Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen
23. Juni 2017
Dieser Artikel liefert die detaillierte Methode zur Durchführung eines schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Assays durch Integration der On-Chip-Neutrophilen-Isolation aus Vollblut und dem Chemotaxis-Test auf einem einzigen mikrofluidischen Chip.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zu demonstrieren, mit der Neutrophile von einem Tropfen Vollblut getrennt und dann ein anschließender Chemotaxis-Assay mit einem einzigen mikrofluidischen Gerät durchgeführt werden kann. Diese Methode liefert unseren Code zur Durchführung eines neutrophilen Chemotaxis-Assays mit einem kleinen Volumen Vollblut. Und kann von Forschern leicht angewendet werden, um biologische Fragen im Zusammenhang mit der Migration von Immunzellen zu beantworten.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Integration und unser Chemotaxis-Assay auf einem einzigen mikrofluidischen Gerät. Dies ermöglicht die Montage und Analyse in 25 Minuten. Bereiten Sie zunächst den Master-Maldus vor, der im begleitenden Textprotokoll beschrieben ist.
Dann silanisieren Sie die Oberfläche der SU8-Form, um die Freisetzung von PDMS aus der Form zu erleichtern. Mischen Sie anschließend 40 Gramm PDMS-Base und vier Gramm des Trägers in einem Plastikbecherglas. Legen Sie die vorbereitete SU8-Urform in eine Petrischale und gießen Sie die angemischte PDMS-Lösung vorsichtig auf die Form.
Stellen Sie die Petrischale in einen Exsikkator und legen Sie ein Vakuum an, um die PDMS-Lösung 20 Minuten lang zu entgasen. Stellen Sie dann die Petrischale in einen Ofen und härten Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus. Nach dem Backen die PDMS-Platte vorsichtig aus der SU8-Form abschneiden und abziehen.
Schneiden Sie die PDMS-Platte ab, um sie in einzelne Geräte zu unterteilen. Schneiden Sie das PDMS-Gerät so ab, dass zwei Wände um die Zellenladeöffnung herum entstehen, an denen die Magnete gehalten werden. Stanzen Sie anschließend die Zellenladeöffnung mit einem Locher mit einem Durchmesser von drei Millimetern aus.
Wechseln Sie dann zu einer Sechs-Millimeter-Stanze und entfernen Sie die Chemikalieneinlaufbehälter im Abfallauslauf. Entfernen Sie mit einem Stück Klebeband den Staub auf der Oberfläche der PDMS-Platte. Legen Sie die saubere Platte in ein sauberes Glasobjekt in die Plasmamaschine.
Wenden Sie das Vakuum drei Minuten lang an. Schalten Sie dann die Plasmaleistung ein und stellen Sie den Pegel auf hoch. Stellen Sie das Luftventil vorsichtig ein und behandeln Sie das PDMS und den Objektträger drei Minuten lang mit Plasma.
Wenn Sie fertig sind, schalten Sie die Plasmaleistung aus und lassen Sie das Vakuum los. Nehmen Sie die PDMS-Platte vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Objektträger heraus, legen Sie die PDMS-Platte sofort auf den Objektträger, drücken Sie mit den Kanalstrukturen nach unten vorsichtig auf die PDMS-Platte, um sie mit dem Glas zu verbinden, und füllen Sie dann sofort den mikrofluidischen Kanal mit entionisiertem Wasser. Die PDMS wurden in der Regel auf das Glassubstrat gedrückt, um ein Einklemmen im Brunnen in den Barrierekanal zu vermeiden.
Entfernen Sie das deionisierte Wasser aus dem Gerät und geben Sie 100 Mikroliter Fribronektinlösung aus dem Auslass. Warten Sie drei Minuten, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit Fibronektinlösung gefüllt sind. Inkubieren Sie das Gerät dann eine Stunde lang in einer abgedeckten Petrischale bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie anschließend die Fibronektinlösung aus dem Gerät und fügen Sie 100 Mikroliter Migrationsmedium aus dem Auslass hinzu. Warten Sie erneut drei Minuten, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit dem Migrationsmedium gefüllt sind. Inkubieren Sie das Gerät eine weitere Stunde bei Raumtemperatur, bevor Sie das Gerät im Chemotaxis-Experiment verwenden.
Geben Sie zehn Mikroliter Vollblut in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dann zwei Mikroliter des Antikörpercocktails hinzu. Und zwei Mikroliter magnetische Partikel aus einem Neutrophilen-Isolationskit und mischen Sie das Röhrchen vorsichtig, um die mit Antikörpern markierten Zellen magnetisch zu markieren.
Die Etikettenmischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Befestigen Sie als Nächstes zwei kleine Magnetplatten an den beiden Seiten der Zellenladeöffnung des Geräts. Saugen Sie das Medium an allen Anschlüssen des Geräts an.
