Name: Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Lernen Sie die Co-Sedimentationsmethode zur Messung der Proteinbindung an F-Aktin. Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Bindungsaffinität in Zellbiologie und Biochemie.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der Actin-Co-Sedimentationstest ist eine einfache Technik, die schnell bestimmen kann, ob ein Protein F-Actin bindet. Mit einigen Modifikationen kann die Technik auch verwendet werden, um die Affinität der Wechselwirkung zu messen. Zusätzlich zu den im oben genannten Protokoll aufgeführten Punkten sollten bei der Gestaltung, Durchführung und Interpretation des Assays die folgenden Punkte berücksichtigt werden. Protein von Interesse Frisch zubereitetes oder gefrorenes Protein kann im Assay verwendet werden. Wenn gefrorenes Protein verwendet wird, wird dringend empfohlen, dass die Ergebnisse mit frischem (nie gefrorenem) Protein verglichen werden, um sicherzustellen, dass das Einfrieren die F-Aktinbindung nicht beeinflusst. G-Aktin Quelle Viele Pelletierexperimente verwenden G-Actin, das aus dem Muskel isoliert ist, wegen seiner relativen Häufigkeit. Es gibt drei Haupt-Actin-Isotypen bei Säugetieren - Alpha, Beta und Gamma - das sind bemerkenswert ähnlich (&gt; 90% Sequenz identiTy) Dennoch gibt es funktionale Unterschiede zwischen den Isotypen 12 , 13 . Wenn möglich, sollte der in dem Bindungsassay verwendete G-Aktin-Isotyp mit dem in vivo- Isotyp übereinstimmen. Zum Beispiel, wenn ein Protein im Skelettmuskel exprimiert wird, ist Alpha-Aktin die beste Wahl; Bei der Untersuchung eines in Fibroblasten exprimierten Proteins wird Beta-Actin empfohlen. Phalloidin Gebrauch Da Phalloidin F-Actin bindet, kann es die Bindung einiger F-Aktin-bindender Proteine ​​stören oder sogar blockieren ( z. B. Phalloidin-Blöcke cofilin aus Bindung an Aktin-Filamente) 14 . So sollte Phalloidin mit Vorsicht verwendet werden und die Ergebnisse im Vergleich zu Nicht-Phalloidin-behandelten Proben, wenn möglich. Hoher hintergrund Es ist nicht ungewöhnlich, daß Proteine ​​in Abwesenheit von F-Aktin sedimentieren ( Fig. 1A , keine F-Aktin-PelletprobeS). Allerdings können hohe Niveaus der Hintergrund-Sedimentation die echte Aktin-Co-Sedimentation maskieren und es schwierig machen, wenn nicht gar unmöglich zu bestimmen, ob ein Protein F-Actin bindet oder die Affinität der Wechselwirkung mißt. Das Hinzufügen von Polidicanol zum Reaktionspuffer (Schritt 4.1) kann den Hintergrund erheblich reduzieren und ist eine einfache Lösung. Wenn das nicht den Hintergrund verringert, kann die Einstellung des Reaktionspuffers, der Salzkonzentration und / oder der Inkubationstemperatur helfen. Bindekurve Um eine Bindungskurve zu erzeugen, ist es notwendig, die Konzentration von entweder dem interessierenden Protein oder dem F-Aktin über eine Reihe von Reaktionen zu variieren. In der Praxis ist es einfacher und bevorzugt, F-Aktin in einer festen Konzentration aufrechtzuerhalten und die Konzentration des interessierenden Proteins zu variieren. Die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration ( z. B. 2 &amp; mgr; M) im Pelletier-Assay begrenzt das unspezifische Fallen bei höheren Konzentrationen von F-Aktin und verhindertDepolymerisation bei niedrigeren (&lt;0,5 μM) Konzentrationen von F-Aktin. Die Depolymerisation kann mit Phalloidin verhindert werden, obwohl dies einen potentiellen komplizierenden Faktor