Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zu demonstrieren, mit der Neutrophile von einem Tropfen Vollblut getrennt und dann ein anschließender Chemotaxis-Assay mit einem einzigen mikrofluidischen Gerät durchgeführt werden kann. Diese Methode liefert unseren Code zur Durchführung eines neutrophilen Chemotaxis-Assays mit einem kleinen Volumen Vollblut. Und kann von Forschern leicht angewendet werden, um biologische Fragen im Zusammenhang mit der Migration von Immunzellen zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Integration und unser Chemotaxis-Assay auf einem einzigen mikrofluidischen Gerät. Dies ermöglicht die Montage und Analyse in 25 Minuten. Bereiten Sie zunächst den Master-Maldus vor, der im begleitenden Textprotokoll beschrieben ist.

Dann silanisieren Sie die Oberfläche der SU8-Form, um die Freisetzung von PDMS aus der Form zu erleichtern. Mischen Sie anschließend 40 Gramm PDMS-Base und vier Gramm des Trägers in einem Plastikbecherglas. Legen Sie die vorbereitete SU8-Urform in eine Petrischale und gießen Sie die angemischte PDMS-Lösung vorsichtig auf die Form.

Stellen Sie die Petrischale in einen Exsikkator und legen Sie ein Vakuum an, um die PDMS-Lösung 20 Minuten lang zu entgasen. Stellen Sie dann die Petrischale in einen Ofen und härten Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus. Nach dem Backen die PDMS-Platte vorsichtig aus der SU8-Form abschneiden und abziehen.

Schneiden Sie die PDMS-Platte ab, um sie in einzelne Geräte zu unterteilen. Schneiden Sie das PDMS-Gerät so ab, dass zwei Wände um die Zellenladeöffnung herum entstehen, an denen die Magnete gehalten werden. Stanzen Sie anschließend die Zellenladeöffnung mit einem Locher mit einem Durchmesser von drei Millimetern aus.

Wechseln Sie dann zu einer Sechs-Millimeter-Stanze und entfernen Sie die Chemikalieneinlaufbehälter im Abfallauslauf. Entfernen Sie mit einem Stück Klebeband den Staub auf der Oberfläche der PDMS-Platte. Legen Sie die saubere Platte in ein sauberes Glasobjekt in die Plasmamaschine.

Wenden Sie das Vakuum drei Minuten lang an. Schalten Sie dann die Plasmaleistung ein und stellen Sie den Pegel auf hoch. Stellen Sie das Luftventil vorsichtig ein und behandeln Sie das PDMS und den Objektträger drei Minuten lang mit Plasma.

Wenn Sie fertig sind, schalten Sie die Plasmaleistung aus und lassen Sie das Vakuum los. Nehmen Sie die PDMS-Platte vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Objektträger heraus, legen Sie die PDMS-Platte sofort auf den Objektträger, drücken Sie mit den Kanalstrukturen nach unten vorsichtig auf die PDMS-Platte, um sie mit dem Glas zu verbinden, und füllen Sie dann sofort den mikrofluidischen Kanal mit entionisiertem Wasser. Die PDMS wurden in der Regel auf das Glassubstrat gedrückt, um ein Einklemmen im Brunnen in den Barrierekanal zu vermeiden.

Entfernen Sie das deionisierte Wasser aus dem Gerät und geben Sie 100 Mikroliter Fribronektinlösung aus dem Auslass. Warten Sie drei Minuten, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit Fibronektinlösung gefüllt sind. Inkubieren Sie das Gerät dann eine Stunde lang in einer abgedeckten Petrischale bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie anschließend die Fibronektinlösung aus dem Gerät und fügen Sie 100 Mikroliter Migrationsmedium aus dem Auslass hinzu. Warten Sie erneut drei Minuten, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit dem Migrationsmedium gefüllt sind. Inkubieren Sie das Gerät eine weitere Stunde bei Raumtemperatur, bevor Sie das Gerät im Chemotaxis-Experiment verwenden.

Geben Sie zehn Mikroliter Vollblut in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dann zwei Mikroliter des Antikörpercocktails hinzu. Und zwei Mikroliter magnetische Partikel aus einem Neutrophilen-Isolationskit und mischen Sie das Röhrchen vorsichtig, um die mit Antikörpern markierten Zellen magnetisch zu markieren.

Die Etikettenmischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Befestigen Sie als Nächstes zwei kleine Magnetplatten an den beiden Seiten der Zellenladeöffnung des Geräts. Saugen Sie das Medium an allen Anschlüssen des Geräts an.

Pipettieren Sie dann langsam zwei Mikroliter des markierten Blutgemisches aus der Zellladeöffnung in das mikrofluidische Gerät. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf den temperaturgesteuerten Mikroskoptisch bei 37 Grad Celsius. Warten Sie einige Minuten, bis genügend Neutrophile am Andockbereich der Zellen gefangen sind.

Geben Sie als nächstes 100 Mikroliter der Chemolockstofflösung und 100 Mikroliter Migrationsmedium mit zwei Pipettieren in die dafür vorgesehenen Einlassreservoirs. Dadurch wird ein chemoanziehender Gradient durch kontinuierliches Laminar-Flow-basiertes chemisches Mischen erzeugt. Bei dem Chemolockstoff kann es sich um rekombinante Proteine wie FMLP oder eine klinische Probe wie den Überstand des Sputums von Patienten mit COPD handeln.

Sobald sich die Strömung stabilisiert hat, nehmen Sie Fluoreszenzbilder des FitZ-Dextron-Gradienten im Kanal auf. Inkubieren Sie das Gerät dann 15 Minuten lang auf dem temperaturgesteuerten Mikroskoptisch oder in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator. Nach der Inkubation wird der Gradientenkanal mit einem Zehnfachobjektiv abgebildet, um die endgültigen Positionen der Zelle für die Datenanalyse aufzuzeichnen.

Neutrophile werden aus einem Tropfen Vollblut direkt in der mikrofluidischen Vorrichtung unter Verwendung von Magnetpulver-Antikörpermarkierung und einem Paar Magnete negativ selektiert. Um die Reinheit der isolierten On-Chip-Neutrophilen zu bestätigen, wurde eine Giemsa-Färbung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen die typischen ringförmigen und lappenförmigen Kerne von Neutrophilen.

Nach dem Laden der Zellen richtet die Docking-Struktur die Zellen effektiv neben dem Gradientenkanal aus, bevor ein chemischer Gradient angewendet wird. Wenn man 15 Minuten lang einem chemischen Gradienten ausgesetzt wird, kommt es zu einer Chemotaxis. Und kann mit Hilfe von Bildgebung gemessen werden.

Diese Ergebnisse zeigen, dass nach 15 Minuten nur wenige Zellen durch den Barrierekanal in der mediumkontrollierten Probe krochen. Im Gegensatz dazu bewegten sich viele Neutrophile schnell durch den Barrierekanal und wanderten in Richtung eines 100 nanomolaren FMLP-Gradienten. Einmal kann diese Chemotaxis direkt von unserem in 25 Minuten mailen.

Dies bietet Forschern ein nützliches Werkzeug, um die Mechanismen der Ganzzellmigration zu untersuchen. Und ein Werkzeug für klinische Anwendungen.