Pipettieren Sie dann langsam zwei Mikroliter des markierten Blutgemisches aus der Zellladeöffnung in das mikrofluidische Gerät. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf den temperaturgesteuerten Mikroskoptisch bei 37 Grad Celsius. Warten Sie einige Minuten, bis genügend Neutrophile am Andockbereich der Zellen gefangen sind.
Geben Sie als nächstes 100 Mikroliter der Chemolockstofflösung und 100 Mikroliter Migrationsmedium mit zwei Pipettieren in die dafür vorgesehenen Einlassreservoirs. Dadurch wird ein chemoanziehender Gradient durch kontinuierliches Laminar-Flow-basiertes chemisches Mischen erzeugt. Bei dem Chemolockstoff kann es sich um rekombinante Proteine wie FMLP oder eine klinische Probe wie den Überstand des Sputums von Patienten mit COPD handeln.
Sobald sich die Strömung stabilisiert hat, nehmen Sie Fluoreszenzbilder des FitZ-Dextron-Gradienten im Kanal auf. Inkubieren Sie das Gerät dann 15 Minuten lang auf dem temperaturgesteuerten Mikroskoptisch oder in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator. Nach der Inkubation wird der Gradientenkanal mit einem Zehnfachobjektiv abgebildet, um die endgültigen Positionen der Zelle für die Datenanalyse aufzuzeichnen.
Neutrophile werden aus einem Tropfen Vollblut direkt in der mikrofluidischen Vorrichtung unter Verwendung von Magnetpulver-Antikörpermarkierung und einem Paar Magnete negativ selektiert. Um die Reinheit der isolierten On-Chip-Neutrophilen zu bestätigen, wurde eine Giemsa-Färbung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen die typischen ringförmigen und lappenförmigen Kerne von Neutrophilen.
Nach dem Laden der Zellen richtet die Docking-Struktur die Zellen effektiv neben dem Gradientenkanal aus, bevor ein chemischer Gradient angewendet wird. Wenn man 15 Minuten lang einem chemischen Gradienten ausgesetzt wird, kommt es zu einer Chemotaxis. Und kann mit Hilfe von Bildgebung gemessen werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass nach 15 Minuten nur wenige Zellen durch den Barrierekanal in der mediumkontrollierten Probe krochen. Im Gegensatz dazu bewegten sich viele Neutrophile schnell durch den Barrierekanal und wanderten in Richtung eines 100 nanomolaren FMLP-Gradienten. Einmal kann diese Chemotaxis direkt von unserem in 25 Minuten mailen.
Dies bietet Forschern ein nützliches Werkzeug, um die Mechanismen der Ganzzellmigration zu untersuchen. Und ein Werkzeug für klinische Anwendungen.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut und zur Durchführung eines Chemotaxis-Assays unter Verwendung eines einzelnen mikrofluidischen Geräts vorgestellt. Die Integration dieser Prozesse ermöglicht eine schnelle Analyse innerhalb von nur 25 Minuten und macht sie für Forscher, die die Migration von Immunzellen untersuchen, leicht zugänglich.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Mikrofluidik
- Zellbiologie
Hintergrund
- Neutrophile spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort.
- Das Verständnis der Neutrophilen-Migration ist wichtig für die Untersuchung verschiedener Krankheiten.
- Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Neutrophilen und Chemotaxis-Assays können zeitaufwendig sein.
- Diese Methode zielt darauf ab, den Prozess unter Verwendung mikrofluidischer Technologie zu vereinfachen.
Zweck der Studie
- Eine schnelle Methode zur Isolierung von Neutrophilen und Durchführung von Chemotaxis-Tests bereitstellen.
- Die Erforschung des Verhaltens von Immunzellen als Reaktion auf Stimuli erleichtern.
- Die Durchführbarkeit des Einsatzes eines einzelnen Geräts für beide Prozesse demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut unter Verwendung eines mikrofluidischen Chips.
- Durchführung eines Chemotaxis-Assays an demselben mikrofluidischen Gerät.
- Analyse der Neutrophilenmigration als Reaktion auf chemotaktische Signale.
- Verwendung eines geringen Blutvolumens für den Assay.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht die erfolgreiche Isolierung von Neutrophilen und Durchführung von Chemotaxis-Assays.
- Ergebnisse können innerhalb von 25 Minuten erhalten werden.
- Die Technik ist reproduzierbar und effizient für Forschungsanwendungen.
- Die Integration der Prozesse verbessert den gesamten Arbeitsablauf für Forscher.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen schnellen und effizienten Ansatz, um die Migration von Neutrophilen zu untersuchen.
- Sie kann leicht von Forschern auf diesem Gebiet übernommen werden.