in das System einführt (siehe Schritt 3.3 und darüber). Die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration erlaubt es auch, das F-Aktin-Pellet über Proben zu vergleichen (und zu normalisieren) und um fehlgeschlagene Experimente zu identifizieren ( dh wo das F-Aktin-Pellet sehr variabel ist und eine Analyse über Konzentrationen hinweg verhindert). Schließlich ermöglicht die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration, dass man bestimmt, ob die Bindung an den Aktin-Filament kooperativ ist ( 1C ). Gesättigte Bindung Wie bei allen Bindungsexperimenten ist es entscheidend, dass die Bindung an F-Actin gesättigt ist und dass die Konzentration von Protein plus F-Aktin-Plateaus (Abbildung 1C ). Ohne Plateau ist es nicht möglich, eine genaue Dissoziationsgleichgewichtskonstante zu berechnen. Also, esIst wichtig, die zu testende Verdünnungsreihe sorgfältig zu planen und immer höhere Protein-Konzentrationen ( dh mindestens 5- bis 10-fach höher als die erwarteten K d ) zu enthalten. Bindungsanalyse Damit die gemessenen Dissoziationskonstanten schlüssig sind, sollte der Assay unter Verwendung einer F-Aktin-Konzentration durchgeführt werden, die es ermöglicht, dass die Konzentration von Bindungsstellen auf F-Aktin für das interessierende Protein viel niedriger als die Affinität ist. Um zu prüfen, ob dieses Kriterium erfüllt ist, schätzen Sie die Konzentration der Bindungsstellen von B max . Zum Beispiel, wenn [F-Aktin] 2 μM und B max = 0,5 war, dann [Bindungsstellen] ≈ 1 μM. Das K d sollte mindestens 5- bis 10-fach größer sein als [Bindungsstellen]. Ist das gemessene K d in der gleichen Größenordnung wie [Bindungsstellen], so ist es möglich, dass die beobachtete Bindungskurve eine Titration der hochaffinen Bindungsstelle darstelltEher als eine echte Bindungsisotherme. Wenn dies beobachtet wird, wiederholen Sie den Assay mit einer 10-fach niedrigeren F-Aktin-Konzentration, um eine genaue Affinität zu messen. Für hochaffine Wechselwirkungen kann eine Phalloidin-Stabilisierung (Schritt 3.3) notwendig sein, um eine F-Aktin-Konzentration zu erreichen, die niedrig genug ist, um die Affinität genau zu messen. Schließlich gibt es grundsätzliche Einschränkungen mit dem Co-Sedimentationstest, den die Forscher bei der Durchführung und Bewertung des Assays bewusst sein sollten. Am wichtigsten ist, dass der Co-Sedimentationstest keine echte Gleichgewichtskonstante ergibt. Die Produkte der Bindung ( dh Protein plus F-Aktin) werden bei der Zentrifugation von den Reaktanten abgetrennt, woraufhin die Produkte dann dissoziieren können, um ein neues Gleichgewicht zu erzeugen. Infolgedessen kann der Co-Sedimentations-Assay die Wechselwirkung mit geringer Affinität fiskussieren oder nicht erkennen. Da viele aktinbindende Proteine ​​eine niedrige ( dh mikromolare) Affinität für F-Aktin aufweisen , ist ein negatives Ergebnis ( <eM&gt; dh keine nachweisbare Bindung) im Assay bedeutet nicht zwangsläufig, dass ein Protein nicht F-Actin bindet. Als Alternative sind TIRF-Mikroskopie-basierte Einzelfilament-Bindungsassays empfindlicher und genauer für die Bestimmung einer Dissoziationskonstante (für Rezensionen zu dieser Technik siehe Literatur 15,16 ). Trotz dieser Einschränkungen liegt der Pelletierassay innerhalb der Mittel der meisten Forscher und ist ein wirksames Instrument, um festzustellen, ob ein Protein F-Aktin bindet und die Affinität der Wechselwirkung misst.

