Die laparoskopische Technik zur Serien Sammlung von Leber und mesenterischen Lymphknoten in Makaken

Das übergeordnete Ziel dieses minimal-invasiven laparoskopischen Verfahrens ist es, die Auswirkungen der mikrobiellen Translokation aus dem Magen-Darm-Trakt durch die Entnahme von mesenterialen Lymphknoten und Leberbiopsien zu mehreren Zeitpunkten zu verbessern und gleichzeitig den Tierschutz zu verbessern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der HIV-Biologie über die immunologischen Folgen von Infektionen und mikrobieller Translokation auf die mesenterialen Lymphknoten und die Leber sowie die Pathologie dieser Gewebe zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Probenahme zu mehreren Zeitpunkten in einer Studie mit minimalen Auswirkungen auf das Tier oder die zu bewertenden Parameter ermöglicht.

Diese Methode kann Proben liefern, die für unser Verständnis von HIV entscheidend sind. Es kann auch auf andere Modelle angewendet werden, bei denen gastrointestinale Entzündungen und mikrobielle Translokation wichtig sind. Der Eingriff wird von Dr. Jeremy Smedley und Dr. Cassie Moats, Tierärzten am Washington National Primate Research Center, durchgeführt.

Nachdem Sie einen Makaken für die Operation vorbereitet haben, wie im Textprotokoll angegeben, decken Sie ihn mit einem sterilen Fenstertuch ab. Decken Sie anschließend die Digitalkamera mit einem sterilen Kameratuch fest ab und stecken Sie sie in den Tower. Verbinden Sie das starre Zielfernrohr mit dem Kamerakopf.

Befestigen Sie dann ein steriles Lichtkabel an dem starren Zielfernrohr und verbinden Sie es mit der Lichtquelle. Montieren Sie abschließend einen sterilen Insufflationsschlauch auf dem Insufflator. Um mit der Laparoskopie zu beginnen, positionieren Sie eine 15-Skalpell-Klinge etwa ein bis zwei Zentimeter links vom Nabel und machen Sie einen etwa 5 Millimeter großen Stichschnitt in der Haut, der die Bauchmuskulatur erreicht.

Hebe mit der nicht-dominanten Hand die Bauchdecke auf der Schädelseite des Schnitts an. Führen Sie dann mit der anderen Hand die Spitze einer Varusnadel durch den Schnitt ein, die zum Kopf des Tieres hin abgewinkelt ist. Halten Sie die Varusnadel am Schaft fest und schieben Sie sie fest, bis sie durch die Bauchdecke klickt und der Widerstand gegen die Nadel in der Bauchhöhle abnimmt.

Befestigen Sie dann den Schlauch des CO2-Insufflators an der Nadel und öffnen Sie den Absperrhahn, um das Gas in die Bauchhöhle abzugeben. Erzeugen Sie ein Pneumoperitoneum, indem Sie einen Druck von bis zu 10 bis 12 Millimetern Quecksilber erreichen. Jetzt, da der Bauch vollständig insuffliert ist, positionieren Sie die 15-Skalpell-Klinge über dem linken Schädelbauch, etwa zwei bis vier Zentimeter kaudal bis zur letzten Rippe, und machen Sie einen etwa fünf bis sieben Millimeter großen Hautschnitt.

Führen Sie dann eine fünf Millimeter lange Trokarkanülenbaugruppe durch den Schnitt ein. Führen Sie die Baugruppe in einer Tiefe von ein bis zwei Zentimetern ein und richten Sie sie in einem Winkel von etwa 45 bis 60 Grad kaudomedial aus. Schieben Sie dann die Kanüle mit einer Drehbewegung nach vorne und erreichen Sie eine Tiefe von 1,5 bis drei Zentimetern, um die Kanüle in den Bauch zu schrauben.

Entfernen Sie anschließend den Trokar. Trennen Sie den Insufflatorschlauch von der Varusnadel und schalten Sie anschließend den Absperrhahn aus. Verbinden Sie den Schlauch mit der Kanüle und öffnen Sie den Absperrhahn, um das Pneumoperitoneum zu erhalten.

Sobald Sie überprüft haben, dass der Druck erfolgreich aufrechterhalten wird, entfernen Sie die Varusnadel. Führen Sie anschließend durch die Kanüle das starre Zielfernrohr in die Bauchhöhle ein. Vertiefen Sie unter Kontrolle der Kamera den nach der Entfernung der Varusnadel verbleibenden Hautschnitt und durchtrennen Sie die Bauchmuskulatur und das Bauchfell.

Positionieren Sie das Tier schließlich mit den Füßen in einem Winkel von etwa 15 bis 30 Grad über dem Kopf. Um eine Biopsie aus dem mesenterialen Lymphknoten zu entnehmen, führen Sie eine feste Sonde durch den vorbereiteten Schnitt in die Bauchhöhle ein. Positionieren Sie die Sonde zwischen dem Omentum und dem Darm und legen Sie mit einer sanften, schwungartigen Bewegung den Darm aus dem Omentum frei, um das darunter verborgene Mesenterium sichtbar zu machen.

Bewegen Sie die Sonde weiter von kaudaler in kraniale Richtung, um das Omentum vom Operationsfeld weg zu drücken. Bewegen Sie dann mit der Sonde den absteigenden Dickdarm in Richtung Bauchdecke. Untersuchen Sie das Mesenterium mit der Sonde, um mesenteriale Lymphknoten entlang des Dickdarms und der Mesenterialgefäße zu lokalisieren.

