Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Expression und Produktion von Genen bzw. Proteinmarkern der neuronalen Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus zu analysieren. Diese Methode kann dazu beitragen, den Mechanismus zu bestimmen, der für die Hemmung der neuronalen Differenzierung durch das Rohalter von DPAs verantwortlich ist, und zu besseren Protokollen zur Differenzierung von Stammzellen in Neuronen zu therapeutischen Zwecken führen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verfolgung des Prozesses der neuronalen Differenzierung auf Emerin- und Proteinebene erleichtert, auch durch optische Mikroskopie.

Das Verfahren wird von Dr. Junning Yang, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter in meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie mit der Bildung des Embryoidkörpers, indem Sie embryonale Stammzellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA für zwei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ernten. Geben Sie frisches Iscove's Modified Dulbecco's Medium oder IMDM mit 15 % FBS in die ablösenden Zellen und geben Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Bei 160 x G fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine Suspension von fünf x 10 bis fünf Zellen pro Milliliter in IMDM mit 0,5 mikromolare Retinsäure vor. Verwenden Sie anschließend eine Achtkanalpipette und 200-Mikroliter-Spitzen, um 120-Mikroliter-Tropfen pro 100-Millimeter-Petrischale zu plattieren.

Drehen Sie die Schale um und füllen Sie den umgedrehten Deckel mit PBS, um ein Austrocknen der hängenden Tropfen zu verhindern. Kultur bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, für drei bis vier Tage. Verwenden Sie 200-Mikroliter-Pipettenspitzen, um hängende Tropfen-Embryoidkörper zu ernten, die drei Tage lang gezüchtet wurden.

Berühren Sie einen Embryoidkörper mit einer Pipettenspitze und übertragen Sie ihn auf einen mit Fasernektin beschichteten Deckglas in einer 24-Well-Platte. Wechseln Sie das Medium auf den Kulturen alle zwei bis drei Tage. Wenn Sie das Medium wechseln, sammeln Sie bei Bedarf das verwendete Medium für die Analyse der Proteinsekretion.

Um sezernierte Proteine im Medium nachzuweisen, werden 500 Mikroliter des Embryoidkörpermediums in 10-Kilodalton-Zentrifugalfilter überführt und bei 20.000 x G bei vier Grad Celsius gedreht. Untersuchen Sie das in den Zentrifugalfiltern verbleibende Medium alle 15 bis 20 Minuten, um eine übermäßige Anreicherung zu vermeiden. Stoppen Sie die Zentrifugation, wenn das Volumen des verbleibenden Mediums auf 25 Mikroliter gesunken ist.

Drehen Sie den Filter um und drehen Sie ihn bei 160 x G bei vier Grad Celsius, dann sammeln Sie das restliche konzentrierte Medium, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Für eine 3D-Kultur ernten Sie wie bisher Embryoidkörper, die vier Tage lang als hängende Tropfen mit 200-Mikroliter-Pipettenspitzen gezüchtet wurden. Übertragen Sie 30 Embryoidkörper in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, bereiten Sie dann die Kollagengellösung vor, indem Sie die entsprechenden Volumina der Kollagenlösung und das 5-fache DMEM verdünnen, die Neutralisationslösung hinzufügen und sofort gut mischen.

Lege das Kollagen-Gel auf Eis. Als nächstes pipettieren Sie ein geeignetes Volumen gekühlter Kollagenlösung in das Röhrchen mit den Embryoidkörpern und pipettieren Sie dann die Embryoidkörpersuspension vorsichtig in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte, ohne Blasen zu erzeugen. Übertragen Sie die Platte sofort für 60 Minuten auf 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, um die Kollagenpolymerisation einzuleiten.

Nach den 60 Minuten überlagern Sie die Platte mit den Embryoidkörpern mit IMDM. Für die Dissoziation des Embryoidkörpers sammeln Sie erneut die vier Tage hängenden Tropfen-Embryoidkörper mit 200-Mikroliter-Pipettenspitzen. Übertragen Sie sie dieses Mal für weitere vier Tage in eine nicht klebende bakteriologische Petrischale, die IMDM mit 15 % FBS und Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid enthält.