Actin ist ein essentielles zytoskeletales Protein, das in zahlreichen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt, einschließlich Motilität, Kontraktion, Adhäsion und Morphologie 1 . Actin besteht in zwei Formen: monomeres globuläres Actin (G-Actin) und polymerisiertes filamentöses Actin (F-Aktin). Innerhalb der Zellen wird die F-Aktin-Organisation durch eine große Sammlung von Proteinen kontrolliert, die die Keimbildung, das Wachstum, die Vernetzung und die Demontage der Aktinfilamente 2 , 3 , 4 regulieren. Doch wie viele aktinbindende Proteine ​​im Zusammenspiel zur Regulierung der Aktin-Netzwerkorganisation funktionieren, ist noch weitgehend unklar. Die Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist ein wichtiger Ansatz für das Verständnis, wie Proteine ​​ihre Auswirkungen auf das zelluläre Verhalten auf biochemischer Ebene ausüben. Viele verschiedene Assays können verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen gereinigten Proteinen zu detektieren.Häufige Ansätze für lösliche Proteine ​​umfassen Pull-Downs, Fluoreszenzpolarisation, isotherme Titrationskalorimetrie und Oberflächenplasmonenresonanz. Wichtig ist, dass alle diese Assays Proteine ​​benötigen, um löslich zu sein, und sind daher schwierig für die Verwendung mit einem polymeren, filamentösen Protein wie F-Actin anzupassen. Hier beschreiben wir eine Technik - die Aktin-Co-Sedimentation oder Pelletierung, Assay - um festzustellen, ob eine Protein- oder Proteindomäne F-Actin bindet und die Affinität der Wechselwirkung mißt. Der Aktin-Pelletier-Assay ist eine relativ einfache Technik, die keine spezialisierte Ausrüstung erfordert, abgesehen von einer Ultrazentrifuge. Alle Reagenzien können hergestellt werden, die Kenntnis der Grundbiochemie annehmen oder erworben werden. Sobald die Bindung an F-Actin etabliert ist, kann der Assay verwendet werden, um die scheinbare Affinität ( dh die Dissoziationsgleichgewichtskonstante) zu messen. Auch wenn einmal eine Affinität festgestellt ist, wird der PelletierungsassayIst ein nützliches Werkzeug, um zu messen, wie sich Veränderungen des interessierenden Proteins ( dh posttranslationale Modifikationen, Mutationen oder Ligandenbindung) auf die Wechselwirkung mit F-Aktin 6 auswirken. Die Technik hat Einschränkungen (siehe die Diskussion ), die der Forscher sich bewusst sein sollte, bevor er den Test versuchte.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Mikro-Ultrazentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 Rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen - 0,2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Aktin, Kaninchenskelett</td><td>Zytoskelett</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosintriphosphat (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(&beta;-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Bildgebungssystem</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blauer R-250 Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidblaues Färbeset</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der proteinbindung an f-aktin durch co-sedimentation

