Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dynamik der Mikrotubuli in Hefezellen zu messen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrotubuli zu beantworten, z. B. wie Mutationen in Tubuli und Mikrotubuli-Regulatoren die Mikrotubuli-Dynamik in einer lebenden Zelle regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass lebende Hefezellen im Bild stabilisiert werden.

Vielmehr eine hohe Zeitauflösung für zehn Minuten oder eine niedrige Zeitauflösung für mehrere Stunden. Colby Fees und Cassi Estrem, zwei Doktoranden aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen. Die in diesem Experiment verwendeten Hefezellen wurden so konstruiert, dass sie GFP-markiertes Tubulin konstitutiv exprimieren.

Beimpfen Sie etwa einen Mikroliter der Hefezellen aus einer einzigen Kolonie auf einer Platte in drei Millilitern synthetischem Komplettmedium. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius wachsen, wobei Sie bei 250 U/min schütteln. Am folgenden Tag verdünnen Sie die gesättigte Kultur auf einen OD600 von weniger als 0,1 im Medium.

Stellen Sie die verdünnte Kultur für drei bis vier Stunden in den 30-Grad-Celsius-Schüttler oder bis der OD600-Wert zwischen 0,4 und 0,8 liegt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Objektträger in der Durchflusskammer, indem Sie ein Blatt Paraffinfolie in ein Stück mit einer Breite von vier Zoll und einer Länge von sieben Zoll schneiden. Legen Sie einen Standard-Objektträger der Länge nach auf die vier Zoll breite Paraffinfolie und wickeln Sie den Film drei- bis viermal um den Objektträger, so dass der Objektträger mit einer Schicht bedeckt ist, die drei bis vier Schichten dick ist.

Drücken Sie die Schichten zusammen, um eine vernünftige Abdichtung zu gewährleisten, aber vermeiden Sie es, zu stark zu drücken oder die Folie zu zerknittern. Schneide den Paraffinfilm mit einem sauberen Teppichmesser, einem Rasiermesser und einem weiteren Objektträger, um eine gerade Kante zum Schneiden zu schaffen, entlang der Außenkanten des Objektträgers ab. Ziehen Sie die überschüssige Folie von der Arbeitsfolie ab und entsorgen Sie sie.

Schneiden Sie die gestapelten Filmschichten entlang der Längsachse des Objektträgers mit dem zweiten Dia als gerade Kante in etwa 10 Streifen mit einer Breite von jeweils zwei bis vier Millimetern. Schneiden Sie anschließend die gestapelten Paraffinfolienschichten senkrecht zu den vorherigen Schnitten entlang der kurzen Achse des Objektträgers, um Streifen zu erhalten, die zwei bis vier Millimeter breit, 23 bis 24 Millimeter lang und drei bis vier Schichten dick sind. Verwenden Sie ein Rasiermesser in einem 45-Grad-Winkel, um die geschnittenen Filmstreifen zu schälen.

Verteilen Sie dann die geschnittenen Streifen mit einer Pinzette gleichmäßig auf einem sauberen Objektträger, um die gewünschte Anzahl von Kammern zu erzeugen. In diesem Beispiel werden vier Filmstreifen verwendet, um drei Kammern zu erstellen. Legen Sie einen einzelnen Deckzettel auf die Folienstreifen und bringen Sie ihn mit einer Pinzette in Position.

Legen Sie das vorbereitete Dias mit dem Deckblatt nach oben auf eine heiße Platte, die auf etwa 95 Grad Celsius eingestellt ist, und erhitzen Sie das Dia etwa drei Minuten lang, bis die Filmstreifen lichtdurchlässig sind. Versiegeln Sie den Objektträger und den Deckglas, indem Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf die Bereiche des Deckglases drücken, die sich direkt über den Paraffinfolienstreifen befinden. Nehmen Sie den Objektträger mit einer Pinzette von der Kochplatte und legen Sie ihn zum Abkühlen mit der Deckglasseite nach oben beiseite.

Wenn das Dia abkühlt, kehrt der Film zu einer weißen, undurchsichtigen Färbung zurück. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Sie ein gefrorenes Aliquot von 200 Mikrolitern Concanavalin A bei Raumtemperatur auf. Geben Sie etwa 100 Mikroliter aufgetautes Concanavalin A in jede Kammer des vorbereiteten Objektträgers, indem Sie es in eines der offenen Enden pipettieren.

Hängen Sie dann den Objektträger mit dem Deckglas nach unten fünf Minuten lang zwischen zwei Mikrofugen-Röhrchengestellen, damit das Concanavalin A auf dem Deckglas haften kann. Bringen Sie den Objektträger wieder in eine Deckel-Aufsteckposition und entfernen Sie das Concanavalin A, indem Sie die Kammer mit synthetischem Komplettmedium waschen. Fließen Sie das Doppelte des Kammervolumens des Mediums durch die Kammer, indem Sie mit der Ecke eines Papiertuchs Flüssigkeit aus einem Ende der Kammer ziehen, während gleichzeitig frische Flüssigkeit in das andere Ende der Kammer pipettiert wird.

Wägen Sie die Zellen durch Fließen des Doppelten des Kammervolumens der Zellsuspension unter Verwendung der gerichteten Strömungsmethode. Hängen Sie den Objektträger mit dem Deckglas nach unten 10 Minuten lang auf, damit die Zellen am Deckglas haften können. Nicht anhaftende Zellen werden ausgespült, indem das Vierfache des Kammervolumens des synthetischen Komplettmediums durchströmt wird.

