Fluoreszenz.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, verschwindet nach der Exposition gegenüber Laserlicht mit einer Wellenlänge von 405 Nanometern die GFP-Fluoreszenz zellweise. Bis zu 220 Minuten verliert das gesamte ablatierte Segment 100 % seiner GFP-Positivität. Dies beruht auf Zelltod und nicht auf einer Herunterregulation der GFP-Expression, wie durch das Auftreten rote fluoreszierende, propidiumiodidpositive Kerne in den Zellen ersichtlich wird, die ihre GFP-Positivität verlieren.

Diese Bilder zeigen, dass durch die Variation der anfänglichen Belichtung die Verletzung und die Reaktion des verletzten Epithels eingestellt werden können. Bei einer anfänglichen GFP-Photobleiche von 10 % bis 20 % wird fünf Stunden nach der Verletzung praktisch keine Verringerung der GFP-Positivität beobachtet. 50 % und 60 % führen fünf Stunden später zum vollständigen Verschwinden von GFP, während eine Bleiche von 30 % und 40 % zu intermediären Ergebnissen führt, wobei ein geschätzter Zelltod von 50 % bei etwa 35 % Photobleiche beobachtet wird.

Dies wird durch die Propidiumiodid-Färbung gestützt, bei der eine 20 %ige Photobleiche praktisch keine Propidiumiodid-Färbung 100 Minuten nach der Ablation zeigt. Eine 50 %ige Photobleiche führt hingegen nach 60 Minuten zu einer kontinuierlichen Propidiumiodid-Positivität im ablatierten Epithel. Während eine 30 %ige und 40 %ige Photobleiche zu einer intermediären Propidiumiodid-Inkorporation führt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern und chemischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Vermeiden des Blicks in den Laserstrahl sowie das Tragen von Handschuhen beim Umgang mit Chemikalien sollten stets beachtet werden. Nach dieser Methode können weitere Verfahren wie Zeitraffermikroskopie, Immunfluoreszenz-Färbung und andere angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zur Aufklärung von Nierenschäden und -reparatur auf zellulärer und molekularer Ebene zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Nierenregeneration, um die Rolle der kollektiven Zellmigration und der Nierenreparatur nach einer Verletzung bei Zebrafischen zu untersuchen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Konfokalmikroskopie verwendet, um spezifische Nierensegmente in GFP-transgenen Zebrafischartigen Larven und Embryonen zu verletzen.