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Die filamentöse Aktin (F-Aktin) -Organisation innerhalb der Zellen wird durch eine große Anzahl von aktinbindenden Proteinen reguliert, die die Aktin-Keimbildung, das Wachstum, die Vernetzung und / oder die Demontage kontrollieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik - die Aktin-Co-Sedimentation oder Pelletierung, Assay - um zu bestimmen, ob eine Protein- oder Proteindomäne F-Actin bindet und die Affinität der Wechselwirkung ( dh die Dissoziationsgleichgewichtskonstante) misst. Bei dieser Technik wird zunächst ein Protein von Interesse mit F-Actin in Lösung inkubiert. Dann wird eine Differentialzentrifugation verwendet, um die Aktinfilamente zu sedimentieren, und das pelletierte Material wird durch SDS-PAGE analysiert. Wenn das interessierende Protein F-Aktin bindet, wird es mit den Aktinfilamenten co-sedimentieren. Die Produkte der Bindungsreaktion ( dh F-Aktin und des Proteins von Interesse) können quantifiziert werden, um die Affinität der Wechselwirkung zu bestimmen. Der Aktin-Pelletierassay ist eine einfache Technik zur BestimmungWenn ein Protein von Interesse F-Aktin bindet und für die Beurteilung, wie Veränderungen an diesem Protein, wie Ligandenbindung, seine Wechselwirkung mit F-Actin beeinflussen.