Sobald der Lymphknoten identifiziert ist, ersetzen Sie die Sonde in der Bauchhöhle durch eine Maryland-Zange mit Ratsche und greifen Sie nach dem Mesenterium neben dem Knoten. Ziehen Sie das Mesenterium in Richtung Inzision und entfernen Sie das Zielfernrohr von der Kanüle. Schalten Sie dann den Insufflator aus und lassen Sie den Kanülenhahn offen, um Gas aus dem Abdomen abzulassen, was die Exteriorisation des Mesenteriums erleichtert.

Ziehen Sie dann das Mesenterium durch den Schnitt. Fassen Sie das äußere Mesenterium mit einer Pinzette, um den Zugang durch den Schnitt zu gewährleisten. Palpieren oder beobachten Sie das Mesenterium, um den Lymphknoten zu identifizieren, der als festerer Knoten oder grauer Bereich erscheinen sollte.

Als nächstes machen Sie mit gekrümmten Hämostaten eine drei bis fünf Millimeter große Öffnung in das Mesenterium neben dem Knoten und zerlegen Sie stumpf alle Anhaftungen am Gewebe. Bei Bedarf wird das Gefäßsystem mit einer nicht resorbierbaren monofilen 4-0-Naht ligiert und der Lymphknoten mit dem Skalpell präpariert. Legen Sie dann die Biopsie in RPMI 1640 Medium auf Eis.

Zum Schluss lösen Sie das Mesenterium und insufflieren den Bauch erneut, um das Gewebe in die Bauchhöhle zurückziehen zu können. Bringen Sie die Tabelle wieder in eine horizontale Position. Um eine Leberbiopsie zu entnehmen, führen Sie eine Gewindekanüle durch den Schnitt für die Lymphknotenentnahme in die Bauchhöhle ein.

Schieben Sie dann mit der Kanüle das starre Zielfernrohr in Richtung der schädelförmigen Bauchhöhle ein, um die Leber sichtbar zu machen. Führen Sie unter Kontrolle der Kamera eine Biopsiezange durch die Kanüle ein, mit der zuvor die Bauchhöhle insuffliert wurde. Positionieren Sie die Pinzette unterhalb des vorgesehenen Leberlappenrandes, so dass ihr Kiefer dem Gewebe zugewandt ist, und öffnen Sie die Pinzette, so dass der Rand in den Kiefer fallen kann.

Nachdem Sie ihre Position eingestellt haben, schließen Sie die Pinzette und halten Sie den Druck für etwa 20 bis 30 Sekunden aufrecht. Entnehmen Sie dann die Probe, indem Sie die Pinzette vorsichtig durch die Kanüle ziehen. Legen Sie die Biopsie in RPMI-Medium auf Eis.

Stellen Sie abschließend sicher, dass an der Stelle der Biopsie keine Blutung beobachtet wird, und schließen Sie die Schnitte. Hier werden zelluläre Ausbeuten aus mesenterialen Lymphknoten- und Leberbiopsien vorgestellt, die von zwei gesunden weiblichen Mecaques zu zwei verschiedenen Zeitpunkten entnommen wurden. Erwartungsgemäß ergaben Lymphknotenbiopsien im Vergleich zu den Leberbiopsien eine signifikant höhere Anzahl der isolierten Zellen.

Unabhängig vom Ausgangsgewebe waren über 85 % der isolierten Zellen lebensfähig. Anschließend wurden die isolierten Zellproben auf CD45+Leukozyten und CD45+CD3+Lymphozytenpopulationen analysiert. Mesenteriale Lymphknoten wiesen im Vergleich zu Leberzellen eine höhere Häufigkeit von CD45+Leukozyten und CD3+Lymphozyten auf.

Eine detaillierte Charakterisierung der isolierten Populationen zeigte, dass mesenteriale Lymphknoten signifikant höhere Anteile an CD3+T-Zellen und CD4+T-Zellen sowie eine erhöhte Anzahl von CD8+T-Zellen enthielten. Umgekehrt war die Leber signifikant mit CD14+-Leukozyten angereichert. Beide Organe wiesen ähnliche Häufigkeiten von CD20+B-Zellen auf.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 bis 40 Minuten durchgeführt werden. Die Tiere werden in der Regel innerhalb weniger Stunden von der Narkose erholt, aktiv und fressend, und die Schnitte sind so klein, dass sie von der Käfigseite schwer zu sehen sein können. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, die Tiere in einem Körperzustand zu halten, der den Erfolg erleichtert.

Erhebliches Mesenterialfett kann ein schwieriges Hindernis sein, da es die Knoten verdeckt und die Frittierbarkeit und Blutung erhöht. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Phlebotomie, periphere Lymphknotenbiopsie, Endoskopie des oberen und unteren GI und rektale Biopsie durchgeführt werden, um systemische und mukosale Immunantworten, den Status von Mikroben und Epithelbarrieren sowie die Viruslast zu beurteilen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in unserem Labor, mikrobielle Populationen bei Entzündungen im Längsschnitt in Geweben von Makaken zu untersuchen, die zuvor nur durch Autopsie verfügbar waren.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von HIV, da die mikrobielle Translokation eine der Hauptursachen für Entzündungen ist, die die HIV-Pathogenese vorantreiben. Die serielle Evaluierung kann potenzielle Ziele liefern und die Bewertung therapeutischer Interventionen ermöglichen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit virusinfizierten Makaken äußerst gefährlich sein kann.

Vorsichtsmaßnahmen wie eine angemessene Schulung für biologische Gefahren, einschließlich Makaken-Herpesvirus 1, geeignete persönliche Schutzausrüstung, Beiß- und Kratzsets und eine angemessene medizinische Nachsorge sollten verfügbar sein.