Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Muskelgewebe einzufrieren, indem es direkt in flüssigen Stickstoff getaucht wird, während Gefrierartefakte eliminiert werden. Maozhang He, ein Student aus meinem Labor, wird dieses Verfahren mit Yizhong Huang demonstrieren. Beschriften Sie zunächst die Probenidentität auf jedem Kryofläschchen.

Organisieren Sie dann die folgende Ausrüstung: einen Tank mit flüssigem Stickstoff, eine Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz, Gefrierhandschuhe, eine 10-Zentimeter-Pinzette und eine 25-Zentimeter-Pinzette. Organisieren Sie außerdem einen Styroporkühler, eine Plastikfolie, ein Skalpell und A4-PVC-Bindungsabdeckungen. Um Muskelproben vorzubereiten, füllen Sie zunächst den Kühler mit flüssigem Stickstoff.

Legen Sie die Probe innerhalb von fünf Minuten nach Entnahme einer Probe vorsichtig auf ein Stück A4-PVC-Bindeabdeckung und beobachten Sie die Richtung der Muskelfasern. Als nächstes machst du mit einem Skalpell zwei parallele Schnitte durch die Probe in Richtung der Muskelfasern, die etwa 3 Zentimeter lang sind und 0,6 Zentimeter voneinander entfernt sind. Schneiden Sie den eingeschnittenen Muskel in ein Rechteck von etwa 0,6 Zentimetern Breite, 0,6 Zentimeter Höhe und 1,5 Zentimeter Länge.

Dann legen Sie die Probe mit einer zehn Zentimeter langen Pinzette vorsichtig auf ein Stück Plastikfolie, wobei die Längsachse des eingeschnittenen Muskels parallel zur langen Kante der Folie verläuft. Platzieren Sie das Muskelgewebe in der unteren Mitte eines beschrifteten Kryofläschchens, genau zwischen den Einlasslöchern, und verschließen Sie das Fläschchen fest. Um die Gewebeprobe einzufrieren, tauchen Sie das gesamte Kryofläschchen mit einer 25-Zentimeter-Pinzette schnell in flüssigen Stickstoff in den vorgekühlten Styroporkühler und warten Sie, bis der flüssige Stickstoff nicht mehr kocht.

Der flüssige Stickstoff sollte ausreichend sein, um das gesamte Kryofläschchen einzutauchen, und das kryogene Fläschchen sollte vollständig unter dem Flüssigkeitsspiegel liegen. Füllen Sie die Muskelproben zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstoff-Lagertank oder einen 80-Grad-Gefrierschrank um. Es ist wichtig, einen versehentlichen Kontakt zwischen den gefrorenen Muskeln und den Behältern oder Instrumenten mit Raumtemperatur zu vermeiden.

Um Objektträger vorzubereiten, kühlen Sie einen Kryostaten auf 20 Grad Celsius bis 22 Grad Celsius vor. Entfernen und entsorgen Sie die alte Mikroton-Klinge und wischen Sie den Messerhalter und die Anti-Roll-Platte im Kryostaten ab. Setzen Sie dann eine neue Mikrotonklinge in den Kryostaten ein und stellen Sie die Schnittstärke auf acht Mikrometer ein.

Nehmen Sie das Kryofläschchen mit der Muskelprobe aus dem Flüssigstickstoff-Lagertank oder dem 80-Grad-Gefrierschrank und legen Sie es in den flüssigen Stickstoff oder auf Trockeneis. Übertragen Sie dann die Probe in den Kryostaten und warten Sie 30 Minuten, bis sich die Probe mit der Temperatur des Kryostaten ausgeglichen hat. Nachdem Sie die Probe mit OCT eingebettet haben, montieren Sie die Probe in den Probenhalter.

Schneiden Sie dann Abschnitte mit acht Mikrometern ab. Montieren Sie die Abschnitte in der Mitte eines Mikroobjektträgers mit Raumtemperatur. Legen Sie die Folie sofort in eine Schiebebox.

Legen Sie dann die Schachtel mit den Dias in einen 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank. Lassen Sie den Objektträger nicht bei Raumtemperatur trocknen. Wie hier zu sehen, bildeten sich Eiskristalle, als eine Probe des Longissimus dorsi-Muskels von Schweinen direkt in einen 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank gelegt wurde, und verursachten einen bekannten Schweizer Käseeffekt auf die Kryosektion des Muskels.

Eiskristalle bildeten sich auch, wenn das Muskelgewebe direkt in flüssigen Stickstoff getaucht wurde. Bei einer anderen Methode bildeten sich viele nadelförmige Eiskristalle im zytoplasmatischen Kompartiment von Myofasern, wenn das Gewebe in der richtigen Ausrichtung in OCT-Einbettmedium getaucht und dann schnell in einer Aufschlämmung von Isopentan eingefroren wurde. Durch das Einfrieren des Gewebes in das Mehrloch-Kryovial wird eine hervorragende Probenintegrität erreicht, mit einem deutlich sichtbaren zytoplasmatischen Kompartiment und der engen Anlagerung von Myofasern an das umgebende Gewebe.

Mit dieser Methode wurde die ATPase-Aktivität in schnell kontrahierenden und langsam kontrahierenden Muskelfasern analysiert. Bei Angabe der gleichen Zeiten erscheinen schnell kontrahierende Fasern mit zwei Grad hell und langsam kontrahierende Fasern schwarz. Bei einer hier gezeigten Standard-Gefriermethode wurde das Muskelgewebe ohne direkten Kontakt mit dem OCT-Einbettmedium in eine Aufschlämmung aus Isopentan getaucht, jedoch ist es schwierig, einen festen flüssigen Aufschlämmungszustand von Isopentan länger als eine Stunde aufrechtzuerhalten, und Isopentan ist nicht immer verfügbar.