Wir untersuchten die αE-Catenin-Homodimer-Bindung an F-Actin im Co-Sedimentationstest. Da vergangene Experimente gezeigt haben, dass die Affinität des αE-Catenin-Homodimers für F-Aktin etwa 1 μM und der B max bei 1 11 liegt , haben wir den Assay mit einer geringen Konzentration an F-Aktin (0,2 μM anstatt 2 μM) durchgeführt die Diskussion). Da 0,2 μM unterhalb der kritischen Konzentration liegt, wurde Phalloidin zugegeben, um das aus dem Kaninchen-Skelettmuskel G-Actin polymerisierte F-Aktin zu stabilisieren (Schritt 3.3). Zunehmende Konzentrationen von &amp; agr; E-Catenin-Homodimeren (0,125 &amp; ndash; 12,0 &amp; mgr; M) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,2 &amp; mgr; M F-Aktin inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die resultierenden Pellets wurden analysiert ( Fig. 1A ). Wie erwartet, wurde der αE-Catenin-Homodimer mit F-Aktin über dem Hintergrund co-sedimentiert (Abbildung 1A , Vergleich der F-Aktin-Pelletproben mit dem No-F-acZinnpelletproben). BSA wurde als Negativkontrolle ausgeführt ( Abbildung 1B ). Das gebundene Protein wurde quantifiziert und über freies Protein aufgetragen, um die Affinität der Wechselwirkung zu berechnen (Abbildung 1C ). Die geplante Daten passen am besten zu einer Hill-Gleichung. Das berechnete K d betrug 2,9 &amp; mgr; M, das B max betrug 0,2 und der Hill-Koeffizient (h) betrug 4,8. Somit bindet das αE-Catenin-Homodimer F-Actin kooperativ mit einer geringen mikromolaren Affinität, konsistent mit früheren Arbeiten (ein Kd von 2,9 &amp; mgr; M gegenüber &amp; ndash; 1,0 &amp; mgr; M) 11 . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Abbildung 1: Hochgeschwindigkeits-F-Aktin-Co-Sedimentationstest ( A ) Zunehmende Konzentrationen (0,125-12,0 μM) des αE-Catenin-Homodimers wurden mit (linken Tafeln) oder ohne (rechte Tafeln) mit 0,2 &amp; mgr; M F-Aktin, stabilisiert mit Phalloidi, inkubiertN. Sie wurden für 30 min bei RT inkubiert und zentrifugiert. Die Gesamtmenge (7,5% des Ausgangsmaterials) und das pelletierte Material (50% des pelletierten Materials) wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Farbstoff gefärbt. ( B ) 4 &amp; mgr; M BSA wurde als Negativkontrolle durchgeführt. Gesamt- und Pelletproben mit (+) oder ohne (-) F-Aktin wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Farbstoff gefärbt. ( C ) Das gebundene αE-Catenin (μM / μM Actin) aus A wurde gegen freies αE-Catenin (μM) aufgetragen und die Daten passen zu einer Hill-Gleichung (rote Linie). Der K d , B max und der Hill-Koeffizient (h) sind aufgeführt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Abbildung 2: Aktin-Pelletierung Quantifizierung </sTrong&gt; - Flussdiagramm In diesem Schema werden die wichtigsten Schritte in Abschnitt 5 mit Beispielen für Total- und Pelletproben ( A , CE ) und der zur Quantifizierung verwendeten Standardkurve ( B ) erläutert. 5.13 Schritte: 1 ) Messen Sie die Menge des Proteins von Interesse in den Gesamtproben (A). 2 ) Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Bandintensität gegenüber der Proteinmasse (B) aufzeichnen. 3 ) Messen Sie die Menge an Interesse von Interesse, die mit F-Aktin ( C ) co-sedimentiert wurde . 4 ) Messen Sie die Menge an Interesse von Interesse, die in Abwesenheit von F-Aktin ( D ) pelletiert. 5 ) Subtrahieren Sie D von C, um die Menge an Protein zu bestimmen, die an F-Actin gebunden ist. 6 ) Messen Sie die Menge an F-Aktin in jedem Pellet (E), berechnen Sie die durchschnittliche Menge an F-Aktin pro Probe und teilen Sie jede Probe mit dem Durchschnitt (die Zahlen unten zeigen das Verhältnis). 7 )Für jede Probe teilen Sie die Menge an gebundenem Protein (berechnet in Schritt 5) durch das F-Aktin-Pellet-Verhältnis (berechnet in Schritt 6), um die Unterschiede im Pellet einzustellen. 8 ) Verwenden Sie die Standardkurve ( B ), um die Menge (Masse) des normalisierten gebundenen Proteins in jeder Probe zu berechnen (Schritt 7). 9 ) Bestimmen Sie die Konzentration von freiem Protein und gebundenem Protein, um eine Bindungskurve zu erzeugen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit filamentösem Actin (F-Aktin) zu coedimieren und, falls die Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen.