Überprüfen Sie die Embryoidkörper zweimal täglich, um sicherzustellen, dass sie sich nicht am Boden festsetzen. Schütteln Sie die Schale vorsichtig, um eine Anhaftung des Embryoidkörpers zu verhindern. Nach vier Tagen werden die Embryoidkörper in ein Zentrifugenröhrchen überführt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 185 x G zentrifugiert.

Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu entfernen. Das Volumen der Palette sollte 100 Mikroliter nicht überschreiten. Als nächstes pipettieren Sie einen Milliliter 0,25 % Kollagenase vom Typ I, ergänzt mit 20 % FBS in PBS, in das Röhrchen der Embryoidkörper.

Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig alle 20 Minuten mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal vorsichtig mit PBS.

Wenn Zellaggregate vorhanden sind, verwenden Sie ein Zellsieb mit einem 100-Mikron-Netz, um sie zu entfernen. Plattieren Sie die Zellen auf gelatinebeschichteten Deckgläsern in IMDM und inkubieren Sie sie dann bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie die 2D- oder dissoziierten 3D-Embryoidkörper mit PBS.

Dann mit vier Prozent Paraformaldehyd und PBS 30 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Nachdem Sie die fixierten Zellen dreimal mit PBS gewaschen haben, um schwimmende Zelltrümmer zu entfernen, fügen Sie 1%Triton X-100 in PBS hinzu, um die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zu permeabilisieren. Nach dem Waschen wie zuvor die letzte Wäsche herausnehmen und mit 5%BSA in PBS 30 Minuten blockieren.

Gegen Ende der Inkubation ist eine primäre Antikörperverdünnung in 1 % BSA in PBS vorzubereiten, die mit 0,03 % Triton X-100 ergänzt wird. Wenn die 30 Minuten abgelaufen sind, ersetzen Sie die Blockierungslösung durch die primäre Antikörperlösung. Drei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Nach dem Waschen einen Sekundärantikörper in PBS auftragen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Zum Schluss können Sie Deckgläser mit einem Anti-Fade-Medium für die optische Mikroskopie auf Objektträger montieren. Dieses Bild zeigt das Schlüpfen von Sprossen aus einem Embryoidkörper, der aus ESCs erzeugt wurde und positiv für zwei Kopien des Syx-Gens ist, das für einen Guaninaustauschfaktor kodiert, der die GTPase RhoA aktiviert.

Das Bild wurde nach sechs Tagen in 3D-Kultur aufgenommen. Dieser embryoide Körper, der aus Syx KnockOut ESCs gebildet wird, zeigt nach der gleichen Zeit in Kultur eine erhöhte Keimung. Hier zeigen Phasenbilder von 2D-Embryoidenkörperkanten, dass sich Zellen aus Syx-KnockOuts schneller ausbreiteten als aus Syx-Wildtyp.

Diese Immunfluoreszenzbilder zeigen, dass der neuronale Differenzierungsmarker Nestin, der in Rot dargestellt ist, in Zellen, die sich aus sechstägigen 2D6-KnockOut-Embryoidkörpern ausbreiten, häufiger vorkommt als in ihren Syx-Wildtyp-Gegenstücken. Hier zeigen Immunfluoreszenzbilder, dass die neuralen Differenzierungsmarker Nestin und beta III Tubulin in Zellen, die von 13-Tage-3D6-KnockOut-Embryoidkörpern dissoziiert wurden, häufiger vorkamen als von ihren Syx-Wildtyp-Gegenstücken. Dies ist aufgrund der Dauer des Wachstums und der Differenzierung des Embryoidkörpers ein zeitaufwändiges Verfahren.

Es dauert nicht nur mindestens acht Tage, sondern in einigen Fällen erfolgt eine Differenzierung von bis zu 24 Tagen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Lebensfähigkeit des Embryoidkörperdurchmessers zu begrenzen, um ähnliche Differenzierungsraten entlang der Embryoidkörper zu gewährleisten.