Trocknen Sie jedes Ende der Kammer vorsichtig mit einer sauberen Ecke eines Papiertuchs ab und bringen Sie den Meniskus an den Rand des Deckglases. Versiegeln Sie jedes Ende der Kammer mit warmem Dichtmittel. Die Bildaufnahme wird mit einem inversen Mikroskop durchgeführt, das mit einem 1,45 NA 100X CFI Plan Apo-Objektiv, einem piezoelektrischen Tisch, einer konfokalen Abtasteinheit mit rotierender Scheibe, einem Beleuchtungslaser und einer EMCCD-Kamera ausgestattet ist.

Halten Sie die Temperatur des Tisches während der Bildaufnahme auf Raumtemperatur. Bringen Sie die Zellen in den Fokus und durchsuchen Sie den Objektträger nach gruppierten Zellen, um sicherzustellen, dass das Erfassungsfeld mindestens fünf bis sechs Zellen enthält, die auf derselben Fokusebene gruppiert sind. Programmieren Sie eine mehrdimensionale Erfassung, um mehrere zSeries im Zeitverlauf zu erfassen.

Passen Sie die Einstellungen in den aktiven Erfassungseinstellungen wie folgt an:Gesamttiefe Z von sechs Mikrometern, um die gesamte Hefezelle zu umfassen, Z-Schrittweite von 300 Nanometern zur Maximierung der Lichterfassung ohne Überabtastung, Gesamtzeitdauer von 10 Minuten, Zeitintervalle von vier Sekunden zwischen zSeries und Belichtungszeit von 90 Millisekunden für jede Z-Ebene. Beginnen Sie die Erfassung, indem Sie auf Ausführen klicken, und lassen Sie sie für die gesamten 10 Minuten ausführen. Die Daten werden als Bildserie gespeichert, und hier wird ein Beispielergebnis der Zeitrafferaufnahme gezeigt.

Starten Sie die Bildanalyse, indem Sie ImageJ öffnen und den erfassten Bildstapel direkt auf das Bedienfeld ziehen. Die importierten Bio-Formate werden automatisch gestartet. Wählen Sie "Okay" aus, um den Bildstapel als Hyperstack zu laden.

Mit der ZProject-Funktion reduzieren Sie jede z-Serie auf eine maximale Intensität der zweidimensionalen Projektion. Wenden Sie einen mittleren Filter auf den Bildstapel an, um das Fleckenrauschen zu reduzieren, indem Sie das Prozessmenü, das Filter-Untermenü und die Median-Funktion auswählen. Geben Sie 2,0 Pixel in das Radiusfeld ein und klicken Sie auf "Okay" Zellen vor NFA im Feld identifizieren.

Diese zeichnen sich durch mittelgroße Knospen und eine kurze mitotische Spindel von etwa einem bis einem Punkt von fünf Mikrometern Länge aus. Beginnen Sie mit dem ersten Zeitpunkt der Bildserie und ziehen Sie mit dem Werkzeug für segmentierte Linien eine Linie entlang eines einzelnen astralen Mikrotubuli von dem an der Verbindungsstelle zwischen dem astralen Mikrotubuli und den intensiver markierten Spindel-Mikrotubuli bis zum Plus-Ende, das sich im Zytoplasma befindet. Doppelklicken Sie auf das Ende des Mikrotubuli, um die segmentierte Linie zu vervollständigen.

Notieren Sie die Messung in der Ergebnistabelle mit der Messfunktion, indem Sie die M-Taste auf der Tastatur drücken. Nachdem Sie Messungen für alle Zeitpunkte durchgeführt haben, kopieren Sie die Daten aus der Ergebnistabelle, fügen Sie sie in eine Tabelle ein, und wählen Sie "Speichern unter" aus, um die Daten auszuwählen. Diese Grafik zeigt eine Zeitreihe der astralen Mikrotubuli-Dynamik in einer Wildtyp-Zelle und einem mutierten Stamm, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er stabilere Mikrotubuli aufweist.

Mikrotubuli werden mit dem GFP-markierten Alpha-Tubulin markiert, um die Länge der Mikrotubuli zu visualisieren. Die roten Pfeile zeichnen die Gesamtlänge eines astralen Mikrotubuli nach, wobei die Pfeilspitzen die Plusenden bezeichnen. Die Mikrotubuli-Längen wurden zu jedem Zeitpunkt acht Minuten lang gemessen, und diese zusammengestellten Längen werden in Lebensdiagrammen dargestellt.

Die grünen Punkte stehen für die Polymerisation und die rosa Punkte für die Depolymerisation. Katastrophenereignisse werden durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Diese Diagramme zeigen, dass der Mikrotubuli in der Mutante länger ist und weniger Katastrophen aufweist als der Wildtyp-Mikrotubuli.

Darüber hinaus sind die Polymerisations- und Depolymerisationsraten, die aus den Steigungen der auf- und absteigenden Mikrotubulilängen bestimmt werden, in der Mutante im Vergleich zum Wildtyp verringert. Messungen der Mikrotubuli-Dynamik zeigen auch, dass der Mikrotubuli in der mutierten Zelle im Vergleich zum Wildtyp eine geringere Dynamik aufweist. Nach der Beherrschung können die Objektträgervorbereitung, das Beladen der Zellen und die Bildaufnahme in 30 Minuten durchgeführt werden, was bedeutet, dass viele verschiedene Proben an einem einzigen Tag abgebildet werden können.

Die Objektträgerkammern können im Voraus hergestellt und gelagert werden, bevor Concanavalin A hinzugefügt wird. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hefezellen in einfachen Objektträgerkammern stabilisiert, in vier Dimensionen abbildet und die Mikrotubuli-Dynamik in lebenden Zellen misst. Zusätzlich zu Mikrotubuli kann dieses Verfahren modifiziert werden, um die Dynamik anderer fluoreszenzmarkierter Proteine in lebenden Hefezellen über Zeitskalen von Sekunden bis Stunden zu messen.