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Fähigkeit eines Proteins zu prüfen, gemeinsam mit filamentösem Aktin zu sedimentieren, und falls eine Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen. Diese Methode ist eine einfache Technik, um festzustellen, ob ein Protein an F-Aktin bindet. Die Vorteile dieser Technik liegen darin, dass keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist, abgesehen von einem Ultrazentrifugens, und alle Reagenzien hergestellt oder bezogen werden können.Bereiten Sie zunächst das Protein hoher Reinheit gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Bestimmen Sie die Protein-Konzentration durch Messung der Extinktion bei 280 Nanometern. Zentrifugieren Sie das Protein kurz vor der Verwendung stark, um Aggregate aus unlöslichem Protein zu entfernen.Falls die Löslichkeit problematisch ist, messen Sie die Protein-Konzentration nach der Zentrifugation erneut. Entnehmen Sie als Nächstes eine Aliquot aus globulärem Aktin oder G-Aktin aus dem minus 80 Grad Celsius tiefen Gefrierschrank und tauen Sie es schnell auf. Geben Sie 10X-Polymerisationspuffer zu dem G-Aktin hinzu und verdünnen Sie mit Wasser auf eine Endkonzentration von 1X an. Die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um die Polymerisation des Aktins zu ermöglichen. Nach der Polymerisation das polymerisierte fadenförmige Aktin, oder F-Aktin, in Lösung bei vier Grad Celsius lagern, wo es mehrere Wochen stabil bleibt. Vor der Verwendung des F-Aktins nach der Lagerung das Gefäß mehrmals vorsichtig umstülpen oder anstoßen, um sicherzustellen, dass sich das gesamte Aktin aufgelöst hat und gleichmäßig in der Lösung verteilt ist.Stellen Sie die Bindung des Proteins der Untersuchung an F-Aktin wie im Textprotokoll beschrieben her. Sobald die F-Aktin-Bindung bestätigt ist, verdünnen Sie das Protein seriell, um eine Konzentrationsreihe mit sieben bis acht Proben herzustellen, die jeweils die doppelte endgültige zu testende Konzentration aufweisen. Bereiten Sie beispielsweise bei einem zu testenden Bereich von 0,1 bis acht Mikromolar Verdünnungen von 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0,2 Mikromolar Protein in 1X Reaktionspuffer in Mikrozentrifugenröhrchen vor.Verdünnen Sie das Protein der Wahl auf die Endkonzentration in 1X Reaktionspuffer in Ultrazentrifugenröhrchen. Geben Sie F-Aktin zu den entsprechenden Proben hinzu. Anschließend inkubieren Sie alle Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur.Nach 30 Minuten ein Fünftel jeder Probe entnehmen und mit Probenpuffer mischen. Dies sind die Gesamtproben. Die Ultrazentrifugen-Probenröhrchen in den Rotor laden und 20 Minuten bei 100.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren.Nach der Zentrifugation drei Viertel des Überstandes von jedem Röhrchen entfernen und in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen mit 4X-Probelösung mischen. Dies sind die Überstandsproben. Den verbleibenden Überstand mit einer Gel-Ladepipettenspitze entfernen, wobei darauf zu achten ist, den Pellet nicht aufzuwirbeln.Dann 1X Probenpuffer zu allen Röhrchen hinzufügen und mindestens fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Probe acht bis zehn Mal mit einer p200-Pipettenspitze auf- und abpipettieren, wobei der Pelletbereich des Röhrchens kontinuierlich gespült wird. Die Pipettenspitze während der Trituration vorsichtig über den Pellet streichen, um die Re-Suspension zu unterstützen.Überführen Sie das re-suspendierte Protein in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Dies sind die Pellet-Proben. Analysieren Sie abschließend die Gesamt- und Pellet-Proben mittels SDS-Page.Bilden Sie die mit Coomassie gefärbten Gele mithilfe eines Abbildungssystems ab, das die Intensitäten der Proteinbanden über einen breiten und linearen Bereich misst. Ansteigende Konzentrationen des Alpha-E-Catenin-Homodimers wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,2 Mikromolar F-Aktin inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die resultierenden Pellets analysiert.Wie erwartet sedimentierte das Alpha-E-Catenin-Homodimer zusammen mit F-Aktin über dem Hintergrundniveau. BSA wurde als negativer Kontrollversuch durchgeführt. Das gebundene Protein wurde quantifiziert und im Verhältnis zum freien Protein aufgetragen, um die Affinität der Wechselwirkung zu berechnen.Diese Technik kann in vier Stunden oder weniger durchgeführt werden, wenn F-Aktin bereits polymerisiert ist. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es entscheidend, dass der Überstand unmittelbar nach der Zentrifugation entfernt und das Pellet vollständig wieder aufgenommen wird. Wie bei allen Bindungsversuchen ist es wichtig, dass die Bindung an F-Aktin gesättigt ist und die Reinheit sowie die F-Aktin-Plattform einen Plateau erreichen; ohne einen solchen Plateau ist es nicht möglich, eine genaue Assoziationsgleichgewichtskonstante zu berechnen.Es gibt grundlegende Einschränkungen des Co-Sedimentationsassays, auf die Forscher hingewiesen werden sollten. Vor allem liefert er keine echte Gleichgewichtskonstante und kann daher Wechselwirkungen mit geringer Affinität falsch berechnen oder nicht nachweisen. Trotz dieser Einschränkungen ist der Co-Sedimentationsassay ein leicht zugängliches und wirksames Werkzeug, um festzustellen, ob ein Protein an F-Aktin bindet, und um die Affinität dieser Wechselwirkung zu messen.