- Die Verwendung eines einzelnen mikrofluidischen Geräts vereinfacht den experimentellen Aufbau.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese vollständig chipbasierte Methode ermöglicht eine schnelle Analyse der Chemotaxis von Neutrophilen direkt aus Vollblut und löst damit ein zentrales Engpassproblem in der Immunologie und Entzündungsforschung. Durch die Integration von Zellisolierung und Funktionsanalyse in einem einzigen mikrofluidischen Gerät innerhalb von 25 Minuten unterstützt sie die Hochdurchsatz-Screening von immunmodulierenden Substanzen und patientenstammenden Proben. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung für neutrophilenvermittelte Erkrankungen wie COPD, Sepsis und autoimmune Störungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Untersuchung von Neutrophilen-Migrationswegen als Reaktion auf Chemoattraktanten wie fMLP oder klinische Stimuli.
- Operativer Wert: Verwendet minimalinvasive Probenmengen (10 µL Vollblut), die mit präklinischen und frühen klinischen Entnahmen kompatibel sind.
- Prädiktiver Wert: Liefert quantitative Messgrößen der chemotaktischen Effizienz, um Zielstrukturen im Zusammenhang mit Leukozyten-Wanderung und Entzündung risikominimiert zu bewerten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt stabile, laminare Chemoattraktant-Gradienten für reproduzierbare Dosis-Wirkungs-Tests von Verbindungen.
- Skalierbarkeit: Das integrierte Design reduziert den manuellen Arbeitsaufwand und den Reagenzienverbrauch und ermöglicht die Anpassung an automatisierte Bildgebungssysteme.
- Standardisierung der Ausgabe: Die fluoreszenzbasierte Bildgebung der Neutrophilen-Migration ermöglicht objektive, quantifizierbare Endpunkte für die Auswahl von Hits.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Nachgewiesene Anwendbarkeit mit Überstand von Sputum von Patienten mit COPD, wodurch die Assayergebnisse mit pathophysiologischen Bedingungen verknüpft werden.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die Untersuchung von Therapeutika unter Verwendung von chemotaktischen Flüssigkeiten aus Patientenproben, um die Zielstrukturen in der Entzündungsreaktion zu bewerten.
- Mechanistische Entlastung: Klärt, ob in Frage kommende Substanzen die Richtigkeit, Geschwindigkeit oder Anreicherung von Neutrophilen in Gradientenumgebungen beeinflussen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und ermöglicht einen schnellen Übergang von der Target-Hypothese zur funktionalen Validierung in Assays zur Immunzellmigration.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von GPCR-vermittelten Chemotaxiewegen (z. B. FPR1) unter Verwendung definierter oder patientenabgeleiteter Stimuli.
- Screening: Liefert quantitative, bildbasierte Migrationsparameter, die für das Screening von Substanzbibliotheken in auf Entzündungen ausgerichteten Programmen geeignet sind.
- Analytik: Stellt daten auf Einzelzellauflösung zu Migrationsgeschwindigkeit, Richtigkeit und Akkumulation für die mechanistische Profilierung bereit.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Verwendung klinischer Proben (z. B. Sputum, Plasma) zur Beurteilung der chemotaktischen Aktivität in krankheitsrelevanten Kontexten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das mikrofluidische Chippdesign erlaubt die Wiederverwendung über mehrere Immunologieziele hinweg mit minimalem Neuaufwand.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten bei neutrophilen-vermittelten Wegen durch direktes, Echtzeit-Migrations-Tracking.
- Operationaler Wert: Macht eine zeitaufwändige Zellreinigung außerhalb des Systems überflüssig und reduziert so Probenverlust, Variabilität und manuelle Arbeitszeit.
- Strategischer Wert: Beschleunigt Go/No-Go-Entscheidungen in Entzündungsprogrammen, indem funktionelle Daten innerhalb eines einzigen Arbeitstages bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf funktioneller Validierung in primären humanen Neutrophilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung mikrofluidischer Vorrichtungen, der Plasma-Bindung sowie der Fluoreszenzmikroskopie.
- Hängt von dem Zugang zu temperaturgeregelten Mikroskopiemethoden und reagenzien ab, die mit Chemotaxis kompatibel sind (z. B. Fibronectin, Migrationsmedium).
- Setzt eine Standardisierung der Gradientenerzeugung und der Bildgebungsprotokolle über verschiedene Anwender und Standorte hinweg voraus.
- Die Anpassung an andere Immunzellen könnte eine Optimierung der magnetischen Markierung und der Oberflächenchemie der Kanäle erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber der Qualität von Blutproben und das potenzielle Verklumpen in Mikrokanälen, wenn die Proben nicht umgehend verarbeitet werden.