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Biochemistry

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Proteine ​​binden an filamentösen Aktin (F-Aktin) durch verschiedene Aktin-bindende Module. In diesem Video zeigen wir das Verfahren von Aktin co-Sedimentation, die eine in vitro-Assay routinemäßig verwendet, um Proteine ​​oder bestimmte Domänen, die F-Aktin binden zu analysieren.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

Wir wenden label-free-Protein-Interaktion Analyse mittels Biacore X100 für Struktur-Funktions-Analyse der Bindung von mehreren Cystatin B-Mutanten durch kinetische Charakterisierung Papain. Calibration-free-Konzentration Analyse (EUFA) misst die Konzentration des Proteins mit behielt bindende Aktivität, ohne die Notwendigkeit für eine Standard-Kurve. Wir zeigen, dass die Bestätigung der Konzentrationen mit EUFA erhöht die Zuverlässigkeit der kinetischen Analyse und die kinetischen Konstanten...

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In diesem Video beschreiben wir die Fluoreszenz-Anisotropie-Technik, um die Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor-markierten Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS)-Protein und der Elongationsfaktor-ähnlichen 1 GTPase (EFL1) zu untersuchen. Bei der Inkubation von SBDS-Proteinen mit allmählich steigenden Konzentrationen von EFL1 wird ein stetiger Anstieg der Anisotropie beobachtet, was auf eine erfolgreiche Interaktion zwischen den beiden Proteinen hinweist.

Fluoreszenzanisotropie-basierter Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Polymerisation von FtsZ ist für bakterielle Zellteilung. In diesem Bericht haben wir ausführlich einfache Protokolle zu FtsZ Polymerisation Aktivitäten zu überwachen und zu diskutieren den Einfluss der Pufferzusammensetzung. Die Protokolle können verwendet werden, um die Wechselwirkung von FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder antibakterielle Medikamente, die Polymerisation beeinträchtigen FtsZ untersuchen.

FtsZ Polymerisation Assays: Einfache Protokolle und Überlegungen

Dieses Protokoll vergleicht die relativen Affinitäten von Bindungspartnern für GTPasen der Rho-Familie, einschließlich Rac1. In vivo konkurrieren Rac1-bindende Proteine um eine einzige Bindungsgrenzfläche, deren Konformation durch ein gebundenes Nukleotid bestimmt wird. Das Nukleotid ist aufgrund der hohen Hydrolyserate sowohl wichtig als auch experimentell schwer zu kontrollieren.

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Protein-Wechselwirkungen sind im Herzen von einer Funktion der Zelle. Kalorimetrische und spektroskopischen Techniken werden allgemein zu charakterisieren sie verwendet. Hier beschreiben wir Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug, um die Wechselwirkung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und dem Elongationsfaktor-like 1 GTPase (EFL1) mutiert zu studieren.

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Wir präsentieren eine Methode, die Membranproteinreinigung und Rekonstitution zu Peptidiscs in einem einzigen chromatographischen Schritt kombiniert. Biotinylatierte Gerüste werden zur direkten Oberflächenbefestigung und Messung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen mittels Biolayer-Interferometrie eingesetzt.

PeptiQuick, ein Ein-Schritt-Einbindung von Membranproteinen in biotinylierte Peptidiscs für optimierte Proteinbindungstests

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aktinkometen auf den Oberflächen von Perlen mit kommerziell erhältlichen Proteinbestandteilen hergestellt werden können. Solche Systeme ahmen die hervorstehenden Strukturen in Zellen nach und können verwendet werden, um physiologische Mechanismen der Kraftproduktion auf vereinfachte Weise zu untersuchen.

Rekonstitution der Aktin-basierten Motilität mit kommerziell erhältlichen Proteinen

Diese Methode beschreibt einen lektinbasierten in vitro Sedimentationsassay zur Quantifizierung der Bindungsaffinität von Glucanphosphatase und Amylopektin. Dieser Co-Sedimentations-Assay ist zuverlässig für die Messung der Glucan-Phosphatase-Substratbindung und kann auf verschiedene solubilisierte Glucan-Substrate angewendet werden.

Concanavalin A-basierter Sedimentationsassay zur Messung der Substratbindung von Glucanphosphatasen

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Lernen Sie die Co-Sedimentationsmethode zur Messung der Proteinbindung an F-Aktin. Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Bindungsaffinität in Zellbiologie und Biochemie